固定化微生物技术及其在养殖水体中的应用

固定化微生物技术及其在养殖水体中的应用目前，水产养殖，特别是名特水产养殖大多实施高密度养殖，养殖水体自身污染日益严重，同时由于外源性污染物的影响，养殖水域环境质量日益下降。

因此，水质调控技术已成为发展水产养殖的一个关键技术。

由于通常所采用的理化方法控制水质的技术存有种种弊端，所以生物（主要是运用微生物）控制便得到重视。

目前国内外一般采用单一或复合微生物菌种来控制水质，但由于微生物受外界环境影响较大，抗不良环境冲击能力差，一旦系统受损难以恢复，因此处理效果不稳定。

而固定化微生物技术不仅有利于优势菌种的固定，提高难降解有机物的降解效率；还能在生物装置内维持高浓度的生物量，在无细胞冲出的前提下，液流量大，提高了处理负荷，减少了处理装置的容积；并且易于固液分离；同时微生物被高分子材料包埋后抗毒性能和耐受力明显增加，因此成为研究的热点。

1 固定化微生物技术固定化微生物技术起始于1959年，由Hattori等人首次实现了大肠杆菌的固定化，此后发展迅速。

该技术最初主要用于工业发酵，20世纪70年代以后，由于水污染严重，迫切需要一种高效、快速，能连续处理的废水处理技术，从而微生物固定化技术才在污水处理中得到广泛应用，效果较好，至今已经形成了较为完备的理论和方法。

固定化微生物技术是指利用化学的或物理的手段将游离的微生物定位于限定的空间区域，并使之成为不悬浮于水仍保持生物活性、可反复利用的方法[1]。

这里的微生物主要是人为选定的特效降解菌的优势菌种，应满足以下3个基本条件：①投加的菌体活性高；②菌体可快速降解目标污染物；③在系统中不仅能竞争生存，而且可维持相当数量[2]。

固定化载体为微生物创造了更不易解体的生存环境，所以，一个理想的固定化载体的选择也很重要。

适合于废水处理的固定化载体应具有以下性能：①对微生物无毒，生物滞留量高；②传质性能好；③性质稳定，不易被生物降解；④机械强度高，使用寿命长；⑤固定化操作简单；⑥对其它生物的吸附小；⑦价格低廉[3]。

目前常用的载体可分为无机载体、有机高分子载体和复合载体3大类型。

无机载体如多孔玻璃、硅藻土、活性炭、石英砂等。

有机载体还可分为两类：一类是高分子凝胶载体，如琼脂、角叉莱胶和海藻酸钙等；另一类有机合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。

复合载体是由无机载体和有机载体材料结合而成，使两类材料的性能互补，从而显示复合载体材料的优越性[4]。

2 固定化微生物的制备方法目前，固定化微生物的制备方法多种多样，国内外没有统一的分类标准，根据对各种方法的分析，可将其分为物理固定法和化学固定法两大类。

物理固定法主要有包埋法、吸附法（载体结合法）和包络法，化学固定法包括共价结合法和交联法（架桥法）等。

2.1 包埋法包埋法是将微生物菌体包埋在半透性的聚合物凝胶或膜内，小分子的底物和产物可以自由出入，而微生物却不会漏出。

包埋法可分为高分子合成包埋、离子网络包埋及沉淀包埋，是目前研究最广泛的固定化方法。

常用的包埋法固定微生物的载体材料有天然高分子多糖类的海藻酸钙凝胶和卡拉胶、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(ACAM)等。

其中，天然高分子凝胶对微生物无毒，传质阻力小，但结合强度小；有机合成高分子凝胶强度高，影响微生物的生物活性，同时传质阻力大。

2.2 吸附法吸附法是利用微生物所具有的可吸附到固体物质表面或其它细胞表面的能力，将微生物吸附在附加剂的表面的方法，这是一种非常廉价和有效、比较常用的微生物固定化方法。

吸附法可分为物理吸附和离子吸附。

物理吸附是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵石、铅炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化。

离子吸附是利用微生物在解离状态下离子键作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有DEAE-纤维素、CM-纤维素等。

2.3 包络法20世纪90年代初期，为克服吸附法和包埋法固定微生物的缺点，又提出用包络法固定微生物的新技术。

包络法以人工合成生物相容性好的聚丙烯酸酯共聚物基体型多孔颗粒为载体。

郑邦乾等[5]的研究表明，微生物即可在该多孔载体外表面生成机械强度高的生物膜，又可在载体内孔中聚集大量的微生物，增大了微生物的聚集密度，而且提高了生物粒子承受水力负荷的能力。

2.4 共价结合法共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团形成化学共价键连接，从而固定微生物。

该方法固定化微生物稳定性好，不易脱落，但限制了微生物的活性，同时反应激烈，操作与控制复杂苛刻。

2.5 交联法交联法是通过微生物与具有两个或两个以上官能基团的试剂反应，使微生物菌体相互连接成网状结构而达到固定化微生物的目的。

聚集-交联固定法是使用凝聚剂将菌体细胞形成细胞聚集体，再利用双功能或多功能交联剂与细胞表面的活性基团发生反应，使细胞彼此交联形成稳定的立体网状结构。

这样，高效菌体不易流失，生物浓度高，而使处理效果提高。

最为常见的交联剂是戊二醛。

3 固定化微生物技术在养殖水体中的应用我国淡水湖泊富营养化情况日趋严重，为了对富营养化水体进行原位脱氮处理，采用固定化微生物技术，将反硝化菌制成固定化小球，投加到富营养化模拟水环境中，在无外加碳源的条件下，研究模拟水环境中含氮化合物的变化规律，以及固定化反硝化菌利用水体中有机物，降解硝酸盐氮的情况。

研究结果表明，固定化反硝化菌能有效地去除富营养化模拟水环境中的硝酸盐氮，并部分降解水样中的有机物。

固定化反硝化菌的脱氮率受有机物种类和硝酸盐氮浓度等因素的影响。

但是长期应用时的脱氮效果以及对原水生态系统的影响有待进一步研究[6]。

Balderston等[7]在高密度、闭合式鲑鱼养殖池中，利用柱状固定化反硝化细菌，有效的去除了养殖废水中的NO3--N。

光合细菌在养殖水体中的应用较多，但是游离光合细菌流水条件下易流失，不稳定，因此固定化光合细菌[8-11]逐渐得到重视。

郑耀通[12]应用固定化光合细菌净化养鱼水质试验，也发现固定化光合细菌可显著提高氨氮和COD的去除率，并能增加溶解氧。

经1个月的鱼种饲养试验，固定化光合细菌组鱼体重显著大于对照组，成活率也高于对照组。

不仅鱼体质好，活泼，个体较大又整齐，而且体色鲜艳。

王立华等[13]在密闭鱼篓和敞开鱼篓中投放固定化光合细菌、游离光合细菌，以不加光合细菌作对照运输鲤鱼种，结果发现，在密闭鱼篓和敞开鱼篓中，施放固定光合细菌组在运输途中水质一直保持良好，鱼种的成活率也是最高的，到达运输地后，鱼的状态也是最好的。

固定化光合细菌在中华绒螯蟹人工育苗中也有重要的作用[14]。

Hisashi等[15]比较了PVA和海藻酸2种材料固定化光合细菌对鱼池水质净化与反硝化的效果，结果表明固定化PVA球比海藻酸盐固定化球的水质净化能力强。

由于硝化细菌生长缓慢(在低温下则生长更慢)，一些学者作了固定化细胞的尝试。

研究发现，固定化硝化细菌具有较强的耐低温能力[16]，这对含氨废水的冬季生物处理十分有益。

黄正等[17]富集、培养硝化细菌污泥，选用PVA作为载体，添加适量粉末活性炭包埋固定硝化细菌污泥，处理养殖废水(COD＝243mg/l，NH4+-N＝45mg/l)，处理24h后COD去除率为74.9%，NH4+-N去除率达82.5%。

Shan[18]等利用固定化的硝化细菌去除对虾养殖池中高浓度的氨氮，结果表明固定化细胞能有效去除养殖池中的总氨氮，高达20mg/l，即使投入的固定化颗粒密度较小，也能获得较高的总氨氮去除率。

吴伟等[19]用聚乙烯醇（PVA）的方法对沼泽红假单胞菌、诺卡氏菌和假丝酵母3种菌株进行固定化，所得的凝胶颗粒机械强度好，经久耐用。

运用这3种菌株的固定化细胞对养殖水体中NH4+-N和NO2--N进行转化，发现3菌株经固定化后，其对养殖水体中NH4+-N和NO2--N的转化效率明显优于其游离细胞。

若将3菌株按2：1：2组合成复合菌株并固定化，其对养殖水体中的NH4+-N和NO2--N转化效果将更佳。

水产养殖过程中产生的废弃物包括残饵、鱼虾粪便排泄物、生物残体、肥料等在池底积累起来，形成含有各种污物的淤泥，这些污染物是池塘水质恶化的源头和各种病菌、病毒系列的温床，特别是其中的有机物。

为了降解虾池底部的有机物污染，以沸石为载体，将Lt7511菌投入虾池进行环境修复。

发现每千克60目沸石可吸附0.46g菌体（干质量），沸石固定化菌对饵料浸出液的降解效果明显高于非固定化菌[20]。

芽孢杆菌也是一种常用的水质净化微生物。

以砂粒或沸石粉作为载体分别固定芽孢杆菌作为微生物治理剂，并将其应用于试验虾池和生产性虾池中，以NH4+-N和NO2--N含量作为指标判断它们对虾池水体水质的影响和控制。

结果表明，此类新型的固定化微生物治理剂具有稳定的生物效应，持续发挥作用，对虾池亚硝酸盐有明显的去除控制效果[21]。

4 存在的问题及展望固定化微生物技术同样也存在着许多亟待解决的问题：①廉价高效的固定微生物载体的开发。

理想的载体能在生产中大量应用并产生经济效益，要求它必须价廉高效，但现在常见的各种载体均无法在两方面同时得到突破。

各种吸附剂制备简单，操作容易，反应条件温和，制备价格低廉，但微生物与载体的结合力较弱、稳定性差，影响处理效果。

而常用的高分子包埋载体制备工艺复杂，制备成本高，影响这类载体的大量使用。

因此，提高吸附剂的吸附能力，简化包埋载体的制备工艺，使用和研究新型廉价的适合制备载体的高分子材料，有机高分子材料与无机多孔材料的结合等将是今后的研究热点；②提高载体的重复使用率，延长使用寿命。

载体的重复使用，可延长使用寿命，降低使用成本。

各种载体的可再生能力、再生工艺的研究，是目前微生物固定化处理中鲜见报道的方面，有待于众多研究力量的投入；③适合特定处理的微生物种群的选择。

目前，微生物处理技术越来越广泛的应用于废水的处理中，微生物具有的可分离、筛选、驯化的特点，使其经过一定的试验，可快速生产出适合特定废水和环境变化的菌群，显著增加参与反应的微生物的量，提高菌群的成活率、利用率和处理效果；④开发新型高效的固定化微生物反应器。

在传统反应器应用新型固定化微生物技术，无法充分发挥效用。

因此，原有生物反应器的改进，适合固定化微生物的高效生化反应器的研究，也是一个急需解决的问题。

由于养殖废水成分复杂再加上环境因素的影响，目前，固定化微生物技术在养殖水体中的应用主要还处在室内模拟阶段，把固定化微生物技术应用于生产中还需做进一步的研究。

但固定化微生物技术能够高效地使养殖水体净化，而建立高度净化的废水处理系统，有利于减少或避免养殖废水的排出，降低环境污染，并有利于建立高效率的循环式高密度养殖系统，降低生产成本，从而促进养殖业的发展。