免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
免疫检验考试辅导：斑点免疫层析试验
斑点免疫层析试验（dotimmunochromatographicassay，DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。
（二）试剂和操作
免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。
试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条，试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维素膜条。
硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。
测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。
若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。
过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。
反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
斑点免疫层析试验在试剂形式和操作步骤上较前述的几种免疫测定法都更为简化，只用一个试剂，只有一步操作。
免疫酶斑点试验
应用领域
临床诊断
药物筛选
用于检测感染性疾病、自身免疫性疾病、 肿瘤等疾病的相关抗原或抗体，辅助临床 诊断和制定治疗方案。
用于筛选和鉴定药物的靶点、研究药物的 免疫活性等。
食品安全检测
环境监测
用于检测食品中的病原微生物、毒素等有 害物质。
用于检测环境中的有害物质、污染物等， 保障环境安全。
02
免疫酶斑点试验的原理与技术
肿瘤
免疫酶斑点试验也可用于肿瘤标志物的检测，如癌胚抗原、甲胎蛋白 等，有助于肿瘤的早期发现和监测。
在药物研发中的应用
新药筛选
免疫酶斑点试验可用于筛选和鉴定具有药理活性的小分子 化合物，为新药研发提供有力支持。
药物代谢研究
通过免疫酶斑点试验可以研究药物在体内的代谢过程，了 解药物在体内的分布、代谢和排泄情况，为药物设计和优 化提供依据。
04
免疫酶斑点试验的结果分析
阳性结果的判定
01
02
03
斑点颜色明显
如果斑点颜色深且清晰， 与背景形成明显对比，通 常被认为是阳性结果。
斑点大小
斑点大小超过一定阈值通 常被认为是阳性，具体阈 值可能因试验而异。
周围晕圈
在阳性结果中，有时会出 现围绕斑点的浅色晕圈， 这有助于识别阳性斑点。
阴性结果的判定
药物疗效评估
免疫酶斑点试验可检测药物对靶点的抑制作用，评估药物 的疗效和安全性，为临床用药提供参考。
在生物科学研究中的应用
01
蛋白质组学研究
免疫酶斑点试验可用于蛋白质组学研究，检测蛋白质的表达和修饰情况，
了解蛋白质的功能和作用机制。
02
细胞信号转导研究
通过免疫酶斑点试验可以检测细胞内信号转导通路的活性变化，了解细
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
酶联免疫斑点试验流程图
酶联免疫斑点试验流程图英文回答：Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay Workflow. Materials:ELISPOT plate.Capture antibody.Cell suspension.Antigen or stimuli.Detection antibody.Substrate (e.g., chromogen or enzyme substrate)。
Procedure:1. Plate Coating: Capture antibody is coated onto the ELISPOT plate overnight at 4°C.2. Cell Addition: Cell suspension is added to the coated plate and incubated to allow cells to adhere (e.g., 4-18 hours at 37°C).3. Antigen Stimulation: Antigen or stimuli is added to the wells to activate antigen-specific cells.4. Cell Incubation: Cells are incubated with antigen or stimuli for a specific time (e.g., 16-24 hours) a t 37°C.5. Cell Removal: Cells are washed away, leaving behind spots corresponding to secreted cytokines or other molecules.6. Detection Antibody Addition: Detection antibody specific for the target cytokine or molecule is added and incubated to bind to the spots.7. Substrate Addition: Substrate is added to visualize the bound detection antibody, generating colored spots.8. Spot Counting: Spots are counted using an automated or manual method.Interpretation:The number of spots represents the number of cells that have secreted the target cytokine or molecule in response to the antigen or stimuli. This information can be used to assess cell-mediated immune responses, cytokine production, and immune cell activation.中文回答：酶联免疫斑点试验流程图。
斑点免疫层析试验报告
斑点免疫层析试验报告
一、实验目的
通过斑点免疫层析试验检测特定抗体的存在，判断样本中是否含有目标抗体。
二、实验原理
斑点免疫层析试验利用抗原与抗体的特异性结合性质，检测样本中是否存在与特定抗原结合的抗体。
在试验过程中，将包含目标抗原的蛋白质在膜上固定，待其干燥后滴加待检测样本，目标抗体与蛋白质结合，再加入掺杂有染色剂的检测抗体，与样本中的抗体结合后呈色，通过颜色变化来判断样本中是否含有目标抗体。
三、实验步骤
1.将含有目标抗原的蛋白质涂在膜上，在室温下静置1小时。
2.将膜表面上的蛋白质冲洗干净，并加入待检测样本。
3.样本和蛋白质在室温下结合30分钟。
4.将掺杂染色剂的检测抗体加入，与样本中含有目标抗体的检测位点结合。
5.再次冲洗样品，待染色剂充分浸染30分钟。
6.观察染料颜色的变化。
四、实验结果及分析
将待检测样品加入检测后，测定斑点颜色变化。
颜色变化为深棕色代表样品中含有目标抗体，未检测到颜色变化则代表样品中不含目标抗体。
五、实验结论
根据斑点颜色变化判断出待检测样品中存在/不存在目标抗体。
六、实验注意事项
1.斑点免疫层析试验产生的颜色变化取决于样品中的目标抗体
浓度。
如果样品中目标抗体浓度较低，则可能无法检测到颜色变化。
2.在试验过程中，一定要注意卫生和消毒，避免出现污染。
3.试剂的储存和使用必须遵从说明书的规定。
4.使用试剂前进行试剂准备，检查是否过期或损坏。
5.在试验过程中，必须严格按照实验步骤进行，避免试验失败。
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
ELISA和ELISPOT检测技术
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
酶联免疫吸附试验 (ELISA)
ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ：
酶标记物
底物溶液
E
E E E E E E E E
E
E
E
E
对 照 孔
参考液(不含抗原)
酶标记物
底物溶液
E
E E
E
E
E
E
测 定 孔
样本(含抗原)
竞争法ELISA实验原理
E
E
半定量ELISA试验
间接法检测血清HBsAb含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳) 加板 (阴、阳、样) 37℃, 30min 洗涤3次，拍干 37℃, 30min 洗涤3次，拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
ELISPOT技术简介 ELISPOT的基本原理 ELISPOT的实验方法 ELISPOT技术的应用
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使 体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫 应答机制时，以往常用ELISA方法检测体液中游离的细胞因子 （CK）或抗体，但由于游离的CK或循环抗体的半哀期不同， 使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反 映体内的抗体及CK 的水平。80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞 和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其 具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探 索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
金免疫技术(斑点免疫层析试验)
金免疫技术（斑点免疫层析试验）一、原理金免疫技术是免疫标记技术之一，金盐被还原成原子金后形成金颗粒悬浮（胶体金），这种金颗粒呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。
典型的测定方法有斑点买免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。
二、材料1 、HCG金标试纸条2、妊娠尿液正常尿液三、方法（一）胶体金的制备根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。
常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。
（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。
冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。
（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HA uCl4水溶液100ml，加热煮沸。
根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。
这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。
（二）胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1．待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 Na Cl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1 h，去除聚合物。
2．待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
酶联免疫斑点试验、抗结核抗体平行检测菌阴性结核价值对比
酶联免疫斑点试验、抗结核抗体平行检测菌阴性结核价值对比摘要：目的：比较结核感染T斑点试验（TSOP.TB）和结核抗体试验在菌阴性结核诊断中的敏感性和特异性以及应用价值。
方法：对疑患菌阴性结核的290例患者进行前瞻性研究。
收集患者临床资料，采用TSOP.TB和结核抗体试验进行结核病的诊断，比较二者对结核病诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值。
结果：290例疑患结核病患者最终确诊结核 119例。
TSOP.TB试验在敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值等方面显著优于抗结核抗体试验（P＜0.05）。
结论：TSOP.TB较结核抗体有更高的灵敏性和特异性，更适于作为结核病的筛检试验。
关键词：酶联免疫斑点试验；抗结核抗体试验；结核；诊断快速诊断和治疗是控制结核病的关键。
结核病诊断的金标准是在胸水、痰或其他临床标本中找到结核分枝杆菌。
但由于抗酸染色的敏感性和特异性差、结核菌培养时间长，限制了其在临床上的广泛应用。
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）采用的结核分枝杆菌特异性抗原为早期分泌原靶蛋白6（ESAT-6）或培养滤液蛋白10（CFP）-10，其编码基因RDI为卡介苗（BCG）和绝大多数非结核分枝杆菌所缺失，避免了结核菌素试验（PPD）出现的交叉反应，这种方法无论在敏感性还是特异性发面均得到了极大的认可。
本研究比较ELISPOT与抗结核抗体试验对菌阴肺结核的诊断价值。
1.资料和方法1.1一般资料对象2011年7月到2012年8月吉林大学第一医院呼吸科疑诊或待排除结核患者290例，年龄55-76，平均（62.78）岁。
所有患者均有反复咳嗽、咳痰伴发热等临床症状，有肺部感染的影像学表现，3次痰涂片未找到抗酸杆菌且二次痰培养均阴性。
在其他详尽检查基础上同时进行酶联免斑点试验与抗结核抗体试验。
根据检测结果综合判断分析，对疑为菌阴患者给予实验性抗结核治疗。
根据最终治疗和随访结果，进行最终确诊。
诊断标准：（1）典型肺结核临床症状和胸部Ｘ线表现；（2）抗结核治疗有效；（3）临床可排除其他非结核性肺疾病；（4）PPD强阳性，血清抗结核抗体阳性；（5）肺外组织病理证实结核病变；（6）BALF检出抗酸分枝杆菌；（7）支气管或肺组织病理证实结核病变；符合（1）-（5）的三项或（6）、（7）任意一项即可确诊。
酶联免疫斑点试验的原理
酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。
该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。
2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。
它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。
该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。
3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。
首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。
步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。
通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。
步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。
步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。
步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。
常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。
步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。
斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。
4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。
这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。
酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。
常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。
[基础科学]斑点免疫层析试验
![[基础科学]斑点免疫层析试验](https://img.taocdn.com/s3/m/58a7c171793e0912a21614791711cc7931b778f2.png)
实验二十三斑点免疫层析试验(Dot immunogold chromatographic assay)斑点金免疫层析试验是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。
本法除层析条装置外，不需任何仪器设备。
本实验以双抗体夹心法测定HBsAg为例。
【实验原理】金标抗HBsAg抗体(兔型)干片粘贴在近下端，抗HBsAg单克隆抗体(鼠型)羊抗兔IgG抗体分别包被在NC膜的测试区和质控区。
测试时，试纸条下端浸入血清样品中或滴加血清样品，通过层析作用，上端移动，流经干片时将金标抗HBsAg抗体复溶，若待检血清中含HBsAg，即形成金标抗HBsAg-HBsAg复合物，移至测试区时，形成金标抗HBsAg-HBsAg-抗HBsAg复合物，金标抗HBsAg 被固定下来显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标抗HBsAg抗体移至质控区被羊抗兔免疫球蛋白抗体捕获，呈现红色质控线条。
【主要试剂与器材】1.胶体金层析条所用试剂全部为干试剂被组合在该层析条上，有商品供应。
2.样品待检血清和HBsAg阳性质控血清【操作方法】1.将试剂条标记线一端浸入待检样品中2～5秒或在样品加样处加一定量待检样品，平放于水平桌面上。
2.室温下5～15min，目测观察结果。
【结果判断】结果判断见图23-1。
HBsAg阳性(+)：两条紫红色条带出现，样品中含有乙肝表面抗原。
HBsAg阴性(-)：仅质控区(C)出现一条紫红色条带，样品中检测不出乙肝表面抗原。
试剂条无效：质控区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质失效。
图23-1 斑点免疫层析试验结果判断示意图【注意事项】1.打开试剂条包装后应在1h内应使用。
2.将试剂条插入血清/血浆样品中，血清/血浆样品液面不能超过试剂条的标记线。
3.若发现试剂条无效，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂盒重新测试。
如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品。
结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析
结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析结核病是公共卫生中的一种常见传染性疾病，其在传染性疾病致死中所占的比重一直比较高，也是公共卫生需要长期关注的疾病。
结核病在临床上主要表现为咯血、咳痰、肺部空洞等症状，具有不易控制、易复发、具有发病率高、耐药率高等特点，严重影响患者的生活质量，也对人口生命健康危害极大，故早期进行准确鉴别诊断，指导临床治疗，对改善患者预后具有重要意义[1-2]。
痰培养结核分枝杆菌是临床诊断结核病的“金标准”，但存在检测时间较长、结核细菌生长缓慢、对于技术人员要求较高等不足，不利于早期诊断，难以满足临床需要。
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)属γ干扰素释放试验类型，是诊断肺结核的重要途径，其采取特异性结核分枝杆菌抗原，当前在临床上得到广泛使用[3]。
现就该项目技术进展及现状报道如下：1结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）原理和特点1.1 γ干扰素释放试验（IGRA）简介目前用于临床γ干扰素释放试验（IGRA）主要有两种，一种是QFT-GIT试验，该试验采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结核特异性抗原刺激致敏T细胞释放γ干扰素浓度。
另外一种就是结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB），该试验的方法是采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测外周血结核特异性抗原刺激分泌IFN-γ的Ｔ淋巴细胞数量[4]。
IGRA已有20多个国家发布了应用指南[5],2014年中华医学会结核病学分会和《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织相关专家发布了《γ干扰素释放试验在中国应用的建议》，对IGRA在活动性结核病及潜伏性结核（LTBI）诊断的应用建议。
2017年卫健委发布卫生标准WS288-2017《肺结核诊断》中将γ干扰素释放试验（IGRA）阳性作为结核病诊断实验室检查项目。
卫健委于2020年4月2日发布的《中国结核病预防控制工作技术规范》中明确结核潜伏感染检测方法、人群及预防性治疗方案。
免疫斑点试验的实验报告
免疫斑点试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过免疫斑点试验（ELISPOT）评估特定抗原刺激下，免疫细胞分泌特定抗体或细胞因子的能力。
免疫斑点试验是一种常用的细胞免疫反应检测方法，广泛应用于疫苗开发、免疫诊断和免疫治疗研究。
实验原理：免疫斑点试验是基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理发展而来，通过检测细胞因子或抗体在固相上的沉积形成斑点，从而定量分析免疫细胞的分泌活性。
当免疫细胞被特定抗原激活后，它们会分泌细胞因子或抗体，这些分子可以被特定的捕获抗体固定在固相上，随后通过酶标记的检测抗体和底物显色，形成可见的斑点。
实验材料：1. 96孔多孔板2. 细胞培养基3. 特定抗原4. 捕获抗体5. 酶标记的检测抗体6. 底物溶液7. 细胞计数器8. 免疫细胞（如外周血单核细胞）9. 其他必要的试剂和耗材实验方法：1. 将96孔多孔板预先涂覆捕获抗体，封闭未结合位点。
2. 将免疫细胞以适当浓度接种到多孔板中，并加入特定抗原进行刺激。
3. 细胞培养一定时间，使细胞因子或抗体分泌并固定在固相上。
4. 移除培养上清，用洗涤液清洗多孔板，去除未固定的细胞和抗原。
5. 加入酶标记的检测抗体，孵育后再次洗涤。
6. 加入底物溶液，使酶催化底物产生颜色反应。
7. 颜色反应达到适宜程度后，终止反应，使用ELISPOT分析系统计数斑点。
实验结果：实验结果显示，不同浓度的抗原刺激下，免疫细胞产生的斑点数量有显著差异。
高浓度的抗原能显著提高斑点的数量，表明免疫细胞对抗原的反应性增强。
通过比较实验组和对照组的斑点数量，可以评估免疫细胞的活性和分泌能力。
实验讨论：本实验结果表明，免疫斑点试验是一种灵敏且特异的方法，能够定量分析免疫细胞对特定抗原的反应。
斑点的数量与免疫细胞的活性成正比，可以用来评估免疫应答的强度。
此外，通过优化实验条件，如细胞浓度、抗原浓度和培养时间，可以进一步提高实验的准确性和重复性。
实验结论：免疫斑点试验成功地评估了免疫细胞对特定抗原的反应性，为进一步研究免疫细胞的功能和免疫应答机制提供了可靠的实验数据。
ELISPOT酶联免疫斑点分析
ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。
80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。
因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。
•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。
细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。
斑点金免疫渗滤试验
斑点xx免疫渗滤试验斑点免疫渗滤试验的基本原理是：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。
斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。
90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。
在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。
（一）原理以双抗体夹心法为例。
在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。
当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。
其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。
因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。
（二）试剂和操作1.渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。
塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm-1-的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。
如此即制备成一渗滤装置。
塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。
2.试剂盒组成滴金法试剂盒的三个基本试剂成分是滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。
为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。
3.测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下：（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。
（2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。
酶联免疫斑点试验在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的应用价值
酶联免疫斑点试验在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的应用价值【摘要】目的：探讨酶联免疫斑点检测技术（elispot）（t-spot.tb）在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的临床应用价值。
方法：利用elispot检测对结核菌特异抗原刺激反应，分泌γ-干扰素的效应t淋巴细胞数量方法，对72例结核杆菌感染性疾病组和20例健康体检者组的外周血作能分泌结核特异的γ-干扰素的t 淋巴细胞测定，与结核菌纯蛋白衍生物试验（ ppd）、结核抗体检查结果进行比较分析。
结果：t-spot.tb敏感性为 91.7%，较ppd 试验36.1%、抗结核抗体55.6%和ppd试验+抗结核抗体29.2%均明显增高，p值均0.05），而较之结核抗体的特异性 60.0%，在统计学上也具有显著差异（p 0.05），但是较之抗结核抗体的特异性60.0%（12/20）有显著统计学差异（p 3 讨论t-spot·tb是以 t 细胞免疫应答为基础的γ-干扰素（γ-ifn）释放实验，其原理是结核杆菌感染者外周血单核细胞（ pbmc）中存在的特异性 t 细胞在受到抗原早期分泌性抗原靶蛋白 6（ esat-6）和培养滤过蛋白 10 （ cfp-10）刺激后会分泌γ-ifn，释放的γ-ifn 随即与微孔板底部包被的γ-ifn 抗体结合而形成免疫复合物，该复合物再与随后加入的碱性磷酸酶标记的抗抗体结合，继而分解分解随后加入的显色底物溶液而在反应部位形成不溶性色素沉淀斑点。
每一个斑点代表 1 个γ-ifn 分泌细胞（结核特异的效应 t 细胞）。
根据斑点数推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应 t 细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断[3]。
其中抗原 esat-6 和 cfp-10 为结核分枝杆菌和少数非结核分枝杆菌所特有，而不存在于卡介苗及大多数非结核分枝杆菌中[4]，因而从根本上避免了传统结核菌素皮试中所存在的 bcg 交叉抗原反应，从而确保了 t-spot·tb 的高度特异性。
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实验目的
1.了解免疫酶斑点技术的基本原理 及方法；
2.了解免疫酶斑点技术的用途。
免疫斑点酶技术的原理
硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强 的静电吸附力, 在中性条件下即可有效 地吸附蛋白质等生物大分子。
将免疫物质吸附于纤维素膜后，就可利 用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。
7. 将膜片放入底物液中, 震荡15分钟左右观察。 明显棕色斑点者为阳性
实验结果
免疫斑点试验的影响因素
1. 包被NC膜的抗原浓度对试验结果影响较大。 多以蛋白质含量500～1000μg／ml为宜。浓度 过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。
2. 酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最 适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具 体条件作方阵滴定来确定。
方法(直接法)
1. 取硝酸纤维素膜片, 用笔做好标记方便加样; 2. 将稀释的抗原液2μl加于相应格内,室温自然干 燥! 3. 将膜片放入封闭液中震荡封闭15分钟;
4. 用洗涤液震荡洗3次, 每次1分钟, 吸干;
5. 将膜片放入稀释好的酶标抗体液体中，震荡 15分钟, 吸干;
钟, 吸干;
免疫酶斑点技术的特点
1. Ag-Ab反应—高特异性 2. 酶催化作用的高效性—高敏感性 3. NC膜的运用—微量抗原的检测
实验方法及注意事项
1. 分组为单位 (两桌为一组)
2. 膜片、抗原、洗涤液、吸水纸在实验台
上 3.
酶标抗体放置在冰箱，使用前取出
4. 底物临用前配置
5. 震荡器全班一台, 调整好频率后不要乱动
3. 显色时间，一般认为5-10分钟较好。显 色时间过长常导致本底着色加深，降低试 验的特异性。
4. 用抗原包被NC检测抗体时，待检样品 加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品 混淆，一般5～10μl即可。
免疫酶斑点技术的应用
1. 微量抗原的检查; 2. 抗体分泌细胞、细胞因子产生细胞 的筛选; 3. 自身抗体的检查。