10种中草药乙醇提取物抗真菌作用研究_王柱华

２５ ２５
１２．５ ２１
６．２５ １２
３．１２５ ８
１．５６ －
２．３ 黄连提取物对白色念珠菌最低抑菌质量浓度的测定结果 ＴＴＣ 是一种常 用 的 活 菌 染 料，其 氧 化 态 是 无 色 的，该
染料 进 入 细 胞 后 ，ＴＴＣ 与 活 细 胞 内 的 琥 珀 酸 脱 氢 酶 反 应 ，可
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图１ 黄连提取物对白色念珠菌的抑制作用
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１：对照组；２：２５ｍｇ／ｍＬ 黄连提取物
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Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｔｉｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
１：ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；２：２５ ｍｇ／ｍＬ ｃｏｐｔｉｓ ｅｘｔｒａｃｔ
药物名称 黄连＋大黄 黄芩＋蛇床子 五蓓子＋丹参 知母＋藿香
生成红色的还原产物甲臜．ＴＴＣ 法测定黄连提取物对白色
念珠菌最低抑菌质量浓度的测定结果见表 ３．由表可知，经
ＴＴＣ 染色后 ，培养 基 的 颜 色 随 着 药 物 质 量 浓 度 的 增 加 而 变
浅，直至无色．当黄连提取物的质量浓度大于１ｍｇ／ｍＬ 时，
培养液呈无色，表明黄连提取物可完全抑制白色念珠 菌 的 生 长 ，故 其 最 低 抑 菌 质 量 浓 度 为 １ｍｇ／ｍＬ． ２．４ 不 同 中 草 药 配 伍 对 白 色 念 珠 菌 的 抑 制 作 用 结 果
收 稿 日 期 ：２０１２－１０－２３
基 金 项 目 ：辽 宁 省 教 育 厅 科 学 技 术 研 究 项 目 （Ｌ２０１０２３６） 作者简介：王柱华（１９６５－ ），男，辽宁锦州人，辽宁师范大学访问学者．
第１期
王 柱 华 ： １０ 种 中 草 药 乙 醇 提 取 物 抗 真 菌 作 用 研 究
真菌可引起动植物的多种病害，不仅对农作物产 量 和 经 济 动 物 生 长 造 成 极 大 的 经 济 损 失，而 且 还 影 响 人 体 健 康 ，威 胁 人 类 的 生 命 安 全 ．在 过 去 的 ２０ 多 年 时 间 里 ，各 种 真 菌 感 染 ，无 论 是 发 生 频 率 还 是 感 染的种类都呈不断增加的趋势［１］．其中白色念珠菌 是 最 常 见 的 条 件 致 病 性 真 菌，在 检 出 的 致 病 性 真 菌 中占首位［２－３］．目前，应用于临床的抗真菌药物大致可以分为５种：一是多烯类抗真菌药 物；二 是 氮 唑 类 抗 真 菌 药 物 ；三 是 烯 丙 胺 类 化 合 物 ；四 是 核 苷 类 似 物 抗 真 菌 药 物 ；五 是 作 用 于 真 菌 细 胞 壁 合 成 的 抗 真 菌 药 物 ．但 由 于 这 些 抗 真 菌 药 物 都 有 一 定 程 度 的 副 作 用 ，特 别 是 前 ４ 类 药 物 ，其 作 用 靶 点 对 哺 乳 动 物 的 宿 主细胞也有影响，且随着这些药物的使用，真菌的耐药 性 问 题 也 日 趋 严 重．而 中 草 药 具 有 副 作 用 小，来 源广，价格低廉，较少出现耐药性等优点，因此从中 草 药 中 筛 选 和 开 发 新 型、高 效、低 毒、广 谱 的 抗 真 菌 药物成为研究的热点［４－７］．本文以白色念珠菌为指示菌，测定了黄连等１０种中草药的抗 真 菌 作 用，并 研 究了不同中药的配伍后，对白色念珠菌协同抑制作用的影 响，旨 在 为 开 发 高 效 低 毒 的 抗 真 菌 药 物 提 供 理论数据．
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乙醇热回流提取８ｈ，然后将提取液蒸干制成干粉．用无水乙醇将其配制成质量浓度为５０ｍｇ／ｍＬ 的药 液 ，备 用 ． １．２．２ 白色念珠菌悬液的制备 将活化培养后的白色念珠菌接种于 ＰＤＡ 液 体 培 养 基 中，在 ２８ ℃ 下 培 养 至 对 数 期 ，调 整 菌 液 的 浓 度 为 １０６～１０７ ｃｆｕ／ｍＬ，备 用 ． １．２．３ 不同中草药抑真菌作用的测定 在 无 菌 培 养 皿 内 注 入 体 积 分 数 为 ２％ 的 ＰＤＡ 固 体 培 养 基 作 为底层，待凝固后，在其上再倒入５ｍＬ 内含０．１ｍＬ 白 色 念 珠 菌 悬 液 的 ＰＤＡ 半 固 体 培 养 基，凝 固 后， 在 其 上 用 无 菌 镊 子 等 距 离 分 散 地 轻 轻 放 上 无 菌 牛 津 杯 （内 径 （６．０±０．１）ｍｍ，外 径 （８．０±０．１）ｍｍ，高 （１０．０±０．１）ｍｍ），放置５ｍｉｎ后，在杯内分别注入 ２００μＬ 质量浓度为 １０ｍｇ／ｍＬ 的不同中 草 药 提 取 物，无水乙醇作为对照，每２种药为１组，每组做３个平行实验．２８ ℃ 恒 温 箱 中 培 养 ２４ｈ 后，移 去 牛 津 杯 ，用 直 尺 精 确 测 量 抑 菌 圈 直 径 ，取 其 平 均 值 ． １．２．４ 不同质量浓度的中草药提取物抑真菌作 用 的 测 定 取 质 量 浓 度 为 ５０ｍｇ／ｍＬ 的 药 液，按 二 倍 稀 释 法 依 次 稀 释 为２５．０、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６ｍｇ／ｍＬ ５ 个 不 同 浓 度 梯 度 ，按 照１．２．３ 的 方 法 ，测 定 其 抗 真 菌 作 用 ，每 组 做 ３ 个 平 行 实 验 ． １．２．５ 最低抑菌质量浓度的测定（ＭＩＣ） 将培养至对数期的白色念珠菌，用 ＰＤＡ 培养基将其浓度调 节至１０６～１０７ ｃｆｕ／ｍＬ．然后在９６孔板中加入１５０μＬ 菌悬液、１５μＬ 不同质量浓度的供试药液，使药物 终质量浓度分别为 ６、４、２、１、０．５ｍｇ／ｍＬ，于 ２８ ℃ 下 培 养 ２４ｈ 后，每 孔 分 别 加 入 浓 度 为 体 积 分 数 为 ０．２％ 的 ２，３，５－氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 （ＴＴＣ）１５μＬ，２８ ℃ 下 避 光 培 养 ４ｈ，观 察 其 颜 色 变 化 ． １．２．６ 不 同 中 草 药 协 同 抗 真 菌 作 用 的 测 定 选 取 抗 真 菌 效 果 较 好 的 中 草 药 （质 量 浓 度 为 １０ｍｇ／ｍＬ），根 据 其 抑 菌 成 分 的 不 同 进 行 两 两 配 伍 （２ 种 药 液 混 合 的 体 积 比 例 为 １∶１），测 定 ２ 种 中 草 药 抗 真 菌 的 协 同 作 用 ．具 体 实 验 方 法 同 １．２．３．
２．２ 不 同 质 量 浓 度 黄 连 提 取 物 的 抑 真 菌 作 用 测 定 结 果
选取抑真菌效果最好的黄连，测定其不同质量浓度下的抗真菌作用，实验结果显示，黄连提取物的抗
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辽 宁 师 范 大 学 学 报 （自 然 科 学 版 ）
第 ３６ 卷
真菌作用，在一定质量浓度范围内，随黄连药液质量浓度的增大而增强，呈剂量依赖性（见表２和图２）．
表 ２ 不 同 质 量 浓 度 黄 连 提 取 物 对 白 色 念 珠 菌 抑 制 作 用 Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｃｏｐｔｉｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
药 液 浓 度／（ｍｇ／ｍＬ） 抑 菌 圈 直 径／ｍｍ
１０种中草药乙醇提取物抗真菌作用研究
王柱华
（辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 １１６０８１）
摘 要：以白色念珠菌为指示菌，测定了 黄 连 等 １０ 种 中 草 药 的 抗 真 菌 作 用．实 验 结 果 显 示，不同的中草药其抗真菌作用不同，其中 黄 连 和 黄 芩 ２ 种 药 物 对 白 色 念 珠 菌 的 抑 制 作 用 效 果 最 好 ，其 次 是 五 蓓 子 和 知 母 ，而 甘 草 对 白 色 念 珠 菌 抑 菌 作 用 较 差 ．在 一 定 质 量 浓 度 范 围 内 ，黄 连 提 取 物 的 抗 真 菌 作 用 随 药 液 浓 度 的 增 大 而 增 强 ，呈 剂 量 依 赖 性 ．其 最 低 抑 菌 质 量 浓 度 为 １ｍｇ／ｍＬ．将 抑 菌 成 分 不 同 的 中 草 药 进 行 两 两 配 伍 ，考 察 其 对 白 色 念 珠 菌 的 协同抑制作用，实验结果显示，除五蓓子 和 丹 参 的 混 合 药 液 对 白 色 念 珠 菌 具 有 协 同 抑 制 作 用 外 ，其 余 ３ 组 中 草 药 的 配 伍 ，并 无 协 同 抑 制 作 用 ． 关 键 词 ：中 草 药 ；黄 连 ；白 色 念 珠 菌 中 图 分 类 号 ：Ｒ２８５．５ 文 献 标 志 码 ：Ａ
２ 结果
２．１ 不 同 中 草 药 提 取 物 的 抑 真 菌 作 用 １０ 种 中 草 药 的 抑 真 菌 实 验 结 果 见 表 １．由 表 可 知 ，不 同 的 中 草 药 其 抑 真 菌 作 用 不 同 ，其 中 黄 连 和 黄
芩２种 药物对白色念珠菌的抑制作用效果最好（图 １），其次是五蓓子和知母，而甘草对白色念珠 菌 抑 菌作用较差．
未表现出抑菌的协同作用．
ｅｘｔｒａｃｔ；６：ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ
表３ 黄连提取物对白色念珠菌的 ＭＩＣ 测定结果
表 ４ 不 同 中 草 药 配 伍 对 白 色 念 珠 菌 的 抑 ｏｐｔｉｓ ｅｘｔｒａｃｔ ａｇａｉｎｓ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
图３．由 图 表 可 知，除 五 蓓 子 和 丹 参 混 合 药 液 的 抑 菌 作 用
ｃｏｐｔｉｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
效果比单独用药 要 好 之 外，其 余 ３ 组 中 草 药 的 配 伍，基 本 １～５：１．５６，３．１２５，６．２５，１２．５，２５ｍｇ／ｍＬ ｃｏｐｔｉｓ
第 ３６ 卷 第 １ 期
辽 宁 师 范 大 学 学 报 （自 然 科 学 版 ）
Ｖｏｌ．３６ Ｎｏ．１
２０１３ 年 ３ 月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｍａｒ． ２０１３
文 章 编 号 ：１０００－１７３５（２０１３）０１－０１２０－０４ ｄｏｉ：１０．１１６７９／ｌｓｘｂｌｋ２０１３０１０１２０