聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1)
蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的1.掌握垂直电泳槽的基本操作过程。
2.熟悉SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
实验原理SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据蛋白质分子所带电荷的差异和分子大小的不同产生的不同迁移率，从而将蛋白分离成若干条带。
在催化剂过硫酸铵（APS）和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下，丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）聚合交联形成具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
SDS是一种阴离子表面活性剂，能与蛋白分子结合形成复合物，使蛋白所带的负电荷远远超过其原有的电荷，从而掩盖了各种蛋白分子间原本的电荷差异。
因此，电泳时的迁移率不再受蛋白原有电荷和分子形状的影响。
实验器材垂直电泳槽、电泳仪、移液器、移液器吸头、烧杯等。
实验试剂30%（29∶1）Arc-Bis溶液、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）、TEMED、10%APS、5×蛋白电泳缓冲液、10×蛋白上样缓冲液、蛋白标准液、考马斯亮蓝R-250染色液、考马斯亮蓝脱色液等。
实验操作（1）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶：将制胶的凹型玻璃与平玻璃固定在制胶夹板上，确保不漏水后按以下配方配制12%的分离胶。
30%（29∶1）Arc-Bis溶液3ml分离胶缓冲液（pH8.8） 1.95mlH2O 2.55ml10%APS 75μlTEMED 30μl（2）混匀分离胶后，尽快灌至两块玻璃板的间隙中，在距离较短玻璃板2～3cm处停止灌胶，同时加入1～2ml的去离子水覆盖凝胶，室温静置10～20min。
（3）分离胶聚合后倒去水层，用滤纸把剩余水分吸干，按以下配方配制4%的浓缩胶。
30%（29∶1）Arc-Bis溶液650μl浓缩胶缓冲液（pH6.8） 1.3mlH2O 3ml10%APS 50μlTEMED 18μl（4）混匀后将浓缩胶灌注至已聚合的分离胶上，当灌注至与较短玻璃板顶端相齐时，立即插入梳子，同时避免产生气泡。
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE
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凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关
二、电泳的原理
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ native－PAGE）
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生物大分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的核酸或蛋白质，它们的分子量大小及构 型不同，所带净电荷的多少不同。电泳时的泳动率就不 同，从而分出不同的区带。在电泳分离后能保持蛋白质和 酶等生物大分子的生物活性。
三、电泳操作流程 (SDS-PAGE)
1.制备PAGE胶
固定玻璃板 灌注分离胶，水封, 静置待凝固 吸干水，灌注浓缩胶，插入梳子, 静置待凝固
注意： a.催化剂TEMED要在注胶前加入,否则胶凝结而无法灌注. b.空气中的氧气的存在影响凝胶的聚合，因此，水封的 目的是隔绝空气中的氧气，并且使分离胶顶部平整。
相对迁移率 mR ＝
蛋白质样品区带中心迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心迁移距离(cm)
四、电泳的应用
常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳适合于核苷酸多态性和蛋 白质的分析、分离。 SDS-PAGE则常用于测定蛋白质的分子量和蛋白质的 亚基数。目前已发现有些蛋白质不能用 SDS-PAGE测定分 子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的 蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。
c.Acr和Bis具有神经毒，操作时应戴手套。Acr/Bis储液于棕色 瓶4℃保存。
2.加样
电泳槽内注入电极缓冲液， 使其完全淹没浓缩胶顶部， 小心拔出梳子
经SDS处理的样品， 于沸水中加热3 min， 以除去亚稳态聚合。
用微量移液器于距 槽底三分之一处进样
3.电泳
加样后的凝胶，应立即电泳。 样品进浓缩胶，电流控制在20－30 mA； 样品进分离胶，电流控制在40-50 mA。 待溴酚蓝条带泳动到距离胶板前沿约1-2cm处， 停止电泳。
电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳
.电泳技术.第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术.常见电泳技术第二节纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳梯度凝胶电泳等电聚焦电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹电泳毛细管电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE.PAGE应用围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。
.1、聚丙烯酰胺凝胶的特点①可用于分离不同分子量的生物大分子聚丙烯酰胺凝胶的特点②更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L③化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”④电泳分离的重复性好⑤透明度好，便于照相和复印⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存.⑦无紫外吸收⑧可用作固定化酶的惰性载体2、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应凝胶单体丙烯酰胺加速剂四甲基乙二胺AcrTEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素.（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）= abmbab100100其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b＞100 a/b=30 凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性C=6.5−0.3T不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。
当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。
其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。
(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml 与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。
(5)染色液取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脱色液 7％醋酸溶液。
3.操作(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。
(2)标准品溶液及供试品溶液的制备(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
（四）方法
连续电泳 PAGE
电荷效应 分子筛效应 电泳体系中所用的缓冲液 成分、pH、 成分、pH、凝胶浓度相同 浓度及电位梯度呈不连续性 电荷效应 分子筛效应 浓缩效应： 浓缩效应：不连续性所致
不连续电泳 缓冲液离子成分、pH、凝胶 缓冲液离子成分、pH、
不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好， 不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好， 分辨率高，是最常用的体系。 分辨率高，是最常用的体系。
制板 制备分离胶 制备浓缩胶 加样 电泳及结果检测 染色和脱色
2. 操作步骤 垂直板状电泳） （垂直板状电泳）
蛋白质样品在100℃用SDS和DTT 蛋白质样品在 ℃ 和 处理3~5分钟后解聚成亚基 处理 分钟后解聚成亚基
SDS和还原剂的作用： SDS和还原剂的作用： 和还原剂的作用
（1）分子被解聚成组成它们的多肽链 ） （2）氨基酸侧链与 ）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的 充分结合形成带负电荷的 蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷 胶束；蛋白质 蛋白质 胶束 胶束所带的负电荷 达到超过了蛋白质分子原有的电荷量， 达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同 分子之间原有的电荷差异。 分子之间原有的电荷差异。
蛋白质-SDS胶束的特点： 蛋白质-SDS胶束的特点： 胶束的特点
（1）形状像一个长椭圆棒 ） （2）短轴对不同的蛋白质亚基 ）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相 胶束基本上是相 同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 ）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于 系统中的电泳迁移率主要取决于 胶束在 椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。
凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。
不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示：表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b3.51000－2000 460 1005.080－500 260 658.060－400 160 4512.040－200 70 2015.025－150 60 1520.0 6－100 45 12a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。
聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。
聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。
在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。
聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。
聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。
常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶：（1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶（2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳【原理】非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化小分子双链DNA片段（<1 000bp），多数双链DNA在此胶中的迁移率大略与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成和序列的影响，同等大小的DNA分子可能由于空间结构的不同而使迁移率相差10％，故不能用它来确定双链DNA 的大小。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）CHANG X C[实验目的]（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
[实验原理]电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。
最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。
“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。
这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。
在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。
可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤
C. 银染检测灵敏度高100-1000倍。
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1.2ml 4.3ml 1.9ml 112ul 5ul
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2. 浓缩胶制备的方法
(1). 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液 0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10 ％过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后， 立即灌胶。
(2). 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中， 然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹 心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地 去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完 全后即可拔去梳子，准备电泳。
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二、试剂
A. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis) 称取丙烯 酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤后存 于棕色瓶中，于4℃保存。
B. 4X分离胶缓冲液 称取Tris 18．17g，加入10%SDS贮备液 4ml，用12mol/L HCl调pH至8，8，定容至100ml。
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3. 样品制备及电泳
(1). 样品处理：蛋白质样品和分子量标准蛋白质在 上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶 液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf 管中，将混合物置于95-100℃加热5分钟，立即 置于冰上，或于-20℃储存，以便再次分析时使 用。
(2). 上样：样品制备好以后，即可上样电泳。先将 样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然 后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽 中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验 的需要加样电泳。
C. 4X浓缩胶缓冲液 称取Tris 6.06g，加入10%SDS 4ml，用 l2mol/L HCI调pH至6．8，定容至100ml。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法(一)管型盘状电泳1.仪器和设备图8 管型盘状电泳槽结构A为正面B为剖面(1)分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7(3)电极缓冲液PH8.3电泳槽：盘状电泳槽国内有很多单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。
电泳仪：国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ型，电压在0～600v内任意调节，电流输出0～100mA，这类电泳仪比较恰当。
玻璃管：选择粗细均一的圆玻璃管，内径5～7mm左右，管长70～100mm。
管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。
聚胶架：普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。
微量注射器或微量进样器：加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用25.50或100μl的微量进样器加样，也可用50或100μl加液器代用。
普通注射器：主要用于灌胶和剥胶，20～30ml，附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。
其他：日光台灯，PH计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平等。
2.试剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵；核黄素(V B2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；盐酸等。
丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。
(1)丙烯酰胺纯化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃)，热滤，滤液凉后置-20℃冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。
结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。
(2)甲叉双丙烯酰胺纯化法：12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml 40～50℃丙酮，加热过滤，滤液置-20℃冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能： Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。
在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。
由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的―外衣‖，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。
实验五 电泳技术 PAGE
1、概述：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electropho resis PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持 介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好， 有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没 有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质 。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简 称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。
-
2 样品溶液
Tris-glycine 8.3
-
3凝 4胶
浓缩胶 分离胶
Tris-HCl Tris-HCl
6.9
5%
8.3 7.5~20%
5 下层 (正极) 缓冲液 Tris-glycine 8.3
-
● 凝胶不连续性具有浓缩样品的的作用
■
电泳开始
垂
100~150 V
直 柱
-+
状
电
Upper
泳
chamber
⑤分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中， 集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高 的分辨率。
■ 聚合反应注意事项：
● APS 很容易因受潮而失活
■ 凝胶聚合的条件：
● 凝固时间与 APS 或 TEMED 量成反比
● 聚合程度 (%) 与温度成正比 但与 APS 浓度无关
三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶 网孔都是相同的；后者是指在电泳系统中采用了 两种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径，不连续 电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而 提高分辨能力。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
• 温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快， 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快， 而聚合的速度影响交联孔径的大小， 而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚 合时必须保持温度恒定， 合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温 度。 分子氧的存在会阻止碳链的延长， • • 分子氧 分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨 碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 • • 杂质 某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶 的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和 的化学聚合，所以应选择高纯度的 、 和 AP。 。
化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶， 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶， 重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 应选择合适的AP和 • 催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的 和 TEMED浓度使聚合时间控制在 浓度使聚合时间控制在30—60min内较好， 内较好， 浓度使聚合时间控制在 内较好 过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的 畸变。 畸变。 • pH TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在 只能以游离碱的形式发挥作用， 只能以游离碱的形式发挥作用 酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由 酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发 产生自由 基的过程会被延迟，聚合时间延长。 基的过程会被延迟，聚合时间延长。 •
凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响
• 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚 丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、 丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着 度及孔径大小的主要因素。 为凝胶溶液中单体和交联剂的 度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的 总质量浓度， 为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的 总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的 质量分数。 质量分数。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）首先安装垂直电泳槽的玻璃板和胶条。
加热废弃的琼脂糖凝胶，待凝胶稍冷却后用移液器小心吸取，封住玻璃板和胶条之间的空隙。
冷却至胶完全凝固。
（2）本试验采用30%丙烯酰胺（29:1）配成10%的聚丙烯酰胺凝胶。
（3）配好上述溶液后，用玻璃棒轻轻搅动使其充分混匀。
将事先封好的玻璃板以水平偏15°的角度端起，从玻璃板的一端缓缓倒入，注意不要产生气泡。
若出现气泡，可将玻璃板竖直放置，带气泡自动上升排除后再补充溶液。
灌胶完成后，立即插入在ddH2O中浸过的梳子，同样注意切勿在梳子齿下留有气泡。
（4）约40min待胶完全凝固后，水平地拔掉梳子，立即用蒸馏水冲洗点样孔，并用吸水纸将孔内的水吸干净，将板安放到电泳槽上，拧紧螺丝固定，在内、外槽中倒入合适量的1×TBE缓冲液。
（5）取5 μL PCR产物，瞬时离心后上样。
（6）在流水冷凝的条件下80～120 V电泳10～14 h（根据扩增片段大小、凝胶浓度以及胶板长度确定电压大小和电泳时间）。
（7）利用虹吸作用原理用吸耳球从电泳槽中移出缓冲液，松开螺丝取出胶板，用剥胶板分离两个玻璃板，剥胶前在凝胶上淋上少量的蒸馏水，并用针头划开凝胶边缘，保证剥胶时凝胶的完整性。
（8）胶片剥下后浸在蒸馏水中，同时用蒸馏水漂洗2次以去除残留的电泳液。
，加入染色液（2%氢氧化钠）浸没凝胶，置于摇床上避光轻摇15 min，再用蒸馏水轻轻漂洗2次，去除残留在表面的NaOH染色液。
最后加入0.1%的硝酸银显色，用量以浸没凝胶为准，置于摇床上避光轻摇15 min，硝酸银可回收利用2～3次，回收次数越多，显色时间越长。
（9）待条带清晰后，倒掉显色液，迅速用去离子水冲洗2～3次。
银染后的聚丙烯酰胺凝胶利用凝胶成像系统照相保存，留做分析统计。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(修)
电泳： 电泳条件 电压：120~140V 电泳时间：100分钟
染色 考马斯亮蓝R250染色（数小时或过夜）
漂洗 用漂洗液漂洗凝胶至背景透明。
主要注意事项
• 固定电泳槽螺丝要平均用力。 • 灌胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流
的通过。 • 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均有毒，对神
经、皮肤有刺激作用，操作时要小心。
3. 电荷效应 由于浓缩效应，蛋白质在浓缩胶与
分离胶交界处，被浓缩成狭窄条带，当它们进入 分离胶时，由于电泳处于均一体系，蛋白质分子 所带电荷多少就成为决定其迁移率的主要因素， 因此带电荷多的泳动速度快，带电荷少的泳动速 度慢，从而达到分离的目的。
PAGE的优缺点及其用途
优点：聚丙烯酰胺凝胶电泳是把分子筛效应和电
实验步骤
（一）试剂配制 （二）样品制备 （三）夹心式垂直电泳槽的安装 （四）配制、灌注聚丙稀酰胺凝胶 （五）上样、电泳、染色、固定保存
夹心式垂直电泳槽的安装
将梳子放在两块玻璃之间
配制、灌注聚丙稀酰胺凝胶
• 分离胶的制备 取凝胶储备液9.8ml，分离胶缓冲 液5.0ml，蒸馏水24.5ml，100g/L SDS 0.4ml, TEMED 0.1 ml, 100g/L 过硫酸铵溶液0.2ml, 混匀。
凝胶浓度与分离样品分子量的关系
总胶浓度（%） 20 15 10 8 5
分子量范围（kDa） 5~40 15~40 18~90
30~150 60~220
聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统即连续系统 与不连续系统，不连续系统中存在着三种不连续 即pH不连续、凝胶浓度不连续、溶液离子组成不 连续。样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进 入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。进入分 离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子 的蛋白质容易通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度 快；大分子的蛋白质则受到较大的阻力而被滞后， 这样蛋白质在电泳过程中就会根据各自分子量大 小而被分离。溴酚蓝指示剂为一种小分子物质， 可以自由通过凝胶孔径，用它显示电泳的前沿位 置。
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。
这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。
圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。
因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。
上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。
下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。
上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。
图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。
由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。
分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。
样品在其中进行电泳和分子筛分离。
蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。
进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。
由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲离子成分的不连续性。
(3)电位梯度的不连续性。
(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。
简述聚丙烯酰胺凝胶电泳
简述聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）是一种用于分离和分析生物分子的技术。
它基于不同分子在电场中的
迁移率差异，从而实现对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和鉴定。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺聚合而成的三
维网状结构。
在电泳过程中，将待分析的样本加载到凝胶孔中，然后
在电场作用下，分子会根据其电荷性质和大小在凝胶中移动。
较小的
分子会穿过凝胶中的小孔，而较大的分子则被阻挡在凝胶中，从而实
现分子的分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据凝胶的浓度和孔径大小来控制分离
的效果。
通常使用的凝胶浓度为 5%至 20%，孔径大小则根据待分析
的分子大小而定。
在电泳过程中，可以通过染色或荧光标记来检测分
子的位置和数量。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的生物化学技术，广泛应用于蛋白质、核酸等生物分子的分离、鉴定和纯化。
它具有分辨率高、操作简便、重复性好等优点，是生物化学研究中不可或缺的工具之一。
药典聚丙烯酰胺凝胶电泳
药典聚丙烯酰胺凝胶电泳（Pharmaceutical Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称Pharm PGAE）是一种用于药学和生物制剂分析的电泳技术。
这种电泳方法主要用于分离和检测药品和生物制剂中的蛋白质、多肽、核酸和其他生物大分子。
Pharm PGAE在药物研发、质量控制和生物制剂生产等领域起到了至关重要的作用。
下面将详细探讨Pharm PGAE的原理、步骤、应用和优势。
### 原理：Pharm PGAE的原理基于凝胶电泳的基本原理，即在凝胶介质中通过电场作用，根据生物大分子的大小、形状和电荷进行迁移分离。
这种技术采用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过改变凝胶的浓度和电场的强度来实现对不同生物大分子的高效分离。
### 步骤：1. **制备凝胶：** 使用聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）和交联剂（crosslinker）制备凝胶。
凝胶的浓度和孔隙度会影响分离效果，通常根据样品的性质进行优化选择。
2. **样品处理：** 样品通常需要在电泳前进行处理，如加入蛋白负载缓冲剂、热变性处理等，以确保最佳的电泳效果。
3. **加载样品：** 将处理好的样品加载到凝胶孔中。
加载的位置和数量取决于需要分离的生物大分子种类和数量。
4. **电泳分离：** 将凝胶浸泡在缓冲液中，然后施加电场。
生物大分子根据其大小和电荷在凝胶中迁移，最终形成带状图案。
分离的速度与电场的强度、凝胶浓度以及生物大分子的电荷和大小有关。
5. **染色与检测：** 完成电泳后，需要将凝胶染色以可视化分离的生物大分子。
染色剂的选择取决于要检测的生物大分子类型。
例如，蛋白质通常使用银染或共染色，核酸则使用荧光染料如乙溴铵溴化物（Ethidium Bromide）等。
6. **图像分析：** 利用成像设备（如凝胶文献仪）获取凝胶图像，然后使用专业软件进行带状图案的分析和生物大分子的定量。
### 应用：Pharm PGAE在药学和生物制剂领域有广泛的应用：1. **药物质量控制：** 用于分析药品中的蛋白质、多肽和其他生物大分子成分，确保药物的质量符合规定标准。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。
凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。
不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示：
表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b
3.51000－2000 460 100
5.080－500 260 65
8.060－400 160 45
12.040－200 70 20
15.025－150 60 15
20.0 6－100 45 12
a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30
b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。
聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。
聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。
在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。
聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。
聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA 纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。
常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶：
（1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶
（2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
【原理】
变性聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）存在的情况下聚合而成的，用于分离和纯化单链DNA（RNA）片段，核酸的迁移率和碱基的组成及序列无关，常用于：①测定双链DNA的长度；②回收寡核苷酸。
此方法迅速、简单、分辩率高，虽然产量较低（<50％所加样品），但也足以满足大部分工作的需要。
多用于分离同位素标记的探针、分析SI核酸酶的产物和DNA测序等。
【试剂及配制】：
1.5×TBE缓冲液（pH8.3）:54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),
加水至1L。
2.42％丙稀酰胺：丙稀酰胺40g，N,Nˊ-甲叉双丙稀酰胺2g，加ddH2O至100ml，
加热至37℃溶解，室温避光保存。
3.TEMED(Nˊ,Nˊ,NˊNˊ-四甲基乙二胺)。
4.尿素。
5.10%过硫酸铵（AP）。
6.2×甲酰胺上样缓冲液：
5×TBE 0.2ml
去离子甲酰胺 0.9ml
10%溴酚蓝 50μl
7.7.0.3mol/L乙酸钠（pH7.5）。
8.8.TE缓冲液（10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0）。
【操作步骤】
1.制备PAG-尿素凝胶，按寡核苷酸长度权择适当浓度的凝胶（12%，15%，19%的
尿素PAG分别对应被分离合适的寡核苷酸长度40～100,25～40，<25mer）。
按下列混合：称取25.2尿素（终浓度7mol/L）,取12ml 5×TBE，42%丙烯酰胺（所需量），加水至60ml，加10%AP200μlTEMED30μl，混合并倒胶（避免气泡产生），在室温下聚合30min以上。
2.取出样品梳，安装电泳装置，在电泳槽中入1×TBE，1500V电压预电泳15～
30min。
3.用等体积的2×甲酰胺上样缓冲液稀释样品（上样前可在90℃加热3min以消除
二级结构的干扰），产生清晰的带需要10μg寡核苷酸。
4.用TBE冲洗上样孔数次，洗净尿素，上样。
5.1500V电压进行电泳，当溴酚蓝迁移至凝胶底部时，停止电泳。
6.卸下玻璃板，取出凝胶块，染色或显影，检测DNA的位置。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
【原理】
非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化小分子双链DNA 片段（<1 000bp ），多数双链DNA 在此胶中的迁移率大略与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成和序列的影响，同等大小的DNA 分子可能由于空间结构的不同而使迁移率相差10％，故不能用它来确定双链DNA 的大小。
【试剂及配置】
1. 30％丙烯酰胺：丙烯酰胺29g ，N ，N'-甲叉双丙烯酰胺1g ，加水到100ml ，加热至37℃溶解，室温避光保存，存贮期间溶液pH 值应≤7.0。
2. 5×TBE 缓冲液（pH8.3）:54 Tris 碱，27.5硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水至1L 。
3. 10％过硫酸铵（AP ）：AP 1g 加水定容到10ml ，4℃下可存贮数周。
4. TEMED （N ˊ,N ˊ,N ˊN ˊ-四甲基乙二胺）。
5. DNA 分子量标准。
6. 6×凝胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF,30％甘油溶于水中。
7. 溴化乙锭（EB ）1mg/ml 或银盐染色法所需试剂。
【操作步骤】
1.用洗涤剂浸泡玻璃板，填条和样品梳，必要时用KOH/甲醇清洗（100ml 甲醇加5gKOH 配置），水洗后再用乙醇淋洗。
每块玻璃板的一面都用聚硅氧烷溶液处理，以防凝胶与玻片贴紧并减少卸胶时凝胶破裂的可能性。
2.装好灌胶用的玻璃片及垫条，用琼脂糖封住底、左、右三边。
（进口Bio －Rad 垂直板电泳设备可不用封胶）
3.依所分离DNA 的大小来确定合适的凝胶浓度，如表所示
表2 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积
制备不同浓度（％）凝胶所用试剂的体积 3.5 5.0 8.0 12.0 20.0
30％丙稀酰胺 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6 ddH 2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5×TBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 10％过硫酸铵 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
4.每100ml 胶液中加入35μlTEMED ，迅速混匀，用注射器注入胶床，插入样品梳，应密切注意胶内不要有气泡，检查有无凝胶渗漏。
5.室温下聚合约30min ，聚合完全时可见梳齿下二条折光线，小心拔出样品梳。
6.在电泳槽中加入1×TBE 缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔，并用缓冲液冲洗样品孔。
7.于DNA 样品加1/5体积6×凝胶上样缓冲液混合，小心注入样品孔中（加样量为3～5μl ）。
8.接上电极，以5V/cm （1～8V/cm ）的电压进行电泳。
9.
参照染料迁移至所需位置时，切断电源，取出凝胶。
按下列方法之一进
行染色或显影，检测DNA的位置：
（1）溴化乙锭染色法：由于PAG能抑制EB的荧光量，故用该法时，DNA量需大于10ng。
将凝胶和玻璃板一起放入含0.5μg/mlEB的1×TBE缓冲液中，30～45min后取出，水洗，紫外检测仪观察并照相。
（2）银盐染色法：
①10％乙醇固定3min；
②双蒸水洗1min；
③2%HNO3洗3min；
④双蒸水洗1min；
⑤0.18％AgNO3轻摇20min；
⑥双蒸水洗1min；
⑦3%Na2CO3显影30min（临用前配置，每100ml加入10μl甲醛）。
【问题与讨论】
●如何判断丙烯酰胺是否已聚合？
丙烯酰胺聚合后梳子下方可以看见折光率不同的纹线。
●“微笑”DNA是怎样造成的？
①凝胶太厚导致电泳时产生的热量很大，DNA条带出现微笑样弯曲
②电泳时电压太高，凝胶中部产热不同而致DNA条带弯曲
●为什么有时候DNA条带成波浪形弯曲或严重扭曲？
①在拔出梳子后没有立即彻底冲洗加样孔，梳子残留的少量丙烯酰胺溶液
在加样孔中聚合产生不规则的表面，引起DNA条带变形。
②在电泳槽和凝胶中使用的不是同一批次的电泳缓冲液，离子强度或PH值
的微小差异会形成缓冲液前沿，使DNA片断的迁移发生严重扭曲
●在银染中背景太深是如何造成的？
甲醛加的太多或是Na2CO3配置的时间过久已发生了变化。