大学生物化学课件 基因工程

（二）工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ
Taq DNA聚合酶
逆转录酶 T4 DNA连接酶
限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease, RE)
定义 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围 切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
（一）质粒（plasmid）：
存在于细菌染色体外的小 型 环 状 双 链 DNA 分 子 ， 可在宿主细胞中自主复制， 并在细胞分裂时传给子代。
质粒感染细菌后，会赋予宿 主细胞一些遗传性状（如对 青霉素或重金属的抗性)可作 为筛选转化子细菌的根据。
pBR322质粒(4361bp) : 主要包括：
GCCTAG+
GATCC G
切割DNA后产生含5’磷酸和3’羟基的末端
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
平端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
+
GAC CTG
粘端切口
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
（三）外源基因与载体的连接
典型插入序列：750-1500 bp DNA片段 包括：两个分离的反向重复（IR)序列;
IR侧翼有短的正向重复序列; 及 一个转座酶编码基因.
保守性转座：插入序列从原位迁至新位.
复制性转座：插入序列复制后，其中一个复制本迁至 新位，另一个保留在原位.
（二）转座子(transposons)转座 可从一个染色体位点转移至另一位点的分散
此过程往往发生在一个特定的短的（20～ 200bp ) DNA序列内（重组位点），并且有特 异的酶和辅助因子对其识别和作用。
三、转座重组
有些基因可以从一个位置移动到另一位置.
可移动DNA序列包括：插入序列、转座子
由插入序列和转座子介导的基因移位或 重排称为转座。
（一）插入序列(insertion sequences，IS)转座
转入受体菌
筛 扩增或表达
筛选重组体
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA
限制酶消化
开环载体DNA
cDNA 人工合成 PCR产物
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
‘有目的’-基因工程
第一节 DNA的转移和重组 （DNA transfer snf recombination)
DNA重组包括： 同源重组（homologous recombination) 特异位点重组（site-specific recombination) 转座重组（transpositional recombination)
克隆（clone）： 来自同一始祖的相同副本或拷贝（copy）的 集合。
重组DNA 技术 （recombinant DNA） 又称基 因克隆（gene cloning）
完整DNA克隆过程包括： ①目的基因获取； ②基因载体选择、构建； ③目的基因与载体拼接； ④重组DNA分子导入受 体细胞； ⑤筛选重组体 ⑥目的基因的表达。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ
AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
A+
TCTAG
GATCT A
•酶不同、识别序列 相同，产生相同的粘 性末端，称为同功异 源酶。
•酶不同、识别序列 不同，产生相同的粘 性末端，称为同尾酶。
（二）DNA聚合酶
1. DNA pol I：
扩增或表达
（六）克隆基因的表达
1 克隆基因在大肠杆菌中表达 2 克隆基因在哺乳动物细胞中表达
思考题：
1．自然界常见基因转移及重组现象有哪些？ 2．DNA克隆技术基本步骤？ 3．常用的工具酶切割方式有几种？ 4．外源DNA和载体DNA连接方式的区别？ 5．常见的重组体的筛选方式分类？插入失活和阿
原位杂交 Southern印迹
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
(
四环素抗性基因 （Tetr）失活
α
互
补
α片段
α片段
的
检 测
ω 片段
ω片段
原 位 杂 交
小结
重组DNA技术操作过程可形象归纳为
分
分离目的基因
切
限制酶切目的基因与载体
接
拼接重组体
转
受体菌条件 安全宿主菌，由大肠杆菌K12改造， 在人的肠道几乎不能存活。 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)
导入方式 转化 (质粒DNA分子导入细菌的过程） 转染 (噬菌体、病毒携带DNA分子导 入宿主细胞的过程)
（五）重组体的筛选
1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法
2. klenow 片段： 3. Taq DNA pol PCR反应
（三）DNA ligase
DNA相邻的5’-P和3’-OH之间形成磷酸二酯键， 切口封合或片段连接。
1、 T4 DNA ligase ：催化相同黏性末端或平 头末端的DNA分子的连接。
2、大肠杆菌DNA ligase :催化相同黏性末端 的连接.
①限制性内切酶位点（插入 外源基因）；
②含有terr、ampr抗药基因， 可作为筛选标志。
③ 含 有 复 制 起 始 点 ori （ 赋 予
其复制特性）。
4361bp
M13噬菌体： M13mp系列 pUC系列
pUC质粒:加入E.coli的LacZ的N端146个AA残基的编码
基因，编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。
的重复序列，即一段可以发生转座的DNA。
组成：侧翼为两个分离的反向重复序列； 转座酶基因； 抗生素抗性等有用的基因。
第二节 重组DNA技术
基因工程（genetic engineering），也叫基因操 作、遗传工程，或重组DNA技术。 它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送 到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖 （称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表 达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学 技术。
二、基因工程的载体
定义 vector 为携带外源DNA进入宿主细胞（无性繁殖或 表达）的工具（DNA分子）。
常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成
1. 粘性末端连接
同一限制酶的酶切: 重组子、载体自连、目的基因自连
不同限制酶的酶切： 重组子
同一限制酶的酶切：
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
目录
两个不同限制酶的酶切 ： 使目的DNA按正确的方向插入
（四）重组DNA导入受体菌基Fra bibliotek重组与基因 工程
1、基因重组：指不同来源的DNA在细 胞内重新进行组合，并能进行复制、转 录、翻译的过程。 2、基因工程：在体外用人工的方法进 行基因的重新组合，再把重组基因导入 到细胞或细菌内进行复制、转录、翻译 的技术。
第一节 自然界的基因转移和重组
‘无目的’-自然界的基因转移和重组
自然界不同物种和个体之间的基因转 移和重组是经常发生的，它是基因变 异和物种演变、进化的基础。
尔法互补原理？
6．基本概念：同源重组、转座子、DNA克隆、 限制性核酸内切酶、粘性末端、钝性末端、配伍 末端、基因组DNA、cDNA、基因诊断、 基因治疗
G+
CCTAG
GATCC G
异源同功酶，同裂酶
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
同尾酶 酶不同、识别序列不同，但切割DNA后， 产生相同的粘性末端，称为同尾酶。 这两个相同的粘性末端称为配伍未端 (compatible end)。
一、同源重组（基本重组）
发生在同源序列间的重组，它通过链的断 裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进 行单链或双链片段的交换。
为最基本的DNA重组方式，在原核、真核生 物均发生。
二、位点特异性重组（site - specific recombination）
由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点 间发生的整合称～。
Lac－E.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的ω 片段.
单独存在的α或ω片段均无活性，只有宿主细胞与克隆 载体同时共表达两片段，宿主细胞才有β半乳糖苷酶活 性，使特异底物产生蓝色化合物（α-互补)。
（三）目的基因：感兴趣的基因或DNA序列。
目的基因，又称目的DNA