关于人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建

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噬菌体展示技术和其应用ppt课件

噬菌体展示技术和其应用ppt课件

2024/3/30
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应用举例:
部分做过的工作
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一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库,不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法,从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因,将轻链基因插 入pCOMb3载体中,得人轻链质粒库;从乙肝表面抗 体(HBsAb)的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段,然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合,得到Fd基因片段,再将其插入轻链 质粒库中,得半合成人Fab质粒库。
成3节段
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M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同,T7是裂解性的,其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端,可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
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34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下,繁殖出表算出κ+Fd(包括CDR3-5个菌落,涂格,过夜培养后菌落PCR: 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60%左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落,涂为70%。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大,而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。

抗体文库构建方法

抗体文库构建方法

抗体文库构建方法
抗体文库构建的方法主要包括以下步骤:
1. 免疫动物:选择适合的动物,如年轻、健康的动物,进行免疫。

通常在2个月的时间跨度内,动物被注射4-8次目标抗原和佐剂的混合物。

每次注射约50-200μg免疫原,确切数量取决于抗原分子量、免疫原性和/或毒性。

2. 淋巴细胞提取:免疫接种后,取抗凝血(通常来自颈静脉,也可以是淋巴结活检),制备淋巴细胞。

3. mRNA提取:提取淋巴细胞的mRNA。

4. cDNA合成:将mRNA转化为cDNA。

5. VHH基因扩增:使用两步巢式PCR扩增VHH基因。

6. 构建抗体库:将VHH基因与适当的表达载体(如噬菌体或酵母)连接,转化宿主细胞,建立抗体库。

7. 筛选抗体:通过各种筛选方法(如抗原亲和筛选、免疫沉淀等)从抗体库中筛选出目标抗体。

8. 抗体优化:通过亲和力成熟、突变引入等方法对筛选出的抗体进行优化,提高其亲和力和特异性。

9. 抗体表达与纯化:将优化的抗体基因转染到适当的表达系统中,表达并纯化抗体。

10. 抗体表征:对纯化的抗体进行表征,包括亲和力、特异性、免疫原性等方面的分析。

以上步骤仅供参考,建议咨询专业人士获取准确信息。

噬菌体展示技术的原理及应用

噬菌体展示技术的原理及应用

8、 DNA结合蛋白:
锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物,这些结 构含有锌,能用于构建一个大的蛋白区域,去识别 和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用 于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指 的多肽库。利用这个多肽库,可以研究有关氨基酸 序列与 DNA 结合位点之间的识别规则,可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达,比如抑制小鼠细胞 系中的癌基因,也可以启动表达质粒的基因,或干 扰病毒感染插入的片段是从 某些组织或细胞中抽提的mRNA 的互补DNA 片 段,它用来筛选与受体特异性结合的片段。一般可 利用M13 噬菌体或其他表 达一部分真核蛋白,而M13 噬菌体和其他E. coli噬 菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明,没有一 个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论 如何,噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质 之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展 示提供了一个应用免疫学方法进行酶:
例:碱性磷酸酶,蛋白水解酶类,等等
6、底物与抑制剂:
主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7、信息传递研究:
利用噬菌体展示多肽库,发现了一些受体,如 凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体;受体的配体, 如血管促生素、 αbungarotoxin, 和一些大蛋白分子中的折叠区域, 如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离 到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的 多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的 高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体 信息的情况下,用完整细胞和组织或动物,可筛 选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
一、发展简史

Dulbecco等提出了在病毒表面展示外源抗原 决定簇和肽的概念。 1985年Smith — 首次利用基因工程技术将 EcoRⅠ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与 pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增 生,表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面,并提出通过构建随机 肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选 溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一 个广泛应用的时代。

人源化单克隆抗体的构建技术

人源化单克隆抗体的构建技术

人源化单克隆抗体的构建技术摘要:单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。

其中人源化抗体是一个重要的里程碑,并伴随着一系列重大的技术革新,如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。

抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。

本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。

关键词:人源化,单克隆抗体,构建从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。

单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原,甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。

然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的,而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题:一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统;二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody,HAMA);三是在人体循环系统中被很快清除掉。

因此,在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。

随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。

1989年Huse等首次构建了抗体基因库,从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平,并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。

至此,抗体的产生技术经历了三个阶段:经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。

人源化抗体就是指抗体的可变区部分(即Vh和Vl区)或抗体全部由人类抗体基因所编码。

人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。

人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。

生物技术制药课后习题答案

生物技术制药课后习题答案

第一章绪论1生物技术是以生命科学为基础,利用生物体(或生物组织、细胞及其组分)的特性和功能,设计构建有预期性状的新物种或新品系,并与工程相结合,进行加工生产,为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。

2生物技术的主要内容:P1基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程蛋白质工程:运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。

染色体工程:探索基因在染色体上的定位,异源基因导入、染色体结构改变。

生化工程:生物反应器及产品的分离、提纯技术。

3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件,借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题第二章基因工程制药1、简述基因工程制药的基本程序。

P162、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。

P15第一段第一行3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆?P18(7目的基因cDNA的分离和鉴定)①核酸探针杂交法用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质,氨基酸测序,按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸,用做探针,与cDNA文库中的每一个克隆杂交。

这个方法的关键是分离目的蛋白,②免疫反应鉴定法(酶联免疫吸附检测)4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。

①原核基因表达产物多为胞内产物,必须破胞分离,受胞内其它蛋白的干扰,纯化困难;②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusion body),必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性,工艺复杂;③没有翻译后的加工机制,如糖基化,应用上受到限制;④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸,因无加工机制,常造成N-Met冗余,做为药物,容易引起免疫反应;⑤细菌的内毒素不容易清除;⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化;5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性?蓝藻:很有前途的药物基因的宿主细胞①有内源质粒,美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒,可用做基因载体。

噬菌体展示文库的筛选技术 2005

噬菌体展示文库的筛选技术 2005

噬菌体展示文库的筛选技术李丽芳 张映(山西农业大学动物科技学院,太谷 030801)摘 要: 噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PD T )是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。

该技术作为筛选与多种靶分子(如抗体、酶类、细胞表面受体等)具有特异性亲和力或活性的肽的一个有效方法,自问世以来,已取得了很大的发展,并被广泛地应用于基因治疗、基因疫苗研究、抗原表位研究、药物设计、研究细胞信号传导等领域[1]。

但该技术在两方面仍需进一步完善:(1)寻求更为有效的表达载体;(2)进一步完善筛选方法。

关键词: 噬菌体 肽库 抗体库 筛选The Selection T echniques of Phage Display LibrariesLi Lifang Zhang Y ing(A ni mal S cience and Technolog y Depart ment of S hanx i A g ricult ure Universit y ,S hanx i Tai gu 030801)Abstract : Phage Display Techniques (PD T )is a biotechnique used for screening and reconstructing functingal polypeptide.It ,s a effective method of select the peptide which has high affinities to many given targets (such as an 2tibody ,Enzyme ,surface receptor of cell ).It has been made much progress and are widely used in many fields ,such as genetic treatment ,the study of genetic vaccine ,epitope mapping ,drug discovery after its appearance.But it has to get more perfact in two sides :(1)Seek more effective expression vector ;(2)G et more perfect selection methods.Many selection methods are reviewed in this article.K ey words : Phage Peptide library Antibody library Selection 噬菌体表面展示技术是一种将外源多肽或蛋白质的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。

噬菌体展示技术

噬菌体展示技术
噬菌体展示技术 (Phage display Techniques)
内容
1 2 3
• 噬菌体展示技术简介
• 噬菌体展示技术的过程 • 噬菌体展示技术的应用 • 噬菌体展示技术的展望
4
1
• 噬菌体展示技术简介
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编 码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框 正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的 情况下,使外源蛋白或多肽与外壳蛋白 融合表达,融合蛋白随子代噬菌体的重 新组装而展示在噬菌体表面。
不可否认,目前噬菌体展示技术尚存在某些不 足,需要改进,如外源性多肽的折叠、库容量 的限制、筛选过程中阳性克隆的丢失及假阳性 克隆的获得等。但随着该技术的不断发展,越 来越多的具有良好生物活性的化合物会被发现 并得以鉴定,为新药的开发不断注入新的活力。 可以预测,功能基因组学、蛋白组学和噬菌体 展示技术三者的融合会不断为药学生物技术创 造新的概念,提供新的策略。基于机器人技术的 高通量筛选系统及其他对策的发展,期待噬菌 体展示技术能在寄生虫病诊断、致病机制研究、 疫苗开发、药物研制领域中开创一片新天地。
coated microtitre wells
Wash to remove unbound phage particles.
Elute bound phage
2.3 Amplify eluted phage
感选
3
• 噬菌体展示技术的应用
3.1 3.2 3.3 3.4 噬菌体抗体库技术 测定抗体的抗原决定簇 筛选酶抑制剂 构建cDNA3.2 测定抗体的 抗原决定簇
3.3 一步确认 确认插入片段种类
4
• 噬菌体展示技术的展望
随着噬菌体展示技术的不断成熟和完善,它 在生物学领域和医学领域取得的成就日益突出 ,尤其是为新药的开发拓宽了道路。运用噬菌 体展示技术筛选功能性的多肽,由此作为多种 人体生长因子的活性模拟表位,或作为受体新 型配体,已经成为当今世界医药领域最热门的 课题之一。通过噬菌体展示技术体外筛选具有 治疗活性的人源的scFv ,则以其分子量小、穿 透力强、易于大量生产等特点展示了极好的应 用前景,从而进一步加快了生物药学的发展进 程。

噬菌体表面展示及其应用

噬菌体表面展示及其应用

Solid phase selection with immunotubes
Immunotube coated with antigen
coated with
steptavidin and
biotinylated antigen
B
v v
B
B
B
BB
B
Solution phase selection with biotinylated antigen
用于外表展示的噬菌体
• 3种常用于外表展示的噬菌体为 M13, F1 , FD• 利用病毒粒子外表蛋白构建多肽,每 个噬菌体能展示一个任意的多肽
噬菌体外表展示的筛选• 利用筛选技术能从 噬菌固定靶 蛋白/多肽
• 利用DNA测序的优 势,很容易就能鉴 定目的蛋白/多肽的 序列
感染 和扩增
E.coli
噬菌体抗体库的构建
Antibody IgG structure
Fab
VL
CL VH
CH1
Fc
CH2
CH3
Hinge
(Fab’)2
Membrane Extension
Fv
VL
VH
CL
CH1
CH2 CH3
VL
Fv VH
VL
scFv
VH
宿主细胞: 筛选范围 : 107 109 时间: 操作: 单
antigen biotin
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
去除未结合的噬菌体病毒粒子.
洗脱结合的噬菌体
Amplify eluted phage
Repeat selection

噬菌体展示载体的构建

噬菌体展示载体的构建

噬菌体展示载体的构建中国药科大学JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2002,33(6):529,532529 噬菌体展示载体的构建吴国球,沈子龙.(中国药科大学生物技术中心,南京210009)摘要目的构建适宜噬菌体展示的载体系统.方法利用pCOMB3的LacZ强启动子,Pelb引导序列,包膜蛋白?基因,用NHeI—XbaI双酶切,切除一个克隆位点;同时设计一对引物,用PET一28(a)作模板扩增550bp片段,插入XhoI—SpcI位点之间,扩增质粒后用限制性内切酶,PCR,DNA测序等方法作鉴定.结果切除了272bpNHeI—XbaI片段,插入片段后酶切鉴定显示:XhoI,SpcI单酶切,XbaI,NheI无酶切;所构质粒用Xhol+SpcI双酶切及PCR扩增均可见550bp片段;测序结果正确.结论成功构建了一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的噬菌体展示载体.关键词噬菌体展示;构建;载体中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1000—5048(2002)06—0529—04 噬菌体展示文库在新药开发领域,尤其在全人源化单克隆抗体方面为扩展生物多样性提供了强大的研究工具[】].它能容纳超过上百万个单个分子的克隆,因此又称全套基因库,可以通过受体与配体,抗原与抗体相结合的特性,从中筛选出目的基因克隆,使目的基因能在很短的时间内(数周)高效克隆,筛选和表达[2].文库的大小是决定生物多样性的关键.因此构建一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的载体具有十分重要的意义.l材料和方法1.1材料pCOMBs质粒,XL1一blue菌株(东南大学基础医学院张建琼博士惠赠),PET一28(a)质粒,JM109菌株(本实验室保存),限制性内切酶NheI,XbaI,SacI,SpeI,XhoI(Mm),T4连接酶,琼脂糖,EDTA, DNA回收试剂盒等(上海生工),LB,SOC按常规方法配制,PCR仪(AmpGene4800),电泳仪(北京六一仪器厂).引物:P1:5'-GGGCCAACTCTAGTATGGCCC一3' 下划线为XhoI酶切位点P2:5'-GG垒!垒!CTAACCAGCAC'ITCAGTGGGAA一3' 下划线为SpcI酶切位点Ck 连宝生物工程公司合成) 1.2方法收稿日期2002—04—17通讯作者Tel:025—3271389 1.2.1pCOMB3的扩增含pCOMB3的XL1一blue 接种于四环素(50mg/L),氨苄青(100mg/L)双抗平板,37?过夜培养,挑单个菌落,接种l0ml的LB 液体增菌培养液,37~C6h,摇至ODeoo为0.36,按常规方法抽提质粒:按每毫升菌液l00lI液(50mmol/LGlucose,25retool/LTris—HC1,l0retool/L EDTA),200l?液(0.24mmol/LNaOHl00l, 5SDSl001),l50l?液(3mmol/LK.Ac,2.5 mmol/LHAc)混匀,12000r/min5min,吸取上清液,等体积酚:氯仿抽提一次,上清液加两倍体积的无水乙醇,4?放置10min,12000r/min离心5min,弃上清,沉淀挥干后,加无菌水20l,一20.C保存备用.1.2.2片段切除及剩余片段的连接pCOMBsl0l, 加l0×buffer4l,去离子水34l,NheI,XbaI各1.0 l,37?酶切2h,回收片段,20l水溶.取5l加l0× ligationll,去离子水3.5l,T4连接酶0.5l,16?连接过夜.1.2.3感受态细胞制备及转化XL1一blue单菌落接种于100mlLB(含氨苄青100mg/L),37?摇至 OD600为0.4,8000r/min2min收集菌液,按每毫升菌液加0.5mol/LCaCI2lOOgd,冰上放置30min,8000r/min20min,弃上清,沉淀用相同浓度CaC1z悬浮菌液,lOOp1分装,加l0甘油,一70?保存.取连接液 5l,加入lOOpl感受态细胞,冰上放置30min,42?530中国药科大学33卷热激90s,加入预热SOClml,37?摇45min,涂布于四环素(50mg/L),氨苄青(100mg/L)双抗平板,同时设阴,阳性对照,37?过夜,随机挑选单菌落扩大培养,抽提质粒,分别用NheI,XbaI,SacI,SpeI,酶切检查,0.8琼脂糖l00v/50mA电泳40rain,EB染色,观察结果.阳性质粒命名为Pa.1.2.4插入片段的制备1.2.4.1插入片段的扩增PET一28(a)质粒抽提后,取ll加l0×buffer3l,P13~1(50pmo1),P23~1(50pmo1),Taq酶0.5l,dNTPll,加D2o至 30l,加一滴矿物油,94?变性5min 后执行94? 变性lmin,45?退火lmin,72?延伸lmin循环程序,25个循环后72?延伸10min,同时设阴,阳性对照.PCR产物用1.2琼脂糖电泳检查,切下 550bp条带.每l00mg琼脂糖加400lBinding buffer,50?放置2min,转移至离心柱,8000r/min lmin,弃废液后加Washsolution450ml,8000r/minlrain,弃废液,重复一次,12000r/min,开盖离心lmin,在柱中央加20lD2O,12000r/min2rain,一20?保存.1.2.4.2酶切取"1.2.3"酶切鉴定阳性质粒及550bpPCR回收片段各l01分别加l0×buffer2 l,D207l,SpeIll,37?酶切4h,65?20min灭活;补加10×buffer2.3l,XhoIll37?继续酶切4h,1.5琼脂糖电泳,按"1.2.4.1"方法回收相应片段.1.2.4.3连接及转化取回收片段各4l加T4liga sell,l0×T4ligationll,16C连接过夜,全量转化XL1一Blue感受态细胞,42?热激后涂布于氨苄,四环素双抗平板,37?过夜.挑单菌落接种于双抗LB,37.C6h,抽提质粒,1.5琼脂糖电泳检查. 1.2.5PCR及酶切位点检查取质粒ll,加引物Pl,P2各3l,Taq酶0.5l,dNTPll,l0×buffer2l, 补加DzO至20l,l滴矿物油,按"1.2.4.1"PCR程序25个循环,1.2琼脂糖电泳观察结果.取PCR 阳性质粒5l,加入l0×bufferll,D2O3l,SpeIll,37?酶切4h,65?20min灭活;补加l0×buffer 1.1l,XhoIll37?继续酶切4h,1.5琼脂糖电泳,EB染色,观察结果.阳性质粒命名为Pa. 1.2.6载体测序测序引物为5一TTACTCGCTGCCCAACCAG一3',引物距XhoI位点尚有20个碱基,采用ABIPRISM377DNA2结果1)第二个克隆位点的切除pCOMB3用NheI+XbaI双酶切,可见272bp条带,切除上述片段后,将剩余大片段回收自连后转化并抽提质粒,分别用NheI,XbaI,Spel,XhoI酶切检查,结果显示:Xbal,NheI无酶切,SpeI,hoI可见单酶切条带,酶切位点正确(图1).3800bp————一272bp————一I,2:Nhel,Xbalseparatelyanalysis;3,4:Spel,Xholseparatelyanalysis;5:Nhel+Xbalanalysis;6:pCOMB3;7:kphageDNA/Hind I+IKbDNAL~der.Fig1.Restrictionenzymeanalysisofplasmid 2)片段插入PET一28(a)作模板PCR扩增后,可见550bp条带,回收片段后与相同酶切的Pa载体连接,转化后筛选阳性质粒,1.5琼脂糖电泳条带出现在Pa之后.随机挑选l0个单菌落进行PCR检查,其中9个出现550bp条带,阳性率90(图2).SpeI+XhoI双酶切检查,可见550bp及3800bp条带(图3).Pa质粒送生工测序,结果与预期序列一致(测序结果略).1,2,4,6,7,8,9:PCRproduct;3:negativeresult;5]kbMa~erFig2.PCRanalysisoftransformants6期吴国球等:噬菌体展示载体的构建53l3800bp——一550bp一1:XphageDNA/HindI/EcoR1;2:PCRproduct;3:pCOMB3;4:pa~;5:Nhel+Xbalanalysisofpositiveplasmid(Pa+);6:PCRanalysisof positiveplasmid(Pa) Fig3.Restrictionenzymeanalysisofplasmid3讨论噬菌体表面呈现技术(Phagedisplagtechnology)使制备全人源化单可隆抗体成为可能.1989年Huse 等口首次用噬菌体建立了小鼠抗体片段的抗体文库,随后又有单链Fv(ScFv)E,Fab片段以及双功能抗体文库的报道.用于抗体表面呈现的噬菌体载体是体现这一技术的关键.目前使用的载体包括Lerner实验室以pBluescrip为背景构建了 pCBAK8,pCOMB3,pCOMB8,Chang,用PUC和PGC1 构建pTACP,Winter实验室以PUC119构建的 pCANTAB等载体,pCOMB3[是许多实验室广泛采用的载体,它拷贝数高(>200拷贝/细胞),容易分离,带有Ap抗性基因用于筛选,目的基因表达在? 基因上游,用于融合及呈现;含有LacZ强启动子, Pelb引导序列,包膜蛋白Ill基因.重链基因克隆位点XhoI—SpeI,轻链基因克隆位点Xball—SacI.但我们在使用过程中发现,克隆基因频繁发生缺失,其原因可能因为此载体含有两个克隆位点,分别用于克隆重链和轻链基因,每个位点含有LacZ启动子,核酶结合位点及Pelb前导序列.限制酶分析显示,缺失发生在两个克隆位点之间,此区域包含两个8lbp 的重复序列,即24—105bp和1037—1118bp之间,质粒在线性化变性后第一个克隆位点的重复序列与第2个克隆位点的重复序列发生退火,从而导制基因缺失.通过切除272bpNHeI—Xbal片段,即切除第 2个克隆位点及其81bp的重复序列,消除了相应的缺失.NheI(G.CTAGA)和XbaI(TCTAGA)是同尾酶,因此用双酶切除272bp片段后,剩余片段可通过T4连结酶自连.另外,在操作过程中,我们还发现由于Spel—XhoI之间仅相差40bp,因此在双酶切后,由于片段大小无法用普通琼脂糖电泳检查酶切是否完全,是单酶切还是双酶切,操作极为不便,因此插入550bp片段,可大大简化酶切消化,克隆及电泳分离等DNA操作步骤.由于切除了第2个克隆位点,因此构建的载体宜用于单链抗体的克隆与表达.本载体是丝状噬菌体的突变株,作为克隆载体,噬菌体在转染细胞后能够自我复制并翻译出目的蛋白,在用辅助噬菌体如VCSM13,M13K07共同感染后,噬菌体能自我组装,形成新的噬菌体.Ill基因是噬菌体的包膜蛋白基因,编码406个氨基酸,其C端(P198一$406)镶嵌在噬菌体外壳上,N端(1一P918)伸出噬菌体的表面特异性地吸附在雄性E.coli的性菌毛上,当用目的基因代替N端时,伸出部分带有目的蛋白,但失去了浸染雄性曰.coli的能力.因此只有用辅助噬菌体超感染提供野生型?基因分子,才能组装成具有另一轮浸染活力的噬菌体颗粒,不用辅助噬菌体,就成了与表达质粒完全相同的表达载体,因此称双相表达载体.参考文献[1]CourtneyBC,WilliamsKC,SchlagerJJ,eta/.Aphagedisplay vectorwithimprovedstability.applieabilityandeaseof manipulation[J].Gene,1995,185:139一l4O.[2]ScottJK.Discoveringpeptideligandsusingepitopelibraries[J].TrendsBioc~m8ci,1992,17:386—390.[3]HuseWD,SastryL,lversonSA,eta/.GenerationofalargecombinatoriallibraryoftheimmunoglobulinrepertoireinphagelambdaEJ'].Sconce,1989,246—275.[4]McCaffertyJ,GriffithsAD,WinterG,eta/.Phageantibodies:filamentousphagedisplayingantibodyvariabledomains[J].Nature,l990,348:552—554.[5]HoogenboomHR.Multi—subunitproteinsonthesurfaceoffilamentousphage:methodologiesfordisplayingantibody(Fab)heavyandlightchainsEJ].Nuc/e/cAck/sRes,1991,19:4133—4137.[63MeGuinnessBT.Phagediabodyrepertoiresforelectionoflarge numbersofbispecificantibodyfragments[J].Nat.Botec/md,1996,14:儿49一ll54.[7]CarlosF,BarbasI,AngrayK,eta/.Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurfaces:thegeneIsite[J].ProcNailAcadU8A,1991.88:7978—7982.532中国药科大学33卷ConstructionofVectorforPhageDisplayWUGuo-Qiu.SHENZi-LongB/otechno/ogyCenterofChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,Chi naABSTRACTAIMToconstructethevectorforphagedisplay.METHODSByremovingaNheI-XbaIcloningsite,pCOMB3wasremainedtobealacZstrongpromoter,aPelBleadsequenceandac oatproteingene?.Inthemeanwhile,550bpfragmentwhichwasamplifiedbydesignedtwoprimersandusing templetofPET一28(a)wasinsertedintothesitesbetweenXholandSpelI.Thephagemidwasidentifiedbyth emethodsofrestrictiveenzymeanalysis,PCRandDNAsequencingaftermultiplied.RESULTSA272bpfragmentwas deletedbyNheI—XbaI;Restrictiveenzymeanalysisshowedthattheplasmidwascutbymeansofsinglesi teofeitherXhoIorSpeI;therewerenositesofXbaIorNheI;550bpfragmentwasamplifiedbyPCRusingtempletof constructedplasmid;DNAsequencewasinaccordancewiththeexpectedsequence.CONCLUSIONAvectorwith characteristicsofhighcopynumber,applicability,easeofmanipulationforphagedisplaywassuccessfull yconstruction.KEYWORDSConstruction;Vector;Phagedisplay; ?新成果?我国在医药生物技术领域取得系列重大成果在医药生物技术领域,我国已经步入了国际先进国家的行列,具备了一定的国际竞争能力.目前我国在以下领域取得了重大成果:一批基因工程药物和疫苗正在从实验室研究向产业化转化,基因工程制药产业已初具规模;人工血液代用品即将进入临床研究;体细胞克隆和遗传病的基因诊断技术达到国际先进水平;B型血友病,恶性肿瘤,梗塞性外周血管等6个基因治疗方案已进入了临床疗效研究;纳米技术开始应用于医药研究;肿瘤免疫治疗,抗血管治疗,组织工程,生物芯片和干细胞等技术上也取得了一系列突破和重要进展.中国已经开发成功了21种基因工程药物和疫苗,世界上销售额排名前l0位的基因工程药物和疫苗,中国已能生产8种.专家指出,虽然中国医药生物技术发展速度较快,取得一些喜人成就,但也存在着一些不容忽视的问题:中国生物制药企业研究与开发投入太少,使得研发能力很差;上下游技术脱节,成果转化率低等.专家们建议,应发挥社会各方面投资新药的积极性,多渠道增加医药生物技术投入,包括部门和地方政府资金,科技贷款,股票市场,海外基金等.同时还应积极培育风险资本市场,鼓励建立生物技术风险投资基金.(中创网)。

人源性抗核抗体Fab片段抗体库的构建筛选及鉴定的开题报告

人源性抗核抗体Fab片段抗体库的构建筛选及鉴定的开题报告

人源性抗核抗体Fab片段抗体库的构建筛选及鉴定的开题报告一、背景人类免疫球蛋白是一种在机体免疫防御过程中起重要作用的蛋白质,主要由四个多肽链组成:两个重链和两个轻链。

重链和轻链各自有不同的区域,其中即含有可与外来抗原结合形成免疫复合物的抗原结合部位(Fab片段),也称为抗原识别部位,同时重链和轻链之间的连接区域(Fc片段)可结合多种配体,包括细胞受体、补体蛋白等。

Fab片段与抗原的结合是通过氨基酸残基,如互补决定区(CDR)等进行特异性配对,因此将其提取并经过相应筛选后可对细胞表面的分子进行高效特异性识别,被广泛应用于临床诊断、药物开发等领域。

本研究旨在构建人源性抗核抗体Fab片段抗体库,并通过鉴定、筛选,获取能与抗核抗体特异结合的Fab片段抗体,为进一步研究自身免疫性疾病等相关领域提供有力支持。

二、研究内容及方法1.构建人源性抗核抗体Fab片段抗体库本实验将以人源性抗核抗体为模板,采用RT-PCR技术将其Fab片段DNA序列克隆到质粒载体中,将质粒从E.coli菌株中提取,再经过限制酶切和琼脂糖凝胶电泳等方法进行鉴定。

最后将合格的Fab片段DNA序列基因克隆到噬菌体抗体库质粒中构建成Fab片段抗体库。

2.进行Fab片段抗体筛选将构建好的Fab片段抗体库与靶抗原结合,经过洗涤、脱离、重复上述步骤,以免疫学实验技术如ELISA、Western blot等方法进行鉴定与筛选,最终获得能够对抗核抗体进行特异性结合的Fab片段抗体。

3.鉴定和验证Fab片段抗体对筛选出来的Fab片段抗体进行功能验证,在体内和体外中都可以使用,检测目标分子的表达水平和分布情况,验证其特异性和亲和力。

三、研究意义本研究将建立人源性抗核抗体Fab片段抗体库,厘清自身免疫性疾病的发生机理,有效提高诊断准确率,为药物研发提供新的靶标和研究思路,使得人类免疫球蛋白的应用领域更加广泛。

噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选

噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选

噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选董金华;唐玉海;乔宁;韩金宏;董美华;董益阳【摘要】利用小白鼠免疫和噬菌体展示技术构建了噬菌体展示抗体文库,从文库中筛选获得了一株抗克伦特罗单克隆抗体.该抗体的氨基酸序列尚未在世界基因数据库中登录,是一个新的抗体.该抗体对于游离克伦特罗的半抑制率IC50为0.602μg/mL.该噬菌体展示的抗体片段可以用于竞争法检测克伦特罗的含量,其能够检测出的最低浓度为15.6 ng/mL,具有较大的实用价值.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】7页(P136-142)【关键词】克伦特罗;抗体;噬菌体展示;免疫检测【作者】董金华;唐玉海;乔宁;韩金宏;董美华;董益阳【作者单位】潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;潍坊科技学院生物工程研发中心,山东262700;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029【正文语种】中文盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CLEN)是一种β2受体激动剂,属于拟肾上腺素类药物,分子量为313.7[1]。

20世纪80年代初,美国的一家公司发现盐酸克伦特罗可以明显地促进动物的生长,并能有效地增加瘦肉率[2],它能够改变动物体内的代谢途径,促进肌肉特别是骨骼肌中蛋白质的合成,抑制脂肪的合成,从而加快家畜生长速度,相对增加瘦肉比例。

这一新发现很快被一些国家用于养殖业。

饲料中添加了盐酸克伦特罗后,可使猪牛羊等畜禽生长速度、饲料转化率及胴体瘦肉率提高10%以上,所以盐酸克伦特罗作为饲料添加剂一度被广泛使用。

但是后来科学家们发现人类过度摄入克伦特罗会引起巨大的不良反应,严重的可能会发生急性中毒,甲状腺功能亢进,心律失调等症状[3]。

20世纪80年代末期开始,在世界各地发生了多起克伦特罗中毒事件,我国在近几年也时有发生。

抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选

抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选

抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选刘亚文;张晓;郭万美;谢英林;宋水燕;朱晓宇;敬媛媛;于建立;宋海鹏【摘要】利用噬菌体展示技术进行纳米抗体库的构建和筛选,获得抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,为相关癌症诊断及靶向治疗的应用奠定基础.使用重组CEACAM5抗原免疫羊驼,分离免疫后羊驼的外周血淋巴细胞,提取总RNA后通过RT-PCR技术扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段,构建纳米抗体文库.采用噬菌体展示技术和固相淘选方法,筛选得到强阳性克隆,经大肠杆菌表达和镍离子亲和层析获得纳米抗体,最终利用Biacore分析其亲和力和特异性.通过3轮的淘选,获得一株纳米抗体亲和力达到2.6×10-10 m ol·L-1,对同源性蛋白CEACAM-1、-3、-6、-8及肿瘤蛋白AFP均无交叉反应性.利用噬菌体展示技术成功获得了抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,可用于后续相关癌症诊断和靶向治疗.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2018(018)028【总页数】6页(P189-194)【关键词】癌胚抗原;纳米抗体;噬菌体展示;亲和力;特异性【作者】刘亚文;张晓;郭万美;谢英林;宋水燕;朱晓宇;敬媛媛;于建立;宋海鹏【作者单位】长春理工大学生命科学技术学院 ,长春130022;长春理工大学生命科学技术学院 ,长春130022;长春理工大学生命科学技术学院 ,长春130022;吉林亚泰生物药业股份有限公司 ,长春130033;吉林亚泰生物药业股份有限公司 ,长春130033;吉林亚泰生物药业股份有限公司 ,长春130033;吉林亚泰生物药业股份有限公司 ,长春130033;长春力太生物技术有限公司 ,长春130000;长春理工大学生命科学技术学院 ,长春130022;长春力太生物技术有限公司 ,长春130000【正文语种】中文【中图分类】Q816癌胚抗原(CEA)是哺乳动物细胞表面免疫球蛋白超家族的一员[1],属于细胞表面粘附分子,其最早从人类结肠癌和胎儿消化系统中鉴定出来。

噬菌体展示[3篇]

噬菌体展示[3篇]

噬菌体展示[3篇]以下是网友分享的关于噬菌体展示的资料3篇,希望对您有所帮助,就爱阅读感谢您的支持。

噬菌体展示(一)测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI (噬菌体数/细菌数)值远低于1时(即细菌过量时),噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。

正因如此,建议检测噬菌体贮液的滴度时,在感染前进行稀释,而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。

低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。

1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中,摇床培养至对数中期(OD600 ~0.5)。

2. 细胞生长时,微波炉融化上层琼脂,分成3 ml等份于灭菌试管中,每个噬菌体稀释度一管。

保存于45℃备用。

3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板,每个噬菌体稀释度取一个平板备用。

4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。

建议稀释范围:扩增的噬菌体培养物上清:108-1011;未扩增的淘选洗脱物:101-104。

每个稀释度换一新鲜吸头,建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。

5. 当菌体培养物达对数中期,分成200 μl等份于微量离心管中,每个噬菌体稀释度一管。

6. 每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体,快速震荡混匀,室温温育1-5 min。

7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中,每次一管,快速混匀,立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。

适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。

8. 待平板冷却5 min后,倒置于37℃培养过夜。

9. 检查平板,计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。

然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。

淘选程序最简单直接的淘选方法有:直接将靶分子包被于塑材表面(通过非特异的疏水作用或静电相互作用),洗去过量的未吸附分子,然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。

根据靶分子的不同,直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入,这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。

利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽

利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽

利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病,虽然现在有很多治疗肿瘤的方法,但是很多方法仍然存在缺点,比如副作用大、难以选择性靶向肿瘤细胞等。

而目前,利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽已经成为一个新的研究方向,可以帮助我们更好地治疗肿瘤,减少副作用。

本文将从以下几个方面进行讨论:一、噬菌体展示技术的原理噬菌体是一种寄生在细菌体内的病毒,其基因组较小,只有几千个碱基对。

噬菌体展示技术指的是将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面融合,然后通过筛选找到与目标靶点高度亲和力的新型肽或蛋白质,并利用筛选的结果进行药物研发。

二、利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽的优点由于肿瘤细胞表面的分子与正常细胞不同,靶向癌细胞表面的新型肽研究成为了治疗肿瘤的一个重要方向。

利用噬菌体展示技术可以快速筛选出与癌细胞表面高度亲和的新型肽,这些新型肽可以被用于制备药物。

与传统的药物研发方法相比,噬菌体展示技术筛选出的肽具有选择性和特异性,能够减少对正常细胞的影响,从而降低治疗过程中的副作用。

三、噬菌体展示技术在靶向癌细胞表面菌素的研究中的应用通过噬菌体展示技术筛选到的肽可以被用来靶向癌细胞表面的多个分子靶点。

比如,一项研究利用噬菌体展示技术筛选出针对HER2靶向肽,将其与载药纳米粒子结合,可以明显提高抗肿瘤效果。

另一项研究发现一个靶向乳腺癌细胞表面的新型肽,可以用来诊断早期乳腺癌。

更有研究者通过噬菌体展示技术筛选出膀胱癌细胞表面的新型肽,并成功应用于临床,证明了噬菌体展示技术在肿瘤治疗中的应用前景。

四、总结随着研究的深入,噬菌体展示技术在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用。

利用噬菌体展示技术筛选靶向癌细胞表面的新型肽,不仅可以提高治疗效果,还可以降低副作用。

噬菌体展示技术在肿瘤治疗中的应用前景十分广阔,我们有理由相信,未来会有更多的新型肽在研究中发现,并成功应用于临床。

噬菌体展示文库构建流程

噬菌体展示文库构建流程

噬菌体展示文库构建流程
噬菌体展示文库构建是一项重要的实验工作,旨在通过噬菌体展示技术展示目标蛋白,并从中筛选出具有特定功能的蛋白。

下面将介绍噬菌体展示文库构建的流程。

需要准备目标蛋白的DNA序列。

这一步是构建噬菌体表达文库的基础,目标蛋白的DNA序列应该经过验证,并且包含适当的启动子和标记序列。

接下来,将目标蛋白的DNA序列插入到噬菌体表达载体中。

噬菌体表达载体通常包含噬菌体的基因组序列和表达启动子,插入目标蛋白的DNA序列后,可以通过大肠杆菌等细菌进行扩增。

然后,将构建好的噬菌体表达载体转化到适当的宿主菌中。

通常选择大肠杆菌作为宿主菌,通过热激转化等方法将载体导入宿主菌内。

接着,利用宿主菌进行噬菌体表达。

在适当的诱导条件下,宿主菌会表达目标蛋白,并将其显示在噬菌体的表面。

随后,将表达目标蛋白的噬菌体进行筛选和分离。

可以通过特定的抗体或配体结合目标蛋白进行筛选,筛选出具有特定功能的噬菌体。

对筛选出的噬菌体进行测序和验证。

通过测序确认目标蛋白的DNA 序列是否正确插入到噬菌体表达载体中,同时通过功能性实验验证目标蛋白的活性和特异性。

总的来说,噬菌体展示文库构建流程包括目标蛋白的DNA序列准备、插入载体、转化宿主菌、表达目标蛋白、筛选分离和验证等步骤。

通过这一流程,可以高效地展示和筛选出具有特定功能的蛋白,为后续蛋白工程和药物研发提供重要的参考和支持。

噬菌体展示技术的原理及应用

噬菌体展示技术的原理及应用

二、噬菌体展示技术旳应用现状
抗体: 抗狂犬病毒旳单链抗体, 抗HIV-1囊膜糖蛋白旳单链抗体,此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并体现有gp120旳淋巴细胞, 中和响尾蛇毒素旳单链抗, 等等。
疫苗: 展示在噬菌体表面旳HIV-1 旳gp120-V3 环 可象天然抗原一样引起明显旳免疫应答, 等等。
噬菌体抗体库旳构建
Antibody IgG structure
Antibody IgG structure
C
L
V
L
V
H
C
H
1
V
L
C
L
V
H
C
H
1
C
H
2
C
H
2
C
H
3
C
H
3
Antibody IgG structure
Hinge
(Fab’)2
Fab
Fc
MembraneExtension
Antibody IgG structure
选择措施: 淘选(Panning)而不是 筛选(Screening)
非展示系统 展示系统
Solid phase selection with immunotubes
B
B
B
B
B
B
Immunotubecoated withantigen
诊疗 被动免疫 抗体 蛋白质构造分析 药物导航 蛋白质纯化
Wash to remove unbound phage particles.
Elute bound phage
Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
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关于人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建【关键词】胃肿瘤关键词: 胃肿瘤;人抗体,肿瘤;噬菌体摘要:目的利用噬菌体表面展示技术,构建人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库. 方法从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总RNA,反转录成cDNA后,用PCR扩增人IgG1Fd段及κ轻链,并克隆至噬菌粒载体pCOMB3中,转化宿主菌株XL1-Blue,以辅助噬菌体M13K07超感染噬菌粒文库,构建成人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库. 结果得到一个含克隆数为1.2×106 ,实际滴度约为2.56×1015 pfu・L-1 的IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库. 结论IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建,为下一步利用亲和富集筛选技术,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.Keywords:stomach neoplasms;antibodies,neoplasms;bac-teriophagesAbstract:AIM To construct a phage display library of hu-man IgG1Fab antibodies from lymph nodes of gastric cancer patients using phage display technique.METHODS Total RNA was isolated from lymph nodes of gastric cancer pa-tients.Fd fragment and kappa light-chain were amplified by RT-PCR and cloned into the phagemid pCOMB3and ex-pressed as a fusion protein with phage M13PⅢin E.coli XL1-Blue.In the presence of help phage M13K07,the Fab fusion protein was displayed on the surface of recombinant phage.RESULTS We have constructed a phage display li-brar y of human IgG1Fab antibodies whose titer was about2.56×1015 pfu・L-1 .CONCLUSION This library could be used to prepare human IgG1Fab antibody.0 引言单克隆抗体的出现使肿瘤抗体介导的免疫治疗发生了突破性进展.然而,目前所用的抗体多为动物源性抗体,用于人体会产生异源性抗体反应,影响效果,限制了免疫治疗的发展.使用人源性抗体则可避免异源性抗体反应.但是,用传统方法制备人源性抗体十分困难,1990年代初建立的噬菌体表面展示抗体库技术为制备人源性抗体开辟了一条快捷途径,促进了人源性抗体的发展.我们利用噬菌体表面展示抗体库技术,从胃癌手术患者一级站淋巴结中提取总RNA,构建了胃癌人源性抗体IgG1Fab段的噬菌体表面展示文库,为下一步利用亲和富集筛选技术,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.1 材料和方法1.1 材料淋巴结标本采自西京医院胃肠外科,经病理诊断为胃癌病例的一级站引流淋巴结.宿主菌株E.coli XL1-blue由本室保存,含有F’因子,携带四环素抗性基因(Tetr ).噬菌粒载体pCOMB3含有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),LacZ启动子及噬菌体间隔片段和用于克隆Fd段的SpeI,XhoI克隆位点及用于克隆轻链的XbaI,SacI克隆位点.辅助噬菌体M13K07,为Phamasia公司产品,带有突变型基因Ⅱ,复制起始位点和卡那霉素抗性基因(Kanr ).RNA提取试剂、限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒分别为Promega公司、华美生物制品公司产品,cDNA反转录试剂盒为MBI公司产品.TaqDNA聚合酶和dNTPs为Promega公司产品.引物由上海生工生物制品公司合成,序列参照文献[1]设计,引物浓度为50pmol・L-1 .其中P1,P2为Fd段5’端引物,P3为Fd段3’端引物;P4,P5为轻链5’端引物,P6为轻链3’端引物.1.2 方法1.2.1 Fd段和κ轻链基因的扩增参照文献[2]进行,略有改动.将淋巴结研碎,采用异硫氰酸胍一步法[3]提取总RNA.经紫外分光测量鉴定纯度.反转录合成cDNA按照试剂盒说明操作.反转录合成的第一条链作为扩增的模板与上下游引物混合,在50μL反应体系中进行反应:95℃5min,94℃1min,62℃1.5min,72℃2min,11次循环;94℃1min,58℃1.5min,72℃2min,11次循环;94℃1min,54℃1.5min,72℃2min,15次循环;72℃8min.PCR产物经20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳,用Mi-crospin columns纯化回收目的基因片段.1.2.2 Fd噬菌粒文库的构建参照文献[4]进行.用限制性核酸内切酶SpeI,XhoI酶切Fd片段和噬菌粒载体pCOMB3,于16℃连接20h,同时作线性pCOMB3自连对照.用TSS法将连接产物转化入E.coli XL1-Blue,转化产物培养1h后全部均匀涂布在LB固体培养基上(含Amp100mg・L-1 ),18h后计算总克隆生成数,代表初始文库库容量.用碱裂解法[5]提取重组噬菌粒pCOMB3-Fd,酶切鉴定噬菌粒.1.2.3 Fab噬菌粒文库的构建用限制性核酸内切酶SacI,XbaI酶切κ轻链片段和pCOMB3-Fd噬菌粒,按上述方法连接、转化,并于固体培养基上培养,计算总克隆生成数.随机挑取10个分隔良好的单克隆,提取噬菌粒酶切鉴定.1.2.4 IgG1Fab片段的噬菌体表面展示及文库滴度测定取部分含pCOMB3-Fab噬菌粒的菌液,用2×YT培养液(含Amp100mg・L-1 ,2g・L-1 葡萄糖)50mL稀释至A600nm 为0.3,培养至A600nm =0.6时,加入8.5×1010 pfu的辅助噬菌体M13K07,静置10min后振摇培养1h.再离心弃上清,将细菌沉淀重悬于50mL2×YT培养液(含Amp100mg・L-1 ,Kan70mg・L-1 )中,37℃快速振摇培养过夜.离心并收集上清即为IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库.将所得文库分别作10-8 ,10-10 ,10-12 梯度稀释,进行噬斑培养,测定噬斑形成单位,判定噬菌体表面展示文库的滴度.2 结果2.1 PCR产物采用一步法从胃癌淋巴结提取总RNA,逆转录合成cDNA经PCR扩增出目的片段,Fd片段和轻链大小约670bp(Fig1(略)).2.2 Fd噬菌粒文库的构建用相应限制性核酸内切酶酶切Fd片段和噬菌粒载体pCOMB3连接,连接产物经转化后培养,约长出菌落2.7×105 个,载体自连对照组约长出菌落1.0×104 个,推断重组率约为90%.pCOMB3-Fd菌粒经SpeI,XhoI酶切后,释放出约660bp 大小的片段(Fig2(略)).2.3 Fab噬菌粒文库的构建用同样方法构建Fab噬菌粒文库,约长出菌落1.2×106 个.对照组约长出菌落1.0×105 个,随机挑取10个单克隆,其中8个经酶切鉴定含有Fab片段,推断重组率约为80%.pCOMB3-Fab噬菌粒经XhoI,XbaI酶切后,释放出约2.2kb大小的片段;经SacI,XbaI酶切后,释放出约660bp大小的片段(Fig3). 2.4IgG1Fab片段的噬菌体表面展示及文库滴度测定 Fab噬菌粒文库经辅助噬菌体M13K07挽救后滴定,顶层琼脂上噬斑形成单位约为2.56×1015 pfu・L -1 ,估算噬菌体表面展示文库的滴度约为2.56×1015 pfu・L-1 .3 讨论噬菌体抗体库技术的建立,为人源性抗体的制备提供了一条快捷途径,推动了对肿瘤抗原的研究、肿瘤被动免疫治疗及导向治疗的发展.该技术用PCR方法可以把人免疫球蛋白全套可变区基因扩增出来,用基因工程方法制备人源性抗体.构建抗体库的诸多环节对抗体库的质量都有影响.我们选择淋巴结细胞作为建库B细胞的来源是因为淋巴结较外周血单核细胞含有更多具有活性的成熟B细胞,经PCR扩增可得到更多的免疫球蛋白基因产物.考虑到抗体的亲和力和多样性,有学者[6]建议用淋巴结细胞建库.PCR引物在保证抗体基因多样性方面起着至关重要的作用,影响着抗体库能否真实地反应原始抗体基因的分布情况.我们选用目前应用最广的由Kang等设计的引物序列,较全面地包含了已知免疫球蛋白抗体基因的信息,保证了抗体基因的多样性.但由于其3’端引物为IgG1亚类,使得所扩增的Fd片段仅局限于IgG1亚类.肿瘤的免疫诊断与治疗是现代肿瘤诊疗方法之一,人源性胃癌抗体Fab噬菌体表面展示文库的成功构建,为下一步利用亲和富集筛选技术,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.参考文献[1]Don LS,Tylis Y,Chang SL,Russell V,Bunya Y.Isolation of cell surface human monoclonal antibodies using phage display andmagnetically-activated cell sorting:Application in immuno-hematology [J].J Immunol Methods,1997;206:73-85.[2]Wang ZL,Deng JB,Han H,Chen MH,Su CZ.Amplification,cloning and sequencing of the variable region genes of a human melanoma specific monoclonal antibody [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ),1997;18(3):225-226.[3]Cui DX,Yan XJ,Fan QY,Su CZ,Ji CH.Studies on relation-ship between musculoskeletal neoplasm and oncogene mdm2metastasis suppressor gene nm23-H1[J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ),1997;18(1):20-22.[4]Shen LM,Chang SG,Chih-hung LL,Peter W,Chi-huey W,KimDJ.Phage-display library selection of high-affinity human single-chain antibodies to tumor-associated carbohydrate anti-gens sialyl Lewisx and Lewisx [J].Proc Natl Acad Sci USA,1999;96:6953-6958.[5]Su MQ,Yu WB,Ma YY,Zhang JF,Peng DR,Ding ZR.Rapid detection of typhimurium bacteremia by polymerase chain reaction [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med U-niv),2000;21(6):S113-S115.[6]Yip YL,Hawkins NJ,Clark MA,Ward RL.Evaluation of dif-ferent lymphoid tissue sources for the construction of human im-munoglobulin gene libraries [J].Immunotechnology,1997;3(3):195-203.。

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