杆状病毒表达系统00000001
杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白
2：基本原理
❖ 1：目的基因插入转移载体。 ❖ 2：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯
化获得重组病毒。
❖ 3：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。
❖ 4：纯化目的蛋白
杆状病毒表达载体的构建
❖ 转移载体 通常由三部分组成： ❖ E. coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保
弃滤液。重复洗涤一次。 ❖ 9 室温或风干DNA，加入50-80ulEluent溶液，冰上溶解
10min ，4℃保存。
Sf9细胞转染
❖ 1．37℃预热Sf900TM- III SFM培养基； ❖ 2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a．溶解5μl纯化的杆状病毒重组质粒于100μl Sf900TMIII SFM培养基；
b．转染试剂充分摇匀后取8μl加入100μl Sf900TM- III SFM培养基，混匀；
c．将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育 20min；
❖ 3．Sf9细胞计数,取6孔板，每孔加入1.6×106个细 胞(其中一孔设为空白对照)，补加预热的Sf900TMIII SFM培养基至2ml，混匀，室温静置15min，使细 胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度， 观察是否符合需求量）
存。
转化DH10BACTME.coli
❖ 1.冰上融化DH10BACTM E.coli感受态细胞（约5min）； ❖ 2.取1ng pFastbac-重组质粒至DH10BACTM E.coli感受态
细胞轻弹两下混匀，冰上静置30min； ❖ 3.42℃热击45秒；立即转移至冰上冰浴2min； ❖ 4.加800μl室温预热的LB培养基，37℃,220rpm，4h； ❖ 5.涂布至LB琼脂平板（含Kan,Tet,Gen）, ❖ 6.挑取白色菌落接种至5mLLB液体培养基（抗生素如上），
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)
细胞免疫检测注意事项：
1. 分离淋巴细胞的速度要快，避免体外长时间操作导致
过多淋巴的活性降低和死亡。
2. 台盼蓝染色计数，保证实验组间有效细胞的数量相同。 3. 准备免疫原性较好的刺激，并通过预实验确定最佳刺 激剂量。 4. RNA提取时，不丢弃24孔板中淋巴细胞上清。 5. 严格按照细胞因子ELISA试剂盒操作步骤实验。
ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液 的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。 （2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白 PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提 高包被效率。
Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five™ cells or Mimic™ Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达
Grace's Insect Medium with L-glutamine and
supplemented with（pH 6.5）：
BacPAK™ Rapid Titer Kit
本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的 单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标 记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在
光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数
的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。
注意事项：
1. 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化
Bac-to-bac中文说明书
Bac-to-bac中⽂说明书Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的⽅法产⽣重组杆状病毒。
此⽅法基于让已经转⼊杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座⼦的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产⽣包含⽬的位点的表达结构，这个⽬的基因的产⽣被杆状病毒特意位点启动⼦控制。
*⼀个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产⽣重组杆粒。
*⼀个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产⽣重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素⼄酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使⽤这个系统产⽣重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使⽤同源重组产⽣重组杆状病毒所需的4-6周相⽐，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和⾮重组病毒的⼏率*可以快速同时进⾏⼤量重组，适合表达功能性研究的蛋⽩选择pFastBac菌体（Vector）：⼤量的pFastBac菌体都适于进⾏Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南⽤途：指南提供了⼀个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆⽬的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最⾼效的DH10Bac TM产⽣重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆⾍细胞产⽣重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使⽤病毒株感染昆⾍细胞表达⽬的重组蛋⽩重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是⽤来帮助你产⽣重组杆状病毒，在昆⾍细胞中进⾏⾼⽔平表达⽬的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产⽣杆状病毒表达你的重组蛋⽩，但是使⽤这系统更倾向于有杆状病毒⽣物学和昆⾍表达背景的使⽤者。
杆状病毒表达系统简介-9页精选文档
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒表达系统的应用及展望
杆状病毒表达系统的应用及展望
侯庆华;侯英奇;梁念慈
【期刊名称】《广东医学院学报》
【年(卷),期】2006(24)6
【摘要】昆虫杆状病毒表达载体系统（BEVS）是当今基因工程领域4大表达系统（即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。
BEVS具有安全性高，对外源基因克隆容量大。
【总页数】3页(P628-630)
【作者】侯庆华;侯英奇;梁念慈
【作者单位】广东医学院生化与分子生物学教研室,广东湛江,524023;中央司法警官学院侦查教研室,河北保定071000;广东医学院生化与分子生物学教研室,广东湛江,524023
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.昆虫杆状病毒表达系统在动物疫苗研究的应用 [J], 杨旭东;朱庆贺;王刚;王爽;陈曦;王观悦
2.昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其在疫苗中的应用 [J], 梁璐琪
3.杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域应用的研究进展 [J], 刘春菊;任炜杰;王志亮
4.家蚕杆状病毒表达系统及其在口蹄疫疫苗研究中的应用 [J], 关洪鑫;李志勇;白银
梅;柳纪省
5.昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其应用展望 [J], 朱江;吴祥甫
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杆状病毒表达系统 杆状病毒滴度测定 全攻略
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。
此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。
*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。
*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CA T基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。
杆状病毒表达系统简介
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
昆虫杆状病毒载体
3.昆虫杆状病毒表达系统的应用
昆虫杆状病毒表达系统广泛应用于药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等 众多领域中。其中，在生物分子研究中，具有代表性的是重组蛋白的表达， 是目前杆状病毒表达系统应用最多的领域。成功表达出具有药用价值的蛋白 质又可用于药物研发和疫苗生产。
产业
应用 基础研究
医用疫苗 和药物
昆虫杆状病毒表达系统
高遄 生物化学与分子生物 2120422
前言 体外基因 表达系统
原核细胞系统
大肠杆菌细胞
•操作简便 •周期短、收益大 •表达产物稳定 •相对分子质量有限 •不能对表达产物进行一 些翻译后加工 、修饰
真核细胞系统
高表达 低成本 安全性高 大规模生产 哺乳动物细胞 酵母细胞 昆虫细胞（杆状 病毒表达系统）
3.1 基础研究
功能基因组学（functional genomics）的重要内容是研究 基因组内各种蛋白质的结构和功能，蛋白质之间以及蛋白质和核 酸之间的相互关系。 实现这一计划的前提是要生产几万种蛋白质 ，这就要求蛋白质 表达系统提供新的技术，诸如：通过简单的操作，生产各种活性 形式的蛋白质简化操作过程，缩短从基因生产蛋白质的时间以简 便的操作，同时生产许多种蛋白质。 最新的研究和技术发展业已表明，昆虫杆状病毒表达系统是解决 上述问题的优良系统，以昆虫虫体为宿主是十分有魅力的。
理想的外源 基因插入位 点
1.1 杆状病毒载体
载体重组原理：原理是人为将杆状病毒多角体蛋白两翼序列 的同源序列引入含外源基因的质粒载体中，通过同源重组方 式来实现外源基因对病毒多角体蛋白基因的替换。 由于杆状病毒分子质量约为134kb，不能利用多克隆位点 （酶切连接）进行基因重组，只能利用杆状病毒和带有外源 基因的质粒载体进行共转染（转移载体的介导）性高：由于杆状病毒的天然宿主是昆虫，不能在哺乳动物 细胞内复制病毒DNA 以及增殖病毒，杆状病毒不会感染人。因 此对细胞的生理影响较哺乳类病毒载体要小，同时实验操作者的 自身安全也比较有保障。
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定) PPT
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较：
空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周
2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent
3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变慢 或不增殖
脱落 或
融合(VSV/G)
裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状 病毒滴度测定)
杆
昆虫细胞的培养
状
病 重组pFastBac质粒的构建
毒
表
重组Bacmid的产生与鉴定
达
获得重组杆状病毒
系
统
蛋白表达&病毒扩大
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
Bac-to-bac中文说明书
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。
此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。
*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。
*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。
杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具
杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具刘拂晓1,2 柳增善2 王志亮1【摘要】杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。
相对于其他表达系统，杆状病毒表达系统具有特殊的优势：杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因；杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋白的表达；昆虫细胞作为受体能够对外源蛋白进行加工修饰；杆状病毒通常只感染节肢动物，不会对人畜构成危害。
因此，该系统越来越受到人们的重视，并已应用于亚单位疫苗的研发与生产，特别其对于构建病毒样颗粒，即由一种或多种病毒结构蛋白自行装配而成且不含病毒基因组的蛋白颗粒，具有不可比拟的优势。
对此做详细评述并展望病毒样颗粒疫苗的发展趋势。
【期刊名称】生物技术通报【年(卷),期】2012(000)006【总页数】7【关键词】杆状病毒昆虫细胞病毒样颗粒杆状病毒表达系统疫苗1983年，Smith等［2］成功实践了美国学者Miller的提出的杆状病毒作为载体在昆虫细胞中表达外源基因的可行性理论：他们将干扰素基因插入至苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californi-ca nuclear polyhedrosis virus，AcNPV）表达载体，然后将其转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf）细胞，成功表达了具有生物活性的人β干扰素。
此后，杆状病毒蛋白表达技术逐步建立并完善起来。
相对于传统大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞蛋白表达技术，杆状病毒技术在病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）的构建及应用方面具有不可比拟的优势。
VLP是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，高度模仿真实病毒的衣壳空间构象而不含其基因组。
大多数VLP 是良好的免疫原，既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫［3-5］。
随着杆状病毒蛋白表达技术的成熟，利用其构建VLP的报道也屡见不鲜。
1 杆状病毒分子生物学根据国际病毒分类委员会最新病毒分类报告，杆状病毒科（Baculoviridae）分为4个属，即α杆状病毒属（Alphabaculovirus）、β杆状病毒属（Betabaculovirus）、δ杆状病毒属（Deltabaculovirus）、γ杆状病毒属（Gammabaculovirus）。
杆状病毒表达系统
同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线性 化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
“转座”和“同源重组”目前都在使用中。 “转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。 采用“同源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET 的FlashBac系统，以及Bacmid Ltd.的qBac系统。 这两种方式与外源基因的表达量无关。
J Virol. 1993 Aug;67(8):4566-79. Luckow VA, Lee SC, Barry GF, Olins PO.
Bacmid polyhedrin位点附近序列细节： 目前使用的Bacmid大都源于这个Bacmid。
获得重组病毒的方式
转座：先将外源基因克隆到转移载体上，然后在大肠杆菌 中通过转座，将外源基因转移到Bacmid上。提取重组 Bacmid，转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
无论如何，相对于其他表达系统，杆状病毒表达载体系统 （BEVS）是个比较均衡的表达系统：
经过长期优化，杆状病毒表达载体系统的产量已经有了极 大的提高：
目前外源蛋白的生产成本大幅度下降，使杆状病毒表达载 体系统能进. Kaba et al. / Journal of Virological Methods 122 (2004) 113–118
敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：
Cell Biol Toxicol (2010) 26:57–68
糖基化改造 把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白的 糖基化更像哺乳动物细胞：
用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。
得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。
杆状病毒表达系统及其构建方法和应用[发明专利]
![杆状病毒表达系统及其构建方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/8e63c958ae1ffc4ffe4733687e21af45b307fede.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010716613.0(22)申请日 2020.07.23(71)申请人 云舟生物科技（广州）有限公司地址 510000 广东省广州市广州高新技术产业开发区科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器（D区）D301-D309号房(72)发明人 施金秀 罗燕 林映君 蒙伟能 叶知晟 蓝田 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224代理人 戴志攀(51)Int.Cl.C12N 15/866(2006.01)C12N 5/10(2006.01)C12P 21/00(2006.01)(54)发明名称杆状病毒表达系统及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及一种杆状病毒表达系统及其构建方法和应用，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性，所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子，所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。
利用本发明的杆状病毒表达系统，可快速直接地提取得到一种能够直接用于下游杆状病毒包装的高纯度无污染的重组阳性杆状病毒载体。
权利要求书1页 说明书7页 附图3页CN 111808884 A 2020.10.23C N 111808884A1.一种杆状病毒表达系统，其特征在于，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性；所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子；所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。
2.根据权利要求1所述的杆状病毒表达系统，其特征在于，所述温敏型复制子为pSC101 ori、pBBR1MCS2-Ts复制子或RK2复制子。
杆状病毒表达系统及其应用进展
综述与专论生物技术通报BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N2010年第10期杆状病毒表达系统及其应用进展韦永龙 李轶女 张志芳 沈桂芳(中国农业科学院生物技术研究所,北京100081)摘 要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。
在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。
就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。
关键词: 杆状病毒 BEVS 表达Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste mW ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng(B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081)Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce bei ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e .K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on收稿日期:2010 04 26基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863∀计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约80-160kb 之间。
昆虫杆状病毒细胞表达系统 课件
5) Capacity to express unspliced genes
Insect cells have the capability to perform intron/exon splicing. However, certain virus-, tissue- or species-specific splicing patterns will not be obtained if they require the presence of particular splicing factors which are not available in the infected insect cell environment. In general, for high protein expression levels, a cDNA insert rather than a genomic DNA fragment is recommended.
杆状病毒表达系统在疫苗研究中的应用
杆状病毒表达系统在疫苗研究中的应用
谢秋玲;张玲;洪岸;陈小佳;孙奋勇;林剑
【期刊名称】《中国公共卫生》
【年(卷),期】2004(20)3
【总页数】3页(P367-369)
【关键词】杆状病毒;基因表达系统;疫苗;恶性肿瘤;ELISA法
【作者】谢秋玲;张玲;洪岸;陈小佳;孙奋勇;林剑
【作者单位】暨南大学生物工程研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R373.2
【相关文献】
1.杆状病毒表达系统及其在HPV预防疫苗研究中的应用 [J], 孙肖红;孙亚洲
2.昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其在疫苗中的应用 [J], 梁璐琪
3.家蚕杆状病毒表达系统及其在口蹄疫疫苗研究中的应用 [J], 关洪鑫;李志勇;白银梅;柳纪省
4.昆虫杆状病毒表达载体系统在疫苗研究中的应用进展 [J], 荣芮;李婷婷;张玉云;顾颖;夏宁邵;李少伟
5.杆状病毒表达系统研究进展及在寄生虫基因工程疫苗中的应用前景 [J], 景志忠;王佩雅;才学鹏
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昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。
2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。
3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。
4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。
5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。
多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。
缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。
酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。
蛋白质量不理想。
哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。
成本高；表达水平低，技术和环境要求高。
昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。
重组蛋白糖基化程度低。
RTS快速，无需克隆，表达量高。
成本高。
酵母哺乳动物细胞昆虫细胞RTS体外表达系统大肠杆菌昆虫杆状病毒与其他蛋白表达系统比较在辉瑞制药公司，杆状病毒是其第二大蛋白表达系统。
杆状病毒系统表达重组蛋白的优势表达量高（可达细胞总蛋白的50%），大多数为有生物功能的可溶性蛋白；可进行翻译后修饰；可进行磷酸化修饰；可形成正确折叠的二硫键；可进行N‐和O‐型糖基化修饰；可去除信号肽；易进行规模化生产，昆虫细胞比哺乳动物细胞操作简单；相对于其他真核表达系统成本较低；杆状病毒表达系统（BEVS）的发展BEVS系统由Dr. Max D. Summers, and Dr. Gale Smith在1982年研究提出； BEVS系统基于目的基因替代病毒基因组上一个极晚期，非必须的病毒蛋白（多角体蛋白）；大多数的转移载体使用早期启动子（le1）或极晚期启动子（p10，pPolyh）；AcMNPV DNA的改造和线性化是BEVS历史性改造；对于分泌性蛋白，HBM 和gp67是最常用的分泌信号肽；BEVS允许在昆虫细胞（Sf9, Sf21, Hi5）中快速克隆和表达重组蛋白。
杆状病毒表达系统（BEVS）Bac‐to‐Bac(Invitrogen™)杆状病毒表达系统（BEVS）BacPAK6/BaculoGold (BD Biosciences/Clonetech)◆E.coli lacZ基因插入到多角体位点◆引入多个Bsu361限制性酶切位点◆Bsu361限制性酶切位点的引入使得病毒◆DNA(ΔORF1629)在昆虫细胞中不能复制◆Bsu361不能100%切割病毒DNA使之线性化◆重组病毒仍需要进行空斑筛选杆状病毒表达系统（BEVS）BaculoDirect™(Invitrogen™)◆利用Gateway®技术直接将目的基因转移到病毒DNA上◆目的基因整合到病毒DNA的polh位点◆利用整合酶和特异位点（att）完成整合◆利用更昔洛韦（核苷类似物）筛选重组病毒◆更昔洛韦被HSV1 tk磷酸化后阻止野生型病毒基因组的复制◆需要大量病毒扩繁◆每次只能生产一种重组基因杆状病毒表达系统（BEVS）flashBAC™/BacMagic(EMD/OET/Nextgen)◆用人工细菌染色体（BAC）改造polh位点，使得病毒基因组可在大肠杆菌中复制◆ORF1629的删除阻止非重组的父代病毒不能在昆虫细胞中复制◆chiA基因的删除提高了分泌通路的效率◆适合自动化生产◆不需要空斑纯化不同BEVS系统比较flash BAC系统是一个全新的生产重组杆状病毒的技术平台，flashBAC专门设计，免去了从亲代病毒中筛选重组病毒的步骤，不需要进行空斑实验，一步法杆状病毒蛋白表达系统，目前最领先的杆状病毒表达系统。
OET—专业开发第二代杆状病毒表达系统表达系统flash BAC TM flash BACGOLD TM flash BAC ULTRA TM flash BACPRIME TM全球领先的重组蛋白表达系统，简单、快速、产量高。
病毒滴度滴定试剂盒baculo QUANT TM ALL ‐IN ‐ONE准确，快速测定病毒滴度。
病毒转染试剂flash FECTIN TM baculo FECTIN TM专用于昆虫细胞的高效转染试剂。
培养基baculo GROW TM昆虫细胞专用无血清培养基。
转移载体pOET TM transfer plasmids 简化的克隆和同源重组技术。
更简单：无需繁琐的筛选工作更快速：一步法，只需5天更高的蛋白产量：蛋白更稳定更高的蛋白活性：蛋白生物活性高适用于难表达的蛋白：分泌蛋白，膜蛋白，毒性蛋白flash BAC 表达系统：主要产品：Bac‐to‐Bac®(Invitrogen) flash BACGOLD表达条件优化温度对昆虫细胞生长的影响表达条件优化宿主细胞对分泌性蛋白的表达影响蛋白表达水平随目标蛋白的不同也有所不同表达条件优化( ‐) N a B u( ‐) N a B u+ 2m M N a B u 24h p i+ 2m M N a B u 48h p i( ‐) N a B u( ‐) N a B u+ 2 m M N a B u 24h p i+ 2 m M N a B u 48h p iM 17 45 67 93 117 17 45 67 93 117温度对蛋白表达及稳定性的影响24°C27°C20°C27°C诱导时间hr在Sf ‐21细胞中表达重组蛋白在Sf ‐9细胞中表达重组蛋白表达条件优化培养基和MOI对蛋白表达的影响MOI在1和5时对蛋白表达没有明显区别不同生长培养基会影响蛋白表达不同蛋白表达量也有所不同表达条件优化不同标签蛋白纯化翻译后修饰研究表明大多数的昆虫细胞中表达的重组糖蛋白不能外周糖基化修饰，比如唾液酸； 唾液酸在很多细胞‐细胞相互作用，免疫反应，循环糖蛋白的清除中起很重要的作用； Donald L. Jarvis博士设计改造了几种昆虫细胞可使重组蛋白像在哺乳动物细胞中那样； 进行唾液酸N‐糖链糖基化；翻译后修饰糖基化修饰在大肠杆菌系统中表达的蛋白检测不到糖基化 在酵母和昆虫细胞中有明显的糖基化翻译后修饰糖基化位点突变对蛋白表达的影响糖基化位点突变后蛋白表达水平降低翻译后修饰磷酸化修饰高水平表达的蛋白激酶可使重组蛋白过度磷酸化和异质性;研究发现几个商业载体上的His标签(MHHHHHHSSGLVPRGS）的色氨酸残基会发生磷酸化;标签蛋白色氨酸残基的过度磷酸化导致蛋白聚集，抵抗凝血酶的切割;用碱性磷酸酶可部分恢复凝血酶的灵敏性;在昆虫细胞表达系统中用冈田酸（蛋白磷酸酶抑制剂）可扩展标签蛋白磷酸化.规模化培养细胞●细胞起始密度2.0X106vc/ml●培养温度27℃●转速25rpm●气压0.1‐0.2lpm●培养72h 收获细胞高通量蛋白表达‐‐‐Nextgen工作站NextgenNextgen 杆状病毒工作站●Sf 9细胞(静置培养)•接种细胞，密度达2 x 105 /孔(0.4 ml 培养基)•用baculo 工作站把细胞混匀●共转染(聚苯乙烯)•聚苯乙烯试管/板子•100 ng flashBAC DNA •500 ng 转移载体•2μg 脂质或转染试剂●培养•28 ℃培养5 天flashBAC 系统在昆虫细胞中一步法生产重组病毒。
非常适合于高通量和自动化生产系统。
总结●商业化的BEVS系统让病毒重组及蛋白表达变得更简单；●大多数昆虫细胞系在不加血清培养基中快速生长，得到高滴度病毒和高产量重组蛋白；●规模化培养简单经济；●适合自动化生产；●表达人源化蛋白，昆虫细胞中糖基化途径克服人源糖蛋白的问题。