关于人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建

关于人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体

表面展示文库的构建

【关键词】胃肿瘤

关键词: 胃肿瘤;人抗体，肿瘤;噬菌体

摘要:目的利用噬菌体表面展示技术，构建人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库. 方法从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总RNA，反转录成cDNA后，用PCR扩增人IgG1Fd段及κ轻链，并克隆至噬菌粒载体pCOMB3中，转化宿主菌株XL1-Blue，以辅助噬菌体M13K07超感染噬菌粒文库，构建成人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库. 结果得到一个含克隆数为1.2×106 ，实

际滴度约为2.56×1015 pfu・L-1 的IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库. 结论IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建，为下一步利用亲和富集筛选技术，获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.

Keywords:stomach neoplasms;antibodies，neoplasms;bac-teriophages

Abstract:AIM To construct a phage display library of hu-man IgG1Fab antibodies from lymph nodes of gastric cancer patients using phage display technique.METHODS Total RNA was isolated from lymph nodes of gastric cancer pa-tients.Fd fragment and kappa light-chain were amplified by RT-PCR and cloned into the phagemid pCOMB3and ex-pressed as a fusion protein with phage M13PⅢin E.coli XL1-Blue.In the presence of help phage M13K07，the Fab fusion protein was displayed on the surface of recombinant phage.RESULTS We have constructed a phage display li-

brar y of human IgG1Fab antibodies whose titer was about2.56×1015 pfu・L-1 .CONCLUSION This library could be used to prepare human IgG1Fab antibody.

0 引言

单克隆抗体的出现使肿瘤抗体介导的免疫治疗发生了突破性进展.然而，目前所用的抗体多为动物源性抗体，用于人体会产生异源性抗体反应，影响效果，限制了免疫治疗的发展.使用人源性抗体则可避免异源性抗体反应.但是，用传统方法制备人源性抗体十分困难，1990年代初建立的噬菌体表面展示抗体库技术为制备人

源性抗体开辟了一条快捷途径，促进了人源性抗体的发展.我们利用噬菌体表面展示抗体库技术，从胃癌手术患者一级站淋巴结中提取总RNA，构建了胃癌人源性抗体IgG1Fab段的噬菌体表面展示文库，为下一步利用亲和富集筛选技术，获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.

1 材料和方法

1.1 材料

淋巴结标本采自西京医院胃肠外科，经病理诊断为胃癌病例的一级站引流淋巴结.宿主菌株E.coli XL1-blue由本室保存，含有F’因子，携带四环素抗性基因（Tetr ）.噬菌粒载体pCOMB3含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ），LacZ启动子及噬菌体间隔片段和用于克隆Fd段的SpeI，XhoI克隆位点及用于克隆轻链的XbaI，SacI克隆位点.辅助噬菌体M13K07，为Phamasia公司产品，带有突变型基因Ⅱ，复制起始位点和卡那霉素抗性基因（Kanr ）.RNA提取试剂、限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒分别为Promega公司、华美生物制品公司产品，cDNA反转录试剂盒为MBI公司产品.TaqDNA聚合酶和dNTPs为Promega公司产品.引物由上海生工生物制品公司合成，序列参照文献［1］设计，引物浓度为

50pmol・L-1 .其中P1，P2为Fd段5’端引物，P3为Fd段3’端引物;P4，P5为轻链5’端引物，P6为轻链3’端引物.

1.2 方法

1.2.1 Fd段和κ轻链基因的扩增

参照文献［2］进行，略有改动.将淋巴结研碎，采用异硫氰酸胍一步法［3］提取总RNA.经紫外分光测量鉴定纯度.反转录合成cDNA按照试剂盒说明操作.反转录合成的第一条链作为扩增的模板与上下游引物混合，在50μL反应体系中进行反应:95℃5min，94℃1min，62℃1.5min，72℃2min，11次循环;94℃1min，

58℃1.5min，72℃2min，11次循环;94℃1min，54℃1.5min，72℃2min，15次循环;72℃8min.PCR产物经20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，用Mi-crospin columns纯化回收目的基因片段.

1.2.2 Fd噬菌粒文库的构建

参照文献［4］进行.用限制性核酸内切酶SpeI，XhoI酶切Fd片段和噬菌粒载体pCOMB3，于16℃连接20h，同时作线性pCOMB3自连对照.用TSS法将连接产物转化入E.coli XL1-Blue，转化产物培养1h后全部均匀涂布在LB固体培养基上（含Amp100mg・L-1 ），18h后计算总克隆生成数，代表初始文库库容量.用碱裂解法［5］提取重组噬菌粒pCOMB3-Fd，酶切鉴定噬菌粒.

1.2.3 Fab噬菌粒文库的构建

用限制性核酸内切酶SacI，XbaI酶切κ轻链片段和pCOMB3-Fd噬菌粒，按上述方法连接、转化，并于固体培养基上培养，计算总克隆生成数.随机挑取10个分隔良好的单克隆，提取噬菌粒酶切鉴定.

1.2.4 IgG1Fab片段的噬菌体表面展示及文库滴度测定

取部分含pCOMB3-Fab噬菌粒的菌液，用2×YT培养液（含Amp100mg・L-1 ，2g・L-1 葡萄糖）50mL稀释至A600nm 为0.3，培养至A600nm =0.6时，加入