聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
生化实验：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
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净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离蛋白质的原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子 进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚 基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中 所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的 速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的 pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中 进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁 移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲 系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称 为阴极电泳。
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实验原理
▪ （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 ▪ 聚丙烯酰胺凝胶:
是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫 酸铵(AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
▪ AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合 反应进行。
玻璃管上端的2cm处，加水封胶 ➢ 在室温中聚合5-10分钟 注意：制胶时避免产生气泡
准备电泳：
将凝胶玻璃管安装在电泳槽本体上 将凝胶玻璃
管从橡胶管上取下，去水，垂直插到电泳槽本体上， 旋紧。
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加样 取电极缓冲液加入上、下缓冲液
槽中，注意上槽液要高过电极，凝胶柱与下 液槽的缝隙处无气泡。凝胶柱上端灌满缓冲 液，用微量进样器吸取一定体积的样品溶液， 小心地将样品加在凝胶柱上端。
(Bis)
自由基
交联
LOGO
华南农业大学-LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase 简称 LDH， EC.1.1.1.27）是催化丙酮酸和乳酸可逆转化的 酶。 • 1959年 Markert 等用电泳的方法将牛心肌提纯 的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称 LDHl ，靠近阴极一端的称为LDH5；其余3种，由 阳极到阴极依次命名为LDH2 ，LDH3及LDH4。它 们均具有LDH 催化活性，从而首先提出了同工酶 (isoenzyme)的概念。 • 目前已知LDH同工酶是由亚基及M亚基按不同比例 组成的四聚体，它们是H4（LDHl），H3M （LDH2），H2M2（LDH3），HM3（LDH4）及M4 （LDH5）5种。心肌中以LDHl含量高，骨骼肌及 肝中LDH5 含量高。
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7.2
7.2
30
3
15
72
• （2）把配好的染色液倒入试管中，脱出的凝胶 放入盛有染色液的试管中,避光置37℃水浴中保 温10～20min，待LDH 同工酶呈现蓝紫色区带,回 收染色液。 • （3）用蒸馏水洗3次除去染色液，加入水浸泡， 凝胶底色脱净，背景清晰，把凝胶柱放在灌满水 的试管中，对光观察过乳酸脱氢酶同工酶谱，并 画电泳图或拍照。 • （也可将凝胶板放在保存液中浸泡）
(三)、试剂
1 制备样品有关试剂（老师配） （1）0.01mo1／L pH 6.5磷酸盐缓冲液（PBS）， 用于组织匀浆缓冲液及LDH的染色液 Na2HPO4· 12H2O 0.2256g ，NaH2PO4· H2O 0.2137g，加水定容到200mL。 （2）40%蔗糖溶液 20g蔗糖用水溶解定容至50mL。 （3）0.5％溴酚兰 10mL
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶一、实验目的1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法分离LDH同工酶。
二、实验原理LDH 同工酶是由催化反应相同、分子结构和理化性质不同的一组酶组成，由于分子效应和电荷效应，他们分别以不同的速度在以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳中泳动，可分离出5种同工酶，泳动速度为LDH1> LDH2> LDH3> LDH4> LDH5。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有丙烯酰胺单体和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成的三维网状结构称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE），电泳速度与粒子所带电荷、粒子大小有关外，还与网络的孔径有关。
粒子大于凝胶孔径的，电泳速度慢。
反之则电泳速度快。
三、实验试剂30％凝胶贮存液：丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g，加蒸馏水溶至100ml，过滤棕色瓶4度保存。
Tris-甘氨酸电极缓冲液（5X）：Tris碱 15.1g 甘氨酸94g溶解于900ml去离子水中调解为PH8.3用去离子水定容至1000ml。
10％过硫酸铵：将0.5g过硫酸铵溶解于5ml水中。
Tris-Hcl 1.5mol／ml（ PH8.8）：18.165g Tris碱溶解于40ml水中，用1mol/lHCl调节PH至8.8，加水定容至100ml。
Tris-Hcl 0.5mol／ml（ PH6.8）：12.11g Tris碱溶解于40ml水中，用1mol/lHCl调节PH至6.8，加水定容至100ml。
2X样品缓冲液：Tris碱0.76g 蔗糖20g加41.5ml水溶解，然后加蒸馏水定容至50ml。
染色液：甲醇250ml 冰乙酸50ml 考马斯亮R250 0.5g去离子水200ml.脱色液：甲醇250ml 冰乙酸80ml去离子水200ml。
TEMED（四甲基乙二胺）四、实验操作1 PAGE凝胶的制备12%分离胶配方大约注入玻璃板的2/3轻轻在其顶层加入少量去离子水以磨平胶面。
实验5 聚丙烯酰胺电泳分离LDH
LDH同工酶分布于动物各组织、各种微生物和植物中。 心、肾以LD1为主，LD2次之； 肺以LD3、LD4为主； 骨骼肌以LD5为主； 肝以LD5为主，LD4次之。 血清中LD含量的顺序是LD2>LD1>LD3>LD4>LD5。
由于同工酶在不同的组织器官中分布不同，即具有组织特异性，
所以常用同工酶谱作临床诊断的依据及生物分类、遗传标记中。
一、目
的
复习有关同工酶的知识； 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢 酶同工酶原理、底物染色原理 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢 酶同工酶及底物染色操作技术。
二、原
理
以聚丙烯酰胺凝胶为支持物进行电泳，分离小鼠脏 器中乳酸脱氢酶； 分离后有5个同工酶区带，由正极开始向负极依次 为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5；
电极缓冲溶液：称取甘氨酸28.8g及三羟甲基 氨基甲烷（Tirs）6.0g，分别溶解后加蒸馏水 到1000mL，pH＝8.3。 – 样品稀释液：浓缩胶缓冲溶液25mL，加蔗糖 10g及0.05％溴酚蓝5mL，最后加水至100mL。 2. 5mg/mL氧化型辅酶Ⅰ溶液：称50mg NAD +,加蒸 馏水10mL，置棕色试剂瓶，4℃贮存可稳定两星 期 3. 1mol/L乳酸钠溶液：取60％乳酸钠9.25mL，加蒸 馏水定容至50mL，置棕色瓶4℃贮存。 4. 0.1mol/L氯化钠溶液：称0.584g NaCl，加蒸馏水 溶解并定容至100mL。
Separation gel Lower gel buffer 30%聚丙烯酰胺 dH2O TEMED 10%AP
7.5％ 5mL 5mL 10mL 20μ L 100μ L
9％ 5mL 6mL 9mL 20μ L 100μ L
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
凝胶模由两块玻璃板（一块长板，一 块短板）和一个密封框组成，将它们按下 图组装，四周对齐，注意手指勿接触两块 玻璃板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。
注意：玻璃板（用海绵及洗洁精清洗）和梳子及 密封框一定要清洗干净。
不能 偷懒
垂直板电泳装置制胶装置组件
短板（凹形玻璃板） 长板（带间隔条玻板）
密封条（封胶条）
凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔 径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小 和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上 大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分 离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分 子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混 合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶 中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准 胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶 来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。
+ + NAD
乳 酸
氧 化 型 辅 酶
I
丙 酮 酸
还 原 型 辅 酶
I
1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心 肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到 阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、 LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提 出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H 和M亚基按不同比例组成的四聚体。
(2) 酶活性染色法
利用该酶催化特定化学反应后，产 物直接与特定的染料反应，生成颜色而 显色，或再发生其它反应，最终生成有 色物显色。酶活染色法利用该酶活性显 色，所以专一性强，一种方法只适用于 一种酶蛋白，使其显色而其它蛋白并不 被显色。
(3) LDH同工酶活性染色法原理
用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色 液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中 间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物 脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的 不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：
第四章实验五乳酸脱氢酶_LDH_同工酶的分离纯化
NAD+：10 mL NBT：10 mL PMS：2 mL 0.5 M PH7.6 Tris-HCl: 15 mL 0.5 M乳酸钠：15 mL 0.1NaCl：5 mL 去离子水：43 mL
共计100 mL
四、实验操作
1.样品处理：1 g 组织切碎，加 pH 7.4 Tris-HCl缓 冲液10 mL，匀浆，10,000 g ，4℃，离心10 min，上
离子交换剂结构：以Sephadex-QAE A-50为例
葡聚糖 -N+(CH3)3 –Cl基质 功能基团 平衡离子
电荷基团 反离子
离子交换剂的种类
1 按基质种类不同： 离子交换树脂，离子交换纤维素，离子交换凝胶等
2 按功能基团不同： 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H)， 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 强碱型 含季胺基团 [-N+(CH3)3]，弱碱型 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2] 3 按平衡离子的性质不同：
ABC
D
E
A280
5 10 15 20 25 30 35 40 50
洗脱体积
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定：活性电泳 只做分离胶，胶倒好直接插上试样梳，进行聚合
编号 1 2 3 4 5
总体积
溶液名称 30% Acr –0.8% Bis pH 8.9 Tris -HCl TEMED 10% AP H2O
三、实验试剂
1、20 mM Tris-HCl，pH 7.4缓冲液； 2、A液: 20 mM Tris-HCl，pH 6.3缓冲液 3、B液: A液含60 mM NaCl 4、C液: A液含100 mM NaCl 5、D液: A液含150 mM NaCl 6、E液: A液含240 mM NaCl 7、QAE-Sephadex A-50准备：取1克QAE-Sephadex A-50于烧杯中加入100 mL A
生化实验课件 实验四、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清ldh
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3．缓冲溶液：
① pH值：溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度， 亦即决定Q。
② 离子强度：一般最适的离子强度在0.02～0.2 之间，溶液的离子强度越高，则电泳速度越慢。
③ 溶液粘度：迁移率与溶液粘度呈反比关系。
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4．电场强度（E）：
电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降， 也称电势梯度。
E↑，v ↑
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【聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）】
聚丙烯酰胺凝胶的性能 聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
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一、聚丙烯酰胺凝胶的性能
特性： ➢ 机械强度好，有弹性，透明，相对化学稳定，
对pH和温度变化较稳定，没有吸附和电渗作用。 ➢ 调节单体的浓度和交联度可以控制孔径大小。 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，能分离、小量制备
体浓度。
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【凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响】
凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包 括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。
T为凝胶总浓度，C为交联度。
T ab100% m
C b 100% ab
a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。
凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，
不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈
糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹
性并且透明。
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三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
实验三十二聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定
实验三十二聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法）目的要求(1)复习有关同工酶的知识．(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶、底物染色技术及有关原理.实验原理1959年Markert等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称LDH₁,，靠近阴极一端的称为LDH₅，；其余3种，由阳极到阴极依次命名为LDH₂，LDH₃及LDH₄。
它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶(1soenzyme)的概念．目前：已知LDH同工酶是由H亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H₄(LDH₁)，H₃M(LDH₂)，H₂M₂(LDH₃)，HM₃(LDH₄)及M₄(LDH₅)5种，这些LDH同工酶广泛分布于动物的各种组织以及微生物和植物中．心肌中以LDH₁，含量高，骨骼肌及肝中LDH₅含量高。
图是正常人血清、心肌和肝组织提取液的LDH同工酶图1.2.8 电泳模式图。
LDH同工酶底物染色显色反应如下：反应式中PMS为甲硫吩嗪(phenazine methosulfate)，NBT为氯化硝基四氮唑蓝(nitrroblue tetrazolium chloride)的缩写，它们都是接受电子的染料。
LDH与底物染色液在37℃温浴中脱下的氢最后传递给NBT生成蓝紫色的NBTH2称为甲 ，此物不溶于水，有利于显色后区带的保存，但可溶于氯仿及95%乙醇（9：1）的混合液。
因此，电泳后的显色区带可通过浸泡法浸出，于560nm比色，也可用光吸收扫描仪扫描得出LDH同工酶间相对百分含量。
目前，LDH及其同工酶检测已广泛用于临床，作为某些疾病鉴别诊断的依据，常用醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖电泳及聚丙烯酰胺电泳分离LDH及其同工酶，这3种不同支持物电泳及染色原理完全相同，但灵敏度不同。
因而正常值不完全相同。
本实验用连续PAGE 法分离LDH及其同工酶。
试剂与器材（一）材料人（动物）未溶血新鲜血清，动物组织提取液[组织重量与组织匀浆缓冲液体积比为1：5或1：10（g/ml）]。
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
【原创实用版】
目录
1.乳酸脱氢酶同工酶电泳简介
2.乳酸脱氢酶同工酶检测方法
3.乳酸脱氢酶同工酶结果分析
4.乳酸脱氢酶同工酶的作用
5.结论
正文
一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介
乳酸脱氢酶同工酶电泳（ldhisol）是一种分离和检测乳酸脱氢酶同
工酶的方法，它可将人组织中乳酸脱氢酶分离出 5 种同工酶区带。
乳酸
脱氢酶同工酶的检测方法包括电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制法和酶切法等，但迄今最好的和用得最多的是电泳法。
二、乳酸脱氢酶同工酶检测方法
1.电泳法：乳酸脱氢酶同工酶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，可以将乳酸脱氢酶同工酶分离成五个区带。
2.离子交换柱层析法：离子交换柱层析法可以对乳酸脱氢酶同工酶进行分离和测定。
3.免疫法：免疫法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的抗原来进行测定。
4.抑制法：抑制法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的活性来确定其存在。
5.酶切法：酶切法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的降解产物来确定其存在。
三、乳酸脱氢酶同工酶结果分析
乳酸脱氢酶同工酶结果分析主要用于诊断疾病，如急性肾皮质坏死、各种血管内外溶血症、骨骼肌炎症、损伤及退化、肝损伤、癌等。
四、乳酸脱氢酶同工酶的作用
乳酸脱氢酶同工酶在生物体内参与乳酸的代谢过程，对维持细胞内外酸碱平衡具有重要作用。
此外，乳酸脱氢酶同工酶的变化还可以作为诊断某些疾病的参考指标。
五、结论
乳酸脱氢酶同工酶电泳是一种有效的检测方法，可以用于诊断多种疾病。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
6、电泳
将电泳槽架放入电泳槽内，倒入其余的电极缓冲液至正极槽(外槽)，按正负极位置放 上电泳槽盖，盖紧，并按正负极连接上电泳仪。用稳压挡将电压调至80V，待样品蓝带 全部进胶后，调高电压至150V，继续电泳，当指示剂溴酚蓝的蓝带泳动至胶底部并出胶 后半小时到40分钟，关闭电源，停止电泳，前后共约2.5-3小时。
CH2=CH
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素 的影响：
催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的和浓度使聚合时间控制在30—60内较好，过量 的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。
只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发产生自 由基的过程会被延迟，聚合时间延长。
聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离乳酸脱氢酶同工
酶
样品的消化（为下周实验做准备）
• 每2组取3支消化管，按下表操作
•
编号
1 （空白） 2（样品） 3（标准）
• 试剂处理
• 样品液
—
1
—
• 标准磷原液
—
—
1
• 去离子水
1
—
—
• 524
2
2
2
•
•
加小漏斗，300℃加热沸腾10分钟，250℃左右继续
•
消化3～4小时至溶液透明，冷却，待用。
蛋白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或大于其等电点的时，可带不同的净电荷， 所以也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电量多少、质点大小、形状都不同，决定 了各自在电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得以分离。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶ppt课件
制备延续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方 〔两组〕
凝胶溶液组成
体积
Tris-Gly缓冲液
5 mL
30%凝胶贮液
2.5 mL
重蒸水〔含TEMED〕
2.5 mL
10%AP
60μL
三、预备电泳： 将凝胶板安装在电泳槽本体上 将凝胶板从制
胶安装上取下，安装到电泳槽本体上，使凹形氧化铝 板紧贴在本体的密封橡胶封条上，用弹簧夹夹紧，在 凝胶板和本体之间构成一个封锁的上液槽。
蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的分别要素
电荷要素 分子大小 分子外形
电荷要素 蛋白质分子外形和大小一样，所带电荷性质和 数量不同
分子大小 蛋白质分子外形和所带电荷性质和数量一样， 分子大小不同
分子外形 蛋白质分子所带电荷性质和数量一样，分子外
聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型
延续系统 是指电泳系统采用一样孔径的 凝胶、缓冲系统等条件下进展区带电泳，是利 用蛋白质分子的电荷效应进展分别，凝胶的分 子筛效应不明显，普通只用于分别一些比较简 单的样品，缺陷是分辨率不高。优点是制胶简 单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进 胶后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成 简单。
凝胶的总质量浓度T和交联度C决议凝胶的有效孔径。凝胶 的三维网状构造具有分子筛效应，不同大小和外形的大分子经 过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种 大分子迁移率不同得以分别。在实践任务中，常根据待分别蛋 白质知相对分子质量的大小来选择所适宜的凝胶浓度，使蛋白 质混合物得到最大限制的分别，大多数蛋白质在7.5%凝胶中能 得到称心的结果，所以这个浓度的凝胶称为规范胶。当分析一 个未知样品时，常用规范胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜 的凝胶浓度。
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果摘要：一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介二、乳酸脱氢酶同工酶电泳结果分析1.LDH1和LDH2的升高2.LDH5的升高3.LDH1/LDH2比值的意义三、乳酸脱氢酶同工酶电泳的临床应用1.急性心肌梗塞的诊断2.肝炎和肝损伤的诊断3.骨骼肌损伤和疾病的诊断正文：乳酸脱氢酶同工酶电泳（LDHI）是一种检测血清中乳酸脱氢酶同工酶活性的方法，对于诊断某些疾病具有重要的临床价值。
本文将介绍乳酸脱氢酶同工酶电泳的基本原理和结果分析，以及其在临床上的应用。
一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介乳酸脱氢酶（LDH）是一种的四聚体酶，由M型和H型亚基组成。
在电泳过程中，LDH同工酶会在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离出来，通过观察各同工酶的分布和活性，可以对某些疾病进行诊断。
二、乳酸脱氢酶同工酶电泳结果分析乳酸脱氢酶同工酶电泳结果主要包括LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5的活性分布。
其中，LDH1和LDH2的活性升高，常见于急性心肌梗塞发作后。
这是因为心肌细胞受损后，LDH1和LDH2会从细胞内溢出，导致血清中活性升高。
此外，LDH5的升高，常见于肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤等情况。
而LDH1/LDH2比值的升高，对诊断急性心肌梗塞具有较高的敏感性和特异性。
三、乳酸脱氢酶同工酶电泳的临床应用乳酸脱氢酶同工酶电泳在临床上的应用主要包括以下几个方面：1.急性心肌梗塞的诊断：乳酸脱氢酶同工酶电泳结果中，LDH1和LDH2的活性升高，以及LDH1/LDH2比值的增加，对诊断急性心肌梗塞具有较高的价值。
2.肝炎和肝损伤的诊断：血清中LDH5活性的升高，有助于诊断肝炎、急性肝细胞损伤等情况。
3.骨骼肌损伤和疾病的诊断：LDH1和LDH2活性的升高，可以作为骨骼肌损伤和疾病的辅助诊断指标。
总之，乳酸脱氢酶同工酶电泳作为一种检测血清中乳酸脱氢酶同工酶活性的方法，在临床诊断中具有一定的应用价值，尤其在急性心肌梗塞、肝炎和骨骼肌损伤等疾病的诊断中具有重要意义。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶.
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶【目的要求】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质的操作技术。
【实验内容】乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同，pI各不相同，在同一pH条件下带电荷多少不同，在电场中移动速度不同，可用电泳法将其分离。
采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳可将新鲜血清中的乳酸脱氢酶同工酶进行分离，然后用由乳酸、NAD+、PMS、NBT组成的染色液染色，显示清楚的五条色带，即五种乳酸脱氢酶同工酶，从阳极到阴极分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。
最后将分离的乳酸脱氢酶凝胶柱用波层层析扫描仪在560nm波长处扫描，测出光密度，计算出各种LDH同工酶的百分含量。
【实验材料】1．仪器与材料真空泵、圆盘电泳槽、电泳仪、刻度吸管、微量加样器、长头注射器、烧杯等。
2．试剂30％丙烯酰胺贮存液、催化剂1％过硫酸铵、1％TEMED缓冲液、电泳槽缓冲液、蔗糖、乳酸钠、辅酶I、PMS、NBT、7.5%醋酸溶液3．样品血清【基本步骤】1. 准备玻璃管：准备5×60mm玻璃管若干支，洗净烤干，管下端套一密塞的橡皮套或瓶塞，垂直插入管架上。
2. 配制凝胶：TEMED缓冲液 1.5ml30%Acr-Bis溶液 4ml蒸馏水6ml混匀真空抽气5分钟0.14%过硫酸铵6ml轻轻摇匀准备装管3. 装管：用细长滴管或长头注射器吸取凝胶装入玻璃管中，高度距离管上口8mm为宜，检查管内无气泡后，向胶面缓缓注入蒸馏水约4mm高度，在自然光下聚合约40分钟，见水与胶之间有明显界面出现，为胶已聚合。
用滤纸条吸取凝胶上方水层，取下管底部的橡皮套管，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致。
4. 加样：用微量加样器每管加血清—蔗糖稀释液100ul，（血清1份，40%蔗糖6份，溴酚兰少许混合而成）。
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5、蛋白质、核酸在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离原理 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分 子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其 亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子 中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动 的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质 的pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统 中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极 迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓 冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移， 称为阴极电泳。
2. 区带电泳
在一些惰性支持介质上进行电泳，电泳后不 同组分由于带电多少不同，移动距离不同，在支 持物上形成带状区间。 常见的惰性支持物有： 滤纸 称纸电泳 醋酸纤维素薄膜 薄膜电泳 淀粉、琼脂(糖)、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为支持 物的区带电泳。
3. 聚丙烯酰胺凝胶的形成与结构 *主要成分 单体：丙烯酰胺(Acr) 交联剂：N,N’- 甲叉双丙烯酰胺(Bis) 聚合反应 AP-TEMED催化体系： 过硫酸铵 (AP) 催化剂 四甲基乙二胺 (TEMED) 加速剂 *结构 三维网状结构的凝胶
生物化学实验
Biochemistry Experiment
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
（活性染色鉴定法）
RNA样品的消化（为下周实验做准备）
• 每2组取3支消化管，按下表操作
编号 试剂处理
1 （空白） 2（样品） 3（标准）
— — 1 2 1 — — 2 — 1 — 2
RNA样品液 /mL 标准磷原液 /mL 去离子水 /mL 5mol/LH2SO4 /mL
B液 30%凝胶贮液
2.5 mL
5 mL
去离子水 10%AP（最后加）
12.2 mL 300μL
3、灌胶液
沿玻璃板尽快加入两块玻璃板之间 的缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液 面距短板上缘0.3 cm时，立即轻轻将样 品槽模板插入凝胶溶液中，注意样品槽 中不要有气泡，凝胶溶液应充满样品槽 间隙。制胶装置室温垂直放置，30~60 min聚合反应完成。
加小漏斗，300℃加热沸腾10分钟，250℃左右继续 消化3～4小时至溶液透明，冷却，待用。
三、【操作步骤】
电泳装置
采用北京六一仪器厂的DYC型垂直板 电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套 电泳装置，两套电泳槽共用一台电泳仪。
1、安装制胶装置
凝胶模由两块玻璃板（一块长板，一 块短板）和一个密封框组成，将它们按下 图组装，四周对齐，注意手指勿接触两块 玻璃板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。
注意：玻璃板（用海绵及洗洁精清洗）和梳子及 密封框一定要清洗干净。
不能 偷懒
垂直板电泳装置制胶装置组件
短板（凹形玻璃板） 长板（带间隔条玻板）
密封条（封胶条）
+ + NAD
乳 酸
氧 化 型 辅 酶
I
丙 酮 酸还 原 型 辅 酶 NhomakorabeaI
1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心 肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到 阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、 LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提 出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H 和M亚基按不同比例组成的四聚体。
蛋白质在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素
电荷因素
分子大小 分子形状
• 电荷因素 • 分子大小 • 分子形状
蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
6. 聚丙烯酰胺凝胶电泳类型 （1）按电泳槽形式不同分 管状 垂直板型 ( 蛋白质、核酸分离 ) 水平板型 ( 核酸分离 )
(2) 酶活性染色法
利用该酶催化特定化学反应后，产 物直接与特定的染料反应，生成颜色而 显色，或再发生其它反应，最终生成有 色物显色。酶活染色法利用该酶活性显 色，所以专一性强，一种方法只适用于 一种酶蛋白，使其显色而其它蛋白并不 被显色。
(3) LDH同工酶活性染色法原理
用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色 液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中 间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物 脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的 不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：
聚合反应过程AP-TMTED催化体系
★
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
★
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
•
★
Bis将单体长链间连成网状结构：
CH2=CH CH2=CH C=O
C=O
丙烯酰胺
NH CH2 NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉
NH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O NH2 C=O NH CH2 NH C=O C=O NH2
LDH同工酶亚基的聚合
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中， 动物各组织中LDH同工酶各组分含量不同。临 床上对LDH及同工酶的检测可作为某些疾病诊 断的依据之一。
3、乳酸脱氢酶同工酶活性染色原理
(1) 电泳染色方法 不同物质染色方法不同，如核酸与蛋白质 不同，不同蛋白质之间也不同如糖蛋白与脂蛋 白，蛋白质染色方法很多： * 一般染色方法 是利用某些染料如氨基黑、考马斯亮蓝、 或银液与蛋白质结合形成黑色或蓝色条带，显 示出蛋白质区带位置，其专一性不强，凡系蛋 白质均可呈色。 * 特殊染色法 如针对糖蛋白或脂蛋白的染色法，针对不 同酶的活性染色法。
电泳进行中
一、【实验目的】
1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 原理和有关同工酶的知识。 2. 掌握连续系统聚丙烯酰胺凝胶电 泳分离乳酸脱氢酶同工酶及酶活性 染色的操作技术。
二、【实验原理】
（一）. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
1. 电泳定义和蛋白质电泳基本原理 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反 的电极移动的现象。 许多生物分子都可带电荷，如蛋白质、核酸 等，这些带电胶体颗粒在电场中均可移动。以蛋 白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或 大于其等电点的pH时，可带不同的净电荷，所以 也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电 量多少、质点大小、形状都不同，决定了各自在 电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得 以分离。
移向负极
移向正极
蛋白质分子
COOH COO－ ＋ H+ ＋ NH3 NH3＋ － H+
蛋白质分子
COO－ COO－ －H+ NH3＋ 蛋白质分子 + NH ＋ ＋H
3
COO－ COO－ NH3＋ NH2
（总电荷：＋） pH＜pI
（总电荷：0） pH=pI
（总电荷：－） pH＞pI
不同pH条件下蛋白质分子在电场中运动状态示意图
（二）. PAGE分离乳酸脱氢酶(LDH)同工酶原理
1、同工酶概念 催化相同化学反应，但其酶蛋白的 结构、组成略有不同，表现出理化性质 和动力学性质不同的一组酶。 2、LDH同工酶催化的反应
COOH OH CH CH
LDH
pH8.8-9.8 pH7.4-7.8
COOH CH CH O + NADH + H +
凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔 径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小 和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上 大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分 离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分 子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混 合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶 中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准 胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶 来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。
注意：不能漏水
胶凝后用夹子将玻璃夹出
用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉
旋转180度，凹玻璃向里
将玻璃放进槽内
加缓冲液
5、 加样
小心将微量注射器伸入样品槽底部上方，不 要扎到凝胶，分别在每个加样槽内按下列 顺序和体积慢慢推入蓝色样品液(含蔗糖和少量 溴酚蓝)，使其沉降到底部形成集中窄的蓝带。 每位同学加四种，两边的槽不加。 心肌 脑 骨骼肌 肝 心肌 脑 骨骼肌 肝 5µ L 10µ L 5µ L 3µ L 5µ L 10µ L 5µ L 3µ L
几种常见的电泳槽
(2) 按制胶方式不同分 连续系统 只有一层 分离胶， 浓度均一。 不连续系统 制二层胶 分离胶 高浓度，浓度 均一。浓缩胶 低浓度
(3) 按分离原理不同分：
* 常规PAGE也称天然状态生物分子PAGE ， 即在电泳过程中，生物分子如蛋白质仍保持 天然构象、亚基之间的相互作用及生物学活 性。是根据被分离组分的电荷、大小和形状 三种因数综合效果进行分离。用于蛋白质、 核酸一般分离分析。 * SDS-PAGE 根据被分离物的分子量大小差 异进行分离，多用于测定蛋白质分子量。
式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)， m为溶液的终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时， 凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使 用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并 且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。
6、电泳
将电泳槽架放入电泳槽内，倒入其余 的电极缓冲液至正极槽(外槽)，按正负极 位置放上电泳槽盖，盖紧，并按正负极 连接上电泳仪。用稳压挡将电压调至80V， 待样品蓝带全部进胶后，调高电压至 150V，继续电泳，当指示剂溴酚蓝的蓝 带泳动至胶底部并出胶后半小时到40分 钟，关闭电源，停止电泳，前后共约2.53小时。