鼠神经生长因子的制备方法
神经生长因子
神经生长因子中文名称：神经生长因子英文名称：nerve growth factor;NGF定义1：由效应神经元支配的靶组织细胞所合成和分泌的具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子。
能维持感觉、交感神经元存活，促进受损神经纤维修复，淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞增殖、分化，伤口愈合等。
应用学科：免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科）定义2：一组具有激素样性质的多肽。
能引起神经细胞肥大和增生、神经细胞突的生长、并使各种神经细胞的代谢增强。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；激素与维生素（二级学科）定义3：一种在脊椎动物的交感神经元和感觉神经元的生长发育中起关键作用的、具有生物活性的蛋白质分子。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞周期与细胞分裂（二级学科）神经生长因子（NGF）是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。
神经生长因子nerve growth factor 略称NGF。
在将小鼠肉瘤180移植于3日龄鸡胚体壁时，与移植片连接的脊髓感觉神经节及交感神经节增大20%—40%，基于比克尔（E.D.Bueker，1948）的这一发现，科恩（S.Cohen，1954）等从小鼠肉瘤180和37中成功地分离出具有同一活性的核蛋白质，以后从蛇毒中分离出具有千倍活性（Cohen，R.Levi-Montalcini，1956）和从小鼠颚下腺分离出具有万倍活性的蛋白质（Cohen，1960），这种蛋白质被称为神经生长因子。
科神经生长因子对神经元生长的促进作用恩等认为，其有效成分是分子量约为2.2万的蛋白质，由两个亚单位构成的二合体或多合体显有活性。
另一方面，瓦恩（S.Varon，1967）认为，活性成分是分子量约为14万的蛋白质，具有分子量约为3万的α、β、γ三种亚单位，仅β表现有NGF活性。
大鼠神经生长因子(NGF)说明书(1)
释。
480ng/L
5 号标准品
150µl 的原倍标准品加入 150µl 标准品稀释液
240ng/L
4 号标准品
150µl 的 5 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
120ng/L
3 号标准品
150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
60 ng/L
2 号标准品
150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
11 封板膜
2张
6 显色剂 B 液
6ml×1/瓶
12 密封袋
1个
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
生长因子（NGF），再与 HRP 标记的神经生长因子（NGF）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标 抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并 在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的神经生长因子（NGF）呈正相 值），通过标准曲线计算样品中大鼠神经生长因
30 ng/L
1 号标准品
150µl 的 2 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl， 然后再加待测样品 10µl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 10 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。 操作程序总结：
注射用鼠神经生长因子说明书
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注射用鼠神经生长因子说明书注射用鼠神经生长因子具有促进神经损伤恢复的作用。
用于治疗视神经损伤。
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注射用鼠神经生长因子商品介绍通用名：注射用鼠神经生长因子生产厂家:舒泰神(北京)药业有限公司批准文号：国药准字Sxx0023药品规格：30μg/支药品价格：￥270元【商品名】苏肽生【通用名】注射用鼠神经生长因子【英文名】MouseNerveGrowthFactorforInjection【汉语拼音】ZhuSheYongShuShenJingShengZhangYinZi【成分】苏肽生主要成分系从小鼠颌下腺中提取纯化的神经生长因子(mNGF)，沉降系数2.5S，分子量13.5Kd，纯度≥98%，比活性≥5.0×105AU/mg蛋白。
成品中含5%甘露醇和1%人血白蛋白作保护剂。
【性状】苏肽生为白色或类白色疏松体或粉末。
按瓶标示量溶解后溶液应为无色澄明液体，不应有异物、混浊和沉淀。
加入2ml生理盐水或灭菌注射用水后迅速溶解为无色澄明液体。
【适应症】苏肽生具有促进神经损伤恢复的作用。
用于治疗视神经损伤。
【用法用量】1、临用前每瓶注射用鼠神经生长因子用2ml氯化钠注射液(或灭菌用水)溶解;2、肌肉注射，每次30ug，一日一次，3-6周为一疗程。
小儿用量一般为25ug/次，或遵医嘱使用。
【药代动力学】小鼠肌肉注射10μg/kg的125I-NGF血药浓度时间曲线符合二室开放模型，T1/2(?)为4.83hr，Tmax为O.71hr，Cmax为1.74ng/m1，生物利用度为52.7%。
胃、肠、肾等组织的浓度高，其次是心、肝、脾、颌下腺等组织，脑和脊髓等组织也有一定分布。
10 鼠神经生长因子
注射用鼠神经生长因子Zhusheyong Shu Shenjing ShengzhangyinziMouse Nerve Growth Factor for Injection本品系由健康小鼠颌下腺提取的生物活性蛋白质。
经分离、纯化后加入适宜稳定剂后冻干制成，不含防腐剂。
1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 小鼠颌下腺来源及采集2.1.1 采用体重为20克以上60-90日龄健康雄性小鼠，小鼠应符合清洁级动物相关要求（附录XXX）。
2.1.2 采用适宜方法处死小鼠，经局部消毒处理后摘取颌下腺，剔除其他组织后备用。
如需存放应冻存于-20℃以下，并规定保存时间。
2.2 原液2.2.1 提取采用适宜的方法将小鼠颌下腺破碎匀浆，离心取上清。
2.2.2 纯化采用经批准的方法进行纯化、病毒去除或灭活后即为鼠神经生长因子原液。
2.2.3 原液检定按3.1项进行。
2.3 半成品2.3.1 配制按成品规格配制，并加入适宜稳定剂。
2.3.2 半成品检定按3.2项进行。
2.4 成品2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装及冻干应符合“生物制品分装和冻干规程”及附录I A有关规定。
2.4.3 规格应为经批准的规格。
30μg(≥15000AU) /支18μg(≥9000AU) /支20μg(≥9000AU)/支2.4.4 包装应符合“生物制品包装规程“及附录I A有关规定。
2.5 病毒去除和灭活生产过程中应采用经批准的方法去除和灭活病毒。
如用灭活剂(如有机溶剂、去污剂)灭活病毒，则应规定对人安全的灭活剂残留量限值。
3 检定3.1 原液检定3.1.1 生物学活性依法测定（附录Ⅹxx）。
3.1.2 蛋白质含量依法测定（附录ⅥB第二法），应不低于0.1mg/ml。
3.1.3 比活性为生物学活性与蛋白质含量之比。
每1mg蛋白质应不低于5.0×105AU。
鼠神经生长因子原理
鼠神经生长因子原理鼠神经生长因子（NGF，Nerve Growth Factor）是一种神经营养因子，被认为对神经系统发育和维持有重要作用。
它最早是由利昂尼·阿维奇纳（Levi-Montalcini）和斯坦利·科恩（Cohen）在1952年共同发现，并获得了1986年的诺贝尔生理学或医学奖。
鼠神经生长因子的研究奠定了神经发育生物学的基础，也为后续的研究提供了重要的理论依据。
它的发现和研究对于理解神经系统的发育、再生以及一些与神经系统相关的疾病的治疗具有重要意义。
NGF的研究首先从一个观察开始。
利昂尼·阿维奇纳和斯坦利·科恩发现当离体培养的鼠胚胎神经节细胞被种在培养基中时，细胞会发生异常的增殖和分化。
他们提取了这种细胞培养基，并命名为鼠神经母细胞浸润素（nerve-mother-cell-制液，即鼠神经生长因子）。
这个发现在当时被认为是革命性的，因为在之前的研究中，人们认为神经元的发育是无需外界因素的。
进一步的研究揭示了鼠神经生长因子通过结合特异性受体在神经系统中发挥作用。
这个受体被称为酪氨酸激酶类型A（tyrosinekinase A receptor，TrkA）。
通过与TrkA受体结合，NGF可以触发一系列的细胞信号传递，促进神经元的生长和分化。
这说明了NGF在神经系统中的重要作用。
接下来的研究逐渐揭示了鼠神经生长因子的更多作用和机制。
研究人员发现NGF还可以促进神经元突起的生长和分支，促进突触形成和稳定，并调控神经元的存活和死亡。
它也被证明在神经损伤和神经退行性疾病的治疗中具有潜力。
事实上，一些研究已经尝试使用NGF 的外源性补充来治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默病等，取得了一定的进展。
此外，NGF不仅对神经元有影响，它还和其他细胞类型相互作用，如胶质细胞、免疫细胞等。
它在神经系统免疫调节、炎症反应和伤口愈合中也起到重要的作用。
总之，鼠神经生长因子的研究为我们揭示了神经系统发育和维持的重要机制。
鼠神经生长因子生物学活性测定法
附录Ⅹxx 鼠神经生长因子生物学活性测定法 第一法 鸡胚背根神经节培养法 试剂 （1）鼠尾胶 大鼠鼠尾用 75%酒精消毒后，分离出尾腱，剪碎，浸泡于 0.1%
100U(每步稀释不超过 10 倍)。在 96 孔细胞培养板中，做 3 倍系列稀释，共 8 个稀释度，每 个稀释度做 2 孔，每孔分别留 100μl 标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件 下进行。 测定法 TF-1 细胞株用完全培养液于 37℃、 5％二氧化碳条件下培养， 控制细胞浓度为 每 1ml 含 1.0× 105~5.0× 105 个细胞，传代后 24 小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预 温至 37℃。取足量 TF-1 细胞培养物，离心收集 TF-1 细胞，用基础培养液洗涤 3 次，然后 重悬于基础培养液配成每 1ml 含 6.0× 104 个细胞的细胞悬液，置于 37℃、5％二氧化碳条件 下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的 96 孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液 100μl， 于 37℃、5％二氧化碳条件下培养 66～72 小时。每孔加入 MTS 溶液 20μl，于 37℃、5％二 氧化碳条件下培养 3 小时。以上操作在无菌条件下进行。放入酶标仪，以 550nm 为参比波 长，在波长 490nm 处测定吸光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果： 供试品生物学活性（U/ml）=Pr×
Ds Es Dr Er
式中 Pr 为标准品生物学活性，U/ml； Ds 为供试品预稀释倍数； Dr 为标准品预稀释倍数； Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； Er 为标准品半效量的稀释倍数。
鼠神经生长因子
适应症， 正己烷中毒性周围神经病。
用法用量
本品用2ml注射用水溶解，肌肉注射。一天1次，每次1支，4周为一疗程，根据病情轻重可遵医嘱多疗程连续给药。
不良反应
1．无严重不良反应。临床试验中未发现有肝、肾、心脏等功能损害。 2．用药后常见注射部位痛或注射侧下肢疼痛（发生率分别为85%和29%），一般不需处理。 个别症状较重者，口服镇痛剂即可缓解。 3．偶见其它症状（如头晕、失眠等），发生率与安慰剂组比较无明显差别。
儿童用药， 因目前尚没有儿童应用本品的资料，故儿童用药请遵医嘱。
性状
本品为白色冻干疏松体。按瓶标示量溶解后溶液为无色澄明液体，不应有异物，混浊和沉淀。
药理毒理
药理作用： 大鼠体内试验结果表明：本品可改善由己二酮和丙烯胺造成的大鼠中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍，缩短神经-肌肉动作电位潜伏期，并提高神经-肌肉动作电位幅度。组织病理学检查结果表明，本品有减轻动物胫神经的髓鞘肿胀发生率和降低变性胫神经纤维数量等作用。以上结果提示本品可能有促进损伤神经恢复的作用。 毒理研究： 重复给药的毒性试验结果表明：1）Wistar大鼠肌注本品剂量分别为30μg/kg、60μg/kg和120μg/kg，连续给药12周，仅见120μg/kg剂量组的动物在给药28天后出现食欲减低，体重增长延缓，活动减少等。2）杂种犬肌注本品高剂量为17.8μg/kg，连续给药60天后，动物未见明显毒性反应。 上海种小鼠的一般生殖毒性、致畸敏感期和围产期毒性试验结果表明：剂量在高达200μg/kg时，对动物的生育力、胚胎器官形成及时F1代仔鼠的发育无明显的影响。
禁忌症， 对本品过敏者禁用。
注意事项
1．过敏体质者慎用。 2．本品加注射用水振荡后即可完全溶解，如有不溶的沉淀、混浊或絮状物时不可使用。 3．使用前应仔细检查药瓶，如有裂缝或破损等异常情况时不可使用。 4．用药过程中，如有任何不适症状及时与医生联系询问。
鼠神经生长因子临床应用研究
鼠神经生长因子临床应用研究神经损伤是临床上常见的一类疾病，包括外周神经损伤和中枢神经损伤等，给患者的生活质量带来了严重影响。
鼠神经生长因子（mouse nerve growth factor，mNGF）作为一种具有促进神经修复和再生作用的生物活性物质，在神经损伤的治疗中逐渐受到关注和应用。
本文将对鼠神经生长因子的临床应用进行详细探讨。
一、鼠神经生长因子的概述鼠神经生长因子是从小鼠颌下腺中提取的一种生物活性蛋白，其结构和功能与人体内的神经生长因子相似。
它能够特异性地与神经细胞表面的受体结合，激活细胞内的信号通路，从而发挥促进神经细胞存活、生长、分化和轴突再生等作用。
二、鼠神经生长因子的作用机制1、促进神经细胞存活在神经损伤后，神经细胞往往会受到缺血、缺氧、氧化应激等因素的影响，导致细胞凋亡。
鼠神经生长因子可以通过抑制凋亡信号通路，增强细胞的抗凋亡能力，从而提高神经细胞的存活率。
2、诱导神经细胞分化对于未成熟的神经前体细胞，鼠神经生长因子能够促进其向神经元或神经胶质细胞分化，增加神经细胞的数量和种类，为神经修复提供细胞基础。
3、促进轴突再生轴突是神经细胞传递信号的重要结构，在神经损伤后轴突的再生对于神经功能的恢复至关重要。
鼠神经生长因子可以刺激轴突的生长和延伸，引导轴突向正确的方向生长，并促进轴突与靶细胞建立有效的连接。
4、调节神经递质的释放神经递质在神经信号传递中起着关键作用。
鼠神经生长因子能够调节神经细胞内神经递质的合成、储存和释放，改善神经细胞之间的信息传递，从而促进神经功能的恢复。
三、鼠神经生长因子在临床中的应用1、外周神经损伤外周神经损伤常见于外伤、压迫、炎症等情况，如臂丛神经损伤、坐骨神经损伤、面神经麻痹等。
临床研究表明，在外周神经损伤后早期应用鼠神经生长因子可以促进神经再生和功能恢复，缩短恢复时间，提高恢复效果。
患者的感觉、运动功能以及神经电生理指标均有明显改善。
2、中枢神经损伤中枢神经损伤如脑梗死、脑出血、脑外伤、脊髓损伤等，往往会导致严重的神经功能障碍。
注射用鼠神经生长因子说明书
注射用鼠神经生长因子以下内容仅供参考，请以药品包装盒中的说明书为准。
注射用鼠神经生长因子说明书【说明书修订日期】核准日期：2010年05月07日修改日期：2010年09月11日2011年11月20日2013年11月20日【药品名称】注射用鼠神经生长因子【英文名称】Mouse NerveGrowth Factor for Injection【汉语拼音】Zhusheyong ShuShenjing Shengzhang Yinzi【成份】本品主要成份为从小鼠颌下腺中提取的神经生长因子，是一种分子量为13.5Kd的活性蛋白。
另外还含有非活性成份甘露醇和人血白蛋白。
【性状】本品为白色或类白色冻干块状物或粉末。
加入注射用水后应迅速溶解为无色澄明液体。
【适应症】用于治疗视神经损伤。
本品通过促进神经损伤恢复发挥作用。
【规格】每瓶含鼠神经生长因子(mNGF)30μg，生物活性≥15000AU。
【用法用量】临用前每瓶用2ml氯化钠注射液(或灭菌注射用水)溶解。
肌肉注射，每日30μg(一瓶)，一日1次，3～6周为一疗程。
【不良反应】临床试验中发现有注射局部疼痛、偶见荨麻疹及中性粒细胞增加。
注射局部疼痛的发生率在对照组为10.68%，治疗组为12.38%，停药后可自行缓解，一般不需要特殊处理。
荨麻疹可自行恢复，或给予抗过敏治疗。
未见其它不良反应。
【禁忌】对本品过敏者禁用。
【注意事项】1、过敏体质者慎用。
2、使用前应仔细检查药瓶，如有裂缝或破损等异常情况时不得使用。
3、本品在加入氯化钠注射液(或灭菌注射用水)轻微震荡后即可完全溶解，如发现有不溶的沉淀、混浊或絮状物时不得使用。
4、用药过程中如有任何不适应症状，请及时与经治医生联系。
【孕妇及哺乳期妇女用药】因本品临床前试验显示对母鼠泌乳有抑制作用，故孕妇、围产期及哺乳期妇女慎用或遵医嘱。
【儿童用药】儿童患者用药的安全有效性尚未确立。
【老年用药】在本药的研究中尚无65岁以上病人用药的资料。
注射用鼠神经生长因子研制
注射用鼠神经生长因子研制
沈心亮;应莲芳;翟雷;蒋琳;卜晓萍;王军志;饶春明;谢溱
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2003(032)002
【摘要】@@ 神经生长因子(NGF)是一类能促进神经生长的多肽类生物活性特质.国内外许多研究证实NGF具有维持交感神经和感觉神经的生存、影响中枢神经元生长、促进神经细胞的分化、判定轴突生长等方面的生物学功能.我们把鼠神经生长因子作为一种非常有希望的临床药物进行开发,作为国家一类新药进行申报,其完成研究资料40余项,分为生产工艺和检定方法、稳定性试验、临床前药理、临床研究等四个方面.
【总页数】2页(P27-28)
【作者】沈心亮;应莲芳;翟雷;蒋琳;卜晓萍;王军志;饶春明;谢溱
【作者单位】兰州生物制品研究所130046;中国药品生物制品检定所
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.注射用鼠神经生长因子对缺氧缺血性脑病患儿神经功能及内源性神经生长因子的影响 [J], 冯姝华;杜江华;王应云;冯毅
2.注射用鼠神经生长因子联合丁苯酞软胶囊对脑梗死恢复期患者神经功能及D二聚体、血栓素B2水平的影响 [J], 樊恺
3.注射用鼠神经生长因子联合丁苯酞软胶囊对脑梗死恢复期患者神经功能及D二
聚体、血栓素B2水平的影响 [J], 樊恺
4.针灸联合注射用鼠神经生长因子对脑卒中患者认知水平及神经功能的影响 [J], 张斐雪;郑书林;张锡萍;蹇睿;杨敏;段小东;陈利莎
5.注射用鼠神经生长因子治疗糖尿病周围神经病变的临床效果 [J], 田雄涛;李洁;叶欣;刘晓宇
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鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法[发明专利]
![鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a858c3726bec0975f565e207.png)
专利名称：鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：熊玲媛,任宏伟,孙朗,陈远志,马凌燕,杨佑瑶
申请号：CN200810071315.X
申请日：20080627
公开号：CN101613394A
公开日：
20091230
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种鼠神经生长因子(NGF)的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法。
本发明中的鼠神经生长因子的制备方法在传统工艺中加入100KD和5KD超滤膜过滤和巴氏消毒工艺，可有效过滤大分子病毒，同时通过巴氏消毒法进一步灭活伪狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、脑心肌炎(EMC)病毒等潜在病毒，既不引入任何外来有机溶剂和去污剂等污染物，又能保持鼠神经生长因子的高纯度、高比活及高安全性。
申请人：熊玲媛,任宏伟,厦门北大之路生物工程有限公司
地址：361000 福建省厦门市金尚路80号北大生物园
国籍：CN
代理机构：厦门市首创君合专利事务所有限公司
代理人：张松亭
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本发明涉及生物工程技术制药领域，特别是一种鼠神经生长因子(NGF，Nerve
Growth Factor)的制备方法。
现有技术中，鼠匀浆液经反复冻融去脂离心后，取上清液直接上柱。这样匀
浆上清液因含脂较多，很容易堵塞柱介质，使得上样流速逐渐变慢，甚至堵塞，
I)高流速琼脂糖阳离子交换剂(Cu—PF)(I)柱层析
(1)装柱
装柱前应检查垫圈密封性，上下连接管完好，并用无热原水试柱。密封时上
下流速应一致。将检查完好的柱子垂直固定于支架上，打开上盖，夹紧下管，倒
入无热原水约10—15 cm柱高，打开下管排出气泡至余2 cm柱高，用两倍于装
柱下部有被抽干现象，给层析和介质再生带来很大困难。另外，目前鼠神经生长
因子的制备采用的是羧甲基纤维素阳离子层析介质(CM-52)，在使用过程中，此
介质线性流速慢，一般使用的速度为20 cm／h，这种速度在实验室制备中尚可
使用，若用于规模化生产，就会使生产周期过长，而鼠神经生长因子的制备又受
温度的限制，因此，过长的生产周期不但会影响生产效率，而且还会给生产过程
入20g CDR，静置5分钟，布氏漏斗抽滤，收集去脂滤液包透析袋，4℃条件下对
o．02 mol／L pH：6．8的磷酸二氢钠一磷酸氢二钠缓冲液(PB)透析24小时，12
小时换一次液，拆袋取透析内液置于烧杯内待用，透析液与滤液总量的比例为
10：l。 ．
采用高流速琼脂糖阳离子交换剂(Cu—FF)进行西次柱层析。具体方法是：
用CDR去脂过滤，收集滤液对O．02 mol／L PB透析24小时，透析液上CM—FF(I)
柱，收集流穿液透析，酸解液上CN—FF(II)柱。解离收NG[’样。
1 NGF的粗制
l。l鼠颌下腺匀浆液的制备
取出冷冻的颌下腺，融化后，加入5—7倍预冷的灭菌无热原水，放入匀浆
器中匀浆，放入量随匀浆器容积பைடு நூலகம்小而定，一般为容积的1／3，30秒／次，转速
(3)酸化解离
Cn—FF(I)柱的流出液用透析袋包袋，每袋90—100 m1，以pu 6。8，0．25
m m。l／L PB透析24 h．流出液与缓冲透析液比例为1：10，其间换液1—2次。
收集透析袋内液体，按总量的1／9加入pu 4．0，0．5 mol／L的醋酸-醋酸钠缓
冲液(AB)，同时加入干烤的分析纯氯化钠(NaCl)至终浓度为0．4真，，。l／L，4℃放
衡后泵入酸解上清液，流速100 ml／h．cm’，上样完毕，继用ABS洗柱至基线。
再用两个以上柱床体积的pH 4．o AD洗柱。用pH：9．0的0．05，I101／L三羧
甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液(Tris—C1)洗脱杂蛋白，待杂蛋白洗脱至基线后，用
pH：9．O的o．05 mol／L Tris—Cl，并加入干烤NaCl至终浓度达o．4 mol／L
为10000转／分(rpm)，间隔30秒，共3次，匀浆后的悬液分装入处理好的塑
料瓶，在-20℃以下低温与室温反复冻融3—4次。
1．2 NGF的粗制
取出经冻融的匀浆液，4"C8000 rpm离心1小时，上清液用漏斗铺脱脂棉过
的缓冲溶液洗脱并收集目标蛋白峰即为NGE’原液。
本发明通过使用CDR去脂，既提高了层析介质的使用效率，又提高了蛋白收
量。采用CM—FF柱层析，线性流速可达200 cm／h，流速快，大大缩短了生产周
期，适用于规模化生产。
下面详细描述一下鼠神经生长因子的制备过程：
鼠颌下腺经匀浆后，匀浆液反复冻融，冻融液8000 rpm离心1小时，取上清
置10分钟，8000 rpm离心40分钟，取上层清液。
(Ⅱ)高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM—FF)(II)柱层析
装柱同CM—FF(I)柱，装柱量一般1000对鼠颌下腺装量100 ml。水洗两
个柱床体积后，以pH 4．O，0．05 m01／L AB加O．4 lIl01／L NaCl (ABS)平
带来很多难以克服的困难。
本发明的目的是针对现有技术中的不足而提供的一种采用细胞碎屑清除剂
(CDR)去脂及高流速琼脂糖阳离子交换剂(CN-FF)柱层析的方法来制备鼠神经生长
因子，它可提高产品纯度和工效。
实现本发明目的的具体技术方案是：
鼠颌下腺经匀浆后，匀浆液反复冻融，冻融液8000 rpm离心1小时，取上清
柱介质的无热原水将介质稀释成糊状，沿壁缓慢加入柱中自然沉降至所需高度。
装柱后，先以约两个柱床体积无热原水洗涤。线性流速100m1／h．cm’，然后用约4倍柱体积的pH 6．8的0．02 mol／L PB在100 ml／h．cm’的速度平衡层
析柱。
(2)仪器调整与上样
在层析柱用上样缓冲液平衡的条件下，打开紫外检测仪与记录仪，预热半小
时。将层析柱出口管与紫外检测仪、记录仪相连，待检测仪基线走稳后调零点、
量程、灵敏度、电压及走纸速度，调好后即可上样。以100 ml／h。cm’的流速
上样，待记录仪上有蛋白峰出现时，收集流出液。上样完毕，继用pH=6．8的o．02
mol／L門流洗，直到流出液A 280砠<o．05为止(通常为下降至水平基线)。
用C1)R去脂过滤，收集滤液对0．02 mol／L PB透析24小时，透析液上Cu—FF(I)
柱．收集流穿液透析，酸解液上CM-FF(Ⅱ)柱，解离收NGF样。
特点是冻融液经离心后采用CDR去脂，具体方法是：取出经冻融的匀浆液，4
℃8000 rpm离心1小时，上清液用漏斗脱脂棉过滤，滤液加入CDR，100 m1加