杆状病毒表达系统00000001

昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白

●杆状病毒表达系统介绍

●杆状病毒蛋白表达系统的优势

●杆状病毒表达载体系统（BEVS）

●杆状病毒表达宿主细胞

●表达优化条件

●翻译后修饰对蛋白表达的影响

●高通量表达

●总结

杆状病毒介绍

1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状

DNA病毒。

2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：

一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另

一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。

3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。

4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。

5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—

phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear

polyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。

杆状病毒生命周期

●早期（0‐6h PI）

•核衣壳迁移到细胞核

•病毒DNA释放

•开始早期基因表达

●晚期（6‐24h PI）

•更多DNA复制

•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质

•的过程中得到囊膜蛋白

•产生新的出芽病毒

●极晚期

Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少

•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs

•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形

成包含体病毒。

多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。

优点

缺点

大肠杆菌

成本低、表达量高。

缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。

酵母表达量高，可以翻译后

加工，易实现高密度发酵。

蛋白质量不理想。

哺乳动物细胞

重组蛋白生物活性高。

成本高；表达水平低，技术和环境要求高。

昆虫细胞

重组蛋白生物学活性高；

表达水平高；能同时表达多个基因。

重组蛋白糖基化程度低。

RTS

快速，无需克隆，表达量高。成本高。

酵母

哺乳动物细胞昆虫细胞RTS体外表达系统大肠杆菌

昆虫杆状病毒与其他蛋白表达系统比较

在辉瑞制药公司，杆状病毒是其第二大蛋白表达系统。

杆状病毒系统表达重组蛋白的优势

表达量高（可达细胞总蛋白的50%），大多数为有生物功能的可溶性蛋白；

可进行翻译后修饰；

可进行磷酸化修饰；

可形成正确折叠的二硫键；

可进行N‐和O‐型糖基化修饰；

可去除信号肽；

易进行规模化生产，昆虫细胞比哺乳动物细胞操作简单；

相对于其他真核表达系统成本较低；

杆状病毒表达系统（BEVS）的发展

BEVS系统由Dr. Max D. Summers, and Dr. Gale Smith在1982年研究提出； BEVS系统基于目的基因替代病毒基因组上一个极晚期，非必须的病毒蛋白（多角体蛋白）；

大多数的转移载体使用早期启动子（le1）或极晚期启动子（p10，pPolyh）；

AcMNPV DNA的改造和线性化是BEVS历史性改造；

对于分泌性蛋白，HBM 和gp67是最常用的分泌信号肽；

BEVS允许在昆虫细胞（Sf9, Sf21, Hi5）中快速克隆和表达重组蛋白。

杆状病毒表达系统（BEVS）Bac‐to‐Bac(Invitrogen™)

杆状病毒表达系统（BEVS）

BacPAK6/BaculoGold (BD Biosciences/Clonetech)

◆E.coli lacZ基因插入到多角体位点

◆引入多个Bsu361限制性酶切位点

◆Bsu361限制性酶切位点的引入使得病毒

◆DNA(ΔORF1629)在昆虫细胞中不能复制

◆Bsu361不能100%切割病毒DNA使之线性化

◆重组病毒仍需要进行空斑筛选

杆状病毒表达系统（BEVS）

BaculoDirect™(Invitrogen™)

◆利用Gateway®技术直接将目的基因转移到病

毒DNA上

◆目的基因整合到病毒DNA的polh位点

◆利用整合酶和特异位点（att）完成整合

◆利用更昔洛韦（核苷类似物）筛选重组病毒

◆更昔洛韦被HSV1 tk磷酸化后阻止野生型病毒

基因组的复制

◆需要大量病毒扩繁

◆每次只能生产一种重组基因

杆状病毒表达系统（BEVS）

flashBAC™/BacMagic(EMD/OET/Nextgen)

◆用人工细菌染色体（BAC）改造polh位点，使

得病毒基因组可在大肠杆菌中复制

◆ORF1629的删除阻止非重组的父代病毒不能在

昆虫细胞中复制

◆chiA基因的删除提高了分泌通路的效率

◆适合自动化生产

◆不需要空斑纯化

不同BEVS系统比较

flash BAC系统是一个全新的生产重组杆状病毒的技术平台，flashBAC专门设计，免去了从亲代病毒中筛选重组病毒的步骤，不需要进行空斑实验，一步法杆状病毒蛋白表达系统，目前最领先的杆状病毒表达系统。