聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGEppt课件
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聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 步骤 详细ppt课件
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AP胺在单水体溶的液双中键能打产生开游，离活基化S形O4成2-.自，由使基丙丙烯酰烯 酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形 成凝胶
TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-.
注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件 下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔 绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
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（1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式
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（2）亚甲双丙烯酰胺
（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）
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讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
思考题
名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。
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讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
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化学聚合法聚合成小孔胶
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分离原理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大 孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
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2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移
AP胺在单水体溶的液双中键能打产生开游，离活基化S形O4成2-.自，由使基丙丙烯酰烯 酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形 成凝胶
TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-.
注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件 下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔 绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
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（1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式
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（2）亚甲双丙烯酰胺
（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）
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讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
思考题
名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。
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讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
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化学聚合法聚合成小孔胶
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分离原理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大 孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
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2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移
聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt课件
精选ppt
18
5 .电泳
将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接 通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待 样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝 染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢 药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加 样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为 前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色， 直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
104 104–105 105-2×106
核酸(RNA)
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
15–20 5-10 2-2.6
精选ppt
5
当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移 率超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性：
(2)分子筛效应
(3)电荷效应
精选ppt
10
图4 电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的
区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称
PAGE)。
精选ppt
3
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不 溶；
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验课件
注意：加样前先倒入电泳缓冲液，没过短玻璃；上样时不 注意：加样前先倒入电泳缓冲液，没过短玻璃； 要扎破加样孔，也要避免样品溢出。 要扎破加样孔，也要避免样品溢出。
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电泳
在电泳槽中注入Tris-甘氨酸缓冲液， 在电泳槽中注入Tris-甘氨酸缓冲液，样品 Tris 端接负极(短玻璃的一边) 电压控制在120V 120V， 端接负极(短玻璃的一边)，电压控制在120V， 电泳约1 1.5小时 小时, 电泳约1～1.5小时,溴酚蓝距离分离胶底端 1cm。 1cm。
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加样
样品制备：取大肠杆菌培养物1ml 6000rpm离心 1ml， 离心5 样品制备：取大肠杆菌培养物1ml，6000rpm离心5 分钟，弃上清，用100ul蒸馏水重悬，加 分钟，弃上清， 100ul蒸馏水重悬， 蒸馏水重悬 buffer沸水煮沸 分钟，10000rpm离 沸水煮沸5 25ulloading buffer沸水煮沸5分钟，10000rpm离 5m； 心5m； 聚合后，将凝胶板取出，置于电泳槽中， 聚合后，将凝胶板取出，置于电泳槽中，短玻璃 朝内，加入电泳缓冲液，小心拔去加样梳， 朝内，加入电泳缓冲液，小心拔去加样梳，用微 量进样器吸取10ul样品，加入凝胶的每个凹槽中。 10ul样品 量进样器吸取10ul样品，加入凝胶的每个凹槽中。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损 剥胶时要小心，
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结果观察
第二天观察结果
蛋白质Marker 蛋白质
Marker
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思考题
样品为什么会在浓缩胶内被压缩成狭窄的 一条带？ 一条带？ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质的什 SDS么性质将其分离？ 么性质将其分离？
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电泳
在电泳槽中注入Tris-甘氨酸缓冲液， 在电泳槽中注入Tris-甘氨酸缓冲液，样品 Tris 端接负极(短玻璃的一边) 电压控制在120V 120V， 端接负极(短玻璃的一边)，电压控制在120V， 电泳约1 1.5小时 小时, 电泳约1～1.5小时,溴酚蓝距离分离胶底端 1cm。 1cm。
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加样
样品制备：取大肠杆菌培养物1ml 6000rpm离心 1ml， 离心5 样品制备：取大肠杆菌培养物1ml，6000rpm离心5 分钟，弃上清，用100ul蒸馏水重悬，加 分钟，弃上清， 100ul蒸馏水重悬， 蒸馏水重悬 buffer沸水煮沸 分钟，10000rpm离 沸水煮沸5 25ulloading buffer沸水煮沸5分钟，10000rpm离 5m； 心5m； 聚合后，将凝胶板取出，置于电泳槽中， 聚合后，将凝胶板取出，置于电泳槽中，短玻璃 朝内，加入电泳缓冲液，小心拔去加样梳， 朝内，加入电泳缓冲液，小心拔去加样梳，用微 量进样器吸取10ul样品，加入凝胶的每个凹槽中。 10ul样品 量进样器吸取10ul样品，加入凝胶的每个凹槽中。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损 剥胶时要小心，
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结果观察
第二天观察结果
蛋白质Marker 蛋白质
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思考题
样品为什么会在浓缩胶内被压缩成狭窄的 一条带？ 一条带？ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质的什 SDS么性质将其分离？ 么性质将其分离？
聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT)全
10% SDS
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
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3.0
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1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
精选2021版课件
2
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
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3
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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27
精选2021版课件
28
精选2021版课件
29
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30
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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31
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32
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33
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
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44
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
精选2021版课件
45
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
精选2021版课件
9
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
过氧化物酶染色原理
过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化 为蓝色或棕色产物
电泳装置
本实验采用不连续系统凝胶电泳，
整个电泳系统包括DYY型常压电泳
仪、夹心式垂直板电泳槽。
试剂
（1）1.5％琼脂 （3）分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) （5）浓缩胶缓冲液，pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) （2）核黄素溶液 （4）电极缓冲液，pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) （6）40％蔗糖溶液
实验4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析过氧化物酶同工酶
同工酶
• 电泳 是指带电粒子在电场中向与其自
身带相反电荷的电极移动的现象。
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
影响电泳速度的外界因素
1.电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度 （每一厘米）支持物体上的电位降 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速 度越快。 过高、过低均不宜 当需要增大电场强度以缩短电泳时间时， 需附有冷却装置
2．缓冲液的pH值和离子强度
pH 值距离其等电点愈远，其所带 净电荷量就越大，电泳的速度也 就越大
缓冲液通常要保持一定的离子强 度，一般所用离子强度为 0.020.2之间。
3.电渗现象
液体在电场中对于一个固体支 持物的相对移动，称为电渗现 象。
电渗方向影响泳动速率
4、温度的影响
温度每升高 1 ℃，迁移率约增加 2.4%。为降低热效应对电泳的影 响，可控制电压或电流，或在电 泳系统中安装冷却散热装置。
pH8.9
(a)
１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动。
SDS-PAGE 原理 步骤 详细介绍 含图片ppt课件
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
.
10
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才 具有较高的平衡浓度
.
11
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
.
27
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
.
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.
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
.
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34
.
35
.
36
分离胶聚合之后
.
37
.
38
.
39
.
40
.
41
不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度
.
15
.
16
.
17
.
18
.
19
（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
.
20
蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
.
1
一、什么是SDS
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在
.
10
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才 具有较高的平衡浓度
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（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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分离胶聚合之后
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不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度
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（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
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蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE
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1
一、什么是SDS
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在
§4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以具有分离复 杂体系的功能是因为其设计上具有如下特点： 一、电泳系统多种不连续性 (1)凝胶浓度的不连续：凝胶在一个体系中被制成 不同浓度的浓缩胶和分离胶，导致凝胶孔径不同。 浓缩胶浓度低，属于大孔胶，电泳中蛋白质颗粒 泳动遇到的阻力小，移动速度快。浓缩胶只起浓 缩作用，无分子筛作用；分离胶浓度高，属于小 孔胶，蛋白质进入分离胶后遇到的阻力增大，移 动速度减慢，具有了分子筛效应。
§4. 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为 支持介质用于生物大分子分析的常用电泳技术之一， 适用于低分子质量蛋白质、小于1kb DNA片段及 DNA序列分析等。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯 酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide,Acr）和交联剂 N, N′-亚甲双丙烯酰胺〔CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N′-methylenebisacryl -amide，Bis〕聚合而成。
分离DNA分子范围/bp 凝胶浓度T% C=3.3% 双链 1000～ 2000 80～500 单链 凝胶浓度T% C=3.3% 分离DNA分子范围 /bp 双链
3.5
750～2000
12.0
40～200
5.0
200～1000
15.0
25～150
8.0
64～400
50～400
20.0
6～100
②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中， 达到更高的灵敏度：10-9 ～10-12 mol L-1。③由于 聚丙烯酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚 物，侧链只有不活泼的酰胺基－CO－NH2，没有 带电的其它离子基团，化学惰性好，电泳时不会 产生“电渗”。
IEF-PAGE实验课件
pH梯度的建立
IEF-PAGE的优点和应用
优点：分辨率高（0.01pH），抵消扩散作用，可使很稀的样品达到高度 的浓缩，并同时测定等电点。特别适合于分离分子量相近而等电点 不同的蛋白质组分 。 缺点：1、聚焦要求用无盐溶液，在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀， 2、样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶 或发生变性的蛋白质。 应用：1、分析和制备。 2、测定等电点。 注意：有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应预先除去。蛋白质应不含 盐，因盐浓度高电流大，易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸碱， 占据了分离的有效部位。色素和酚类物质也会影响结果。同时要加 入蛋白质水解的抑制剂。此外，两性电解质的好坏是聚焦好坏的关 键之一。加样体积不受限制，最高可达80-85毫升。
1、分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 2、可溶性好，便于等电聚焦过程中pH梯度的形成和蛋白质样品的迁移。 3、缓冲能力强，避免聚焦的蛋白质在等电点引起pH梯度的局部改变和溶 解性能的下降。 4、导电性均匀，排除电场的不均匀而导致凝胶局部过热。 5、紫外吸收低，不发荧光。 6、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组 成不同于蛋白质。
影响等电聚焦的因素
7、样品与处理与加样的方法： 样品预处理：盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。 为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用 SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液 中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。 加样量的确定：加样量则取决于样品中蛋白质的种类、 数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色， 加样量可为50-150 g；如用银染色，加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积 为10-30 l。 8、电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染 色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在 10%-15％的三氯乙酸中去除两性电解质，然后再以适当 的方法染色。我们使用的是改良的考马斯亮蓝染液，染色 的同时进行脱色。
2019年SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt
• 聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的 梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的 空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 • 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比 加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。 • 浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电 泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出 凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 • 按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。 • 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进 入分离胶后，把电压提高到 15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分 离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。 • 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔 （第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
实验材料和试剂
• 试剂 丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺 十二烷基硫酸钠（SDS） 用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液 TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 样品处理液（50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巯 基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油） 染色液（0.1% 考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇10% 冰醋酸） 脱色液（10% 甲醇，10% 冰醋酸）
3.用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色 • 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马 斯亮蓝R250染色。染色1～2小时或过夜。 4.换脱色液脱色，需3～10小时，其间更换多次脱色液至 背景清楚。
• 此方法检测灵敏度为0.2～1.0 mg。脱色后，可将凝胶
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常数 斜率
迁移率
通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量。
注意事项
1.SDS的纯度：市售SDS(A.R.)需重结晶后再用。 2.SDS与蛋白质的结合量：大多数1.4g SDS/g蛋白质
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个： (1)溶液中SDS单体的浓度 (2)样品缓冲液的离子强度 (3)二硫键是否完全被还原
10% SDS
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
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-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
混合样品
大分子
电泳方向
电泳 带孔胶
不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图
小分子
按分子 大小分离
流程图
结果分析
1.相对迁移率的计算
相对迁移率mR =蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图
2.标准曲线的绘制
以每条Marker带的相对迁移率为横坐标，相应分 子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图
SDS－聚丙烯酰胺凝 胶电泳测定蛋白质
相对分子质量
概述
❖1967年由Shapiro建立。 ❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电 泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷 因素可以忽视。
实验原理
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5.特殊蛋白质的相对分子质量：不是所有的蛋白
质都能用SDS-PAGE测定其分子量。包括：电荷异常 或
构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些 糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。
6.对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。
SDS-PAGE分类
SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连 续 系统和不连续系统两大类： ❖ 连续系统：由电极缓冲液和分离胶组成。电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作 用下，主要靠电荷和分子筛效应。 ❖ 不连续系统：由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组 成。缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均 不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效 应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条 带清晰度及分辨率均较前者佳。
3.凝胶浓度：应根据位置样品估计相对分子质量，
选择适当的凝胶浓度。测定蛋白质相对分子量时， 必须同时作标准曲线，不能利用这次的标准曲线 作为下次用。
4.多亚基蛋白的分子量：有许多蛋白质，是由亚
基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋 白酶）组成的， SDS-PAGE测定的只是它们的亚基
或 单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。
1×105～5×105 ＞5×105
分离胶的浓 度
20%～30%
15%～20%
10%～15%
5%～10%
2%～5%
有不同的配制方法。（以不连续体系为例）
试剂名称
分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液 （pH8.8Tris-HCl） 浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） 浓缩胶缓冲液 （pH6.8Tris-HCl）
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基本原理
❖SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和
疏水作用，去多肽折叠。
❖巯基乙醇或DTT是还原剂，能打开二硫键，
因此使蛋白质分子处于伸展状态。 Байду номын сангаас 此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复
合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。
导致：
1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷 远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的 电荷差异。
2.00 2.00 2.00 2.00
11.8 10.20 8.54 7
5.20
混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
2.00 4.60
2.分离胶的制备
胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速 聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。
3.浓缩胶的制备
用滤纸吸干水→倒入 浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。
实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
实验步骤
一、制胶
1.配胶
配胶应根据所测蛋 蛋白质的相对分子量
白质相对分子质量范
的范围 ＜104
围选择适宜的分离胶
1×104～4×104
浓度。由于SDS-PAGE
4×104～1×105
有连续体系和不连续 体系两种，两者各有 不同缓冲体系，因而
相对迁移率
Native-PAGE和SDS-PAGE的比 较
与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程 中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：
1.凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性 凝胶有SDS。
2.样品缓冲液中非变性凝胶不仅没有SDS，也没有 巯基乙醇。
二、样品处理与加样
1.样品处理
样品 样品溶溶解液解 沸水浴 冷却
2.加样
小心拔出梳子 上下槽 注入电极缓冲液 用
微量进样器点样
三、电泳
加样
样品 迁移 方向
接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开 开关，保持恒压进行电泳。
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分 子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的 SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子 量的大小成正比变化。
这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移 率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是 椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。
当蛋白质的分子量在15000～200000之间时 ，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分 子量的对数呈线性关系，符合下列方程：
量分 子
相对迁移率
3.未知蛋白质样品分子量的测算
计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线 上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。 如图
标准蛋白分子量
在一定的凝胶浓度下， 多肽链分子量的对数与 多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通 过标准曲线求未知多肽 链分子量。
未 知 蛋 白
SDS-PAGE测定蛋白质分子量示意图