细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
细胞因子的检测法
细胞因子的检测法细胞因子是一类在细胞间相互作用并调节免疫和炎症等生物学过程的蛋白质分子。
它们在疾病的发生和发展中发挥着关键的作用。
为了研究这些生物分子，科学家们使用多种方法进行细胞因子的检测。
以下是一些常见的细胞因子检测方法：1. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）：- ELISA是一种广泛用于检测蛋白质的方法。
对于细胞因子，ELISA通常分为直接和间接两种类型。
ELISA的基本原理是通过酶标记的抗体与待测细胞因子结合，然后用底物显色，并通过光密度测定来定量检测目标物质的含量。
2. 多参数流式细胞术：-这是一种同时测量多个生物标志物的方法。
通过将样品与多种荧光标记的抗体混合，然后在流式细胞仪中进行检测，可以在单个细胞水平上评估多个细胞因子的表达水平。
这是一种高通量的方法，适用于复杂的细胞混合物。
3. 生物传感器技术：-生物传感器是一种直接监测生物分子的技术。
对于细胞因子检测，可以使用基于电化学、光学或质谱学的生物传感器。
这些传感器通常具有高灵敏度和选择性，可以用于实时监测。
4. PCR技术：-聚合酶链反应（PCR）可以用于检测细胞因子的mRNA水平。
通过提取RNA并进行反转录，然后使用PCR扩增目标基因的cDNA，可以定量测量细胞因子的mRNA水平。
5. 蛋白质芯片：-蛋白质芯片是一种高通量的技术，可以同时检测多个蛋白质。
对于细胞因子的检测，可以使用蛋白质芯片，其中芯片上包含有多个针对不同细胞因子的抗体点阵。
6. 质谱法：-质谱法可以用于细胞因子的定量分析。
质谱法可以提供非常精准的分子质量信息，对于检测细胞因子的各种变体和修饰具有优势。
选择适当的方法取决于研究的具体需求、实验条件以及实验室的技术和设备水平。
在进行实验前，最好参考相关文献和专业手册，以确保所选方法的可靠性和适用性。
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
细胞因子 化学发光法 流式细胞法
细胞因子化学发光法流式细胞法
细胞因子的免疫学测定方法包括ELISA法、流式细胞仪法和酶联免疫斑点试验法等。
以下是这三种方法的介绍：
- ELISA法：具有特异、简便、易于标准化等优点，可同时检测大量标本。
其缺点是敏感性偏低，不能判断细胞因子的生物学活性。
- 流式细胞仪法：主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或黏附因子的检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。
- 酶联免疫斑点试验法：便于观察和计数分泌细胞因子的细胞，一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关。
在选择细胞因子测定方法时，需要根据实验目的和条件进行选择。
如果需要同时检测大量样本，ELISA法可能更为合适；如果需要精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况，流式细胞仪法可能更为适合。
流式细胞术检测人和小鼠细胞内细胞因子方法的建立
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
细胞因子12项流式
细胞因子12项流式
在细胞因子12项流式中，通常会检测多种细胞因子的表达水平，这些细胞因子包括但不限于干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等。
通过分析这些细胞因子的表达水平，可以更全面地了解免疫系统的
活性和炎症状态。
这种流式细胞术的操作流程通常包括细胞样本的准备、标记不
同抗原的抗体、使用流式细胞仪进行检测和数据分析等步骤。
通过
这些步骤，可以获得关于细胞因子表达的定量和质量信息。
细胞因子12项流式在临床和科研领域都有广泛的应用。
在临床上，它可以帮助医生评估患者的免疫功能状态，辅助诊断炎症性疾
病和免疫性疾病。
在科研领域，它可以用于研究免疫系统在不同疾
病状态下的变化，寻找新的治疗靶点和药物。
总的来说，细胞因子12项流式是一种重要的实验技术，可以帮
助我们深入了解免疫系统的功能和疾病机制，为临床诊断和治疗提
供重要参考。
检测细胞因子的常用方法
检测细胞因子的常用方法以检测细胞因子的常用方法为标题，本文将介绍细胞因子检测的常用方法及其原理和应用。
细胞因子是一类由免疫细胞产生的蛋白质分子，它们在细胞间传递信号，调节免疫反应和炎症反应。
细胞因子的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关，因此准确地检测和定量细胞因子对于研究疾病的机理、诊断疾病和评估治疗效果至关重要。
常用的细胞因子检测方法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术和多重荧光素酶联免疫分析法（Luminex）等。
ELISA是一种常用的细胞因子检测方法。
它基于酶标记的抗体与待测细胞因子的特异性结合，通过酶的催化作用产生可观测的信号。
ELISA的原理是将待测细胞因子样本加入已经涂有特异性抗体的酶标板孔中，经过洗涤去除未结合物质，然后加入酶标记的二抗与待测细胞因子结合，再次洗涤后加入底物，底物与酶发生反应生成可观测的产物。
通过测量产物的颜色或荧光信号强度，可以定量检测细胞因子的含量。
流式细胞术也是一种常用的细胞因子检测方法。
它基于细胞因子与荧光标记的抗体的结合，通过流式细胞仪检测细胞因子的表达水平。
流式细胞术的原理是将待测细胞因子标记上荧光物质的抗体与细胞混合，使其结合到目标细胞表面的细胞因子上。
然后，通过流式细胞仪将荧光标记的细胞分析出来，并计算细胞因子的表达水平。
Luminex是一种高通量的细胞因子检测方法，它可以同时检测多个细胞因子。
Luminex的原理是将待测细胞因子样本加入含有多个不同荧光标记的微球的混合物中，每个荧光标记对应一个特定的细胞因子。
待测细胞因子与荧光标记的微球结合后，通过流式细胞仪检测微球上的荧光信号来定量细胞因子的含量。
Luminex具有高灵敏度、高通量和多重检测的优势，被广泛应用于细胞因子的研究和临床诊断。
细胞因子检测方法的选择应根据实验需求和样本特点来确定。
ELISA 适用于单个细胞因子的检测，操作简单，结果稳定可靠；流式细胞术适用于分析单个细胞的细胞因子表达水平，可以获得细胞因子的表达图谱；Luminex适用于同时检测多个细胞因子，具有高效、快速和经济的特点。
流式检测细胞因子实验步骤
流式检测细胞因子实验步骤嘿，咱今儿个就来讲讲流式检测细胞因子实验步骤哈！这可是个挺有意思的事儿呢。
首先呢，你得把要检测的细胞给准备好呀。
这就好比要做饭得先有食材一样，细胞就是咱这实验的“主角”呢。
得让它们乖乖地待在那儿，等着咱来摆弄。
然后呢，就是给细胞加上各种试剂啦。
这就像给菜加调料一样，得恰到好处，不然味道可就不对啦。
不同的试剂有不同的作用，可不能加错咯。
接着，就是让细胞和试剂好好地反应反应。
这时候可不能着急，得给它们足够的时间，就像炖肉得小火慢炖才能入味儿一样。
之后呢，把处理好的细胞放到流式细胞仪里去。
嘿，这流式细胞仪就像是个神奇的“眼睛”，能看出细胞的各种小秘密呢。
在这过程中，可得仔细操作呀，就像走钢丝一样，得小心翼翼的。
一个不小心，可能数据就不准确啦。
等仪器检测完了，就到了分析数据的时候啦。
这可需要你有一双“火眼金睛”，能从那些密密麻麻的数据里看出门道来。
你想想看，这细胞因子就像是细胞之间的“悄悄话”，咱通过这个实验就是要去偷听它们在说啥呢。
这多有趣呀！做这个实验，就像是搭积木一样，一步一步都得稳稳当当的。
要是有一步没弄好，那可能整个“大楼”就塌啦。
所以呀，做流式检测细胞因子实验可不能马虎，得认真对待每一个步骤。
只有这样，才能得到准确可靠的结果呢。
这可不是闹着玩的哟！咱得为科学负责，为自己的实验负责呀！你说是不是这个理儿呢？反正我觉得是这么回事儿！好啦，就说到这儿吧，希望你做实验的时候顺顺利利的哟！。
流式胞内细胞因子检测
流式胞内细胞因子检测流式胞内细胞因子检测是一种用于研究细胞因子在单个细胞水平上的表达和分泌的技术。
细胞因子是一类产生于免疫细胞和其他细胞类型中的小分子蛋白质，对于细胞的发育、增殖、分化和功能调节具有重要作用。
流式胞内细胞因子检测可以帮助科研人员了解细胞因子的表达模式、功能和调控机制，从而深入研究细胞免疫学、炎症反应、感染和免疫相关疾病等领域。
流式胞内细胞因子检测的原理是利用单克隆抗体与特定细胞因子结合，然后使用荧光标记的二抗检测这种结合。
首先，需要选取合适的抗体对细胞因子进行检测。
抗体通常选择单克隆抗体，因为其高度特异性和亲和性。
对于胞内细胞因子的检测，首先需要破坏细胞膜，使细胞内的细胞因子释放到胞外液中。
一般来说，可以通过细胞固定和渗透化处理来实现这一步骤。
接着，使用标记有荧光染料的二抗与细胞因子结合，产生荧光信号。
最后，使用流式细胞仪对细胞进行分析，并得到细胞因子的表达和分泌水平。
流式胞内细胞因子检测的优势之一是可以在单个细胞水平上进行分析。
通过研究单个细胞的细胞因子表达水平，可以得到更准确、具体的结果，避免了整体细胞群体的平均值的混淆。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以同时分析多种不同细胞因子的表达和分泌水平，可以全面了解细胞因子的调控网络。
另外，流式胞内细胞因子检测还具有高灵敏度和高速度的特点，可以快速得到结果，并且对于微量样品的检测也有很好的表现。
流式胞内细胞因子检测在多个研究领域发挥了重要作用。
在免疫学领域，可以通过检测不同类型免疫细胞中细胞因子的表达水平，了解它们在免疫应答中的作用和调控机制。
在炎症反应研究中，可以检测炎症细胞中细胞因子的表达水平，从而了解炎症反应的机制，并寻找调控炎症的目标。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以应用于感染和免疫相关疾病的研究，帮助科研人员了解疾病的发病机制和炎症信号通路。
然而，流式胞内细胞因子检测也存在一些局限性和挑战。
首先，流式胞内细胞因子检测需要选择合适的抗体对特定细胞因子进行检测。
细胞因子流式
细胞因子流式
细胞因子流式是一种检测细胞因子表达水平、类型、数量和功能的
高通量技术。
它是基于细胞分析仪原理的一种技术，可以将多种细胞
因子同时分析，从而获得更为全面和准确的信息。
细胞因子是一类介导细胞间信号传递的小分子蛋白质。
它们在机体免疫、炎症、发育和修复过程中发挥重要的生物学功能。
目前已知的细
胞因子有多种，包括促炎症因子、细胞生长因子、趋化因子等。
细胞因子流式技术主要通过使用荧光标记的单克隆抗体识别和检测不
同种类的细胞因子。
利用流式细胞仪的精细检测能力，可以实现同时
检测多种不同种类的细胞因子。
细胞因子流式技术的优点在于快速、高通量、准确、方便。
它可以用
于研究免疫细胞在病毒感染、恶性肿瘤、炎症和自身免疫性疾病等多
种疾病中的免疫调节机制。
同时，它还可以帮助研究人员快速发现新
的免疫调节标记并开发新的治疗方法。
除此之外，细胞因子流式技术还可应用于药物筛选、免疫细胞疗法、
临床诊断等多个领域。
它在新药开发、免疫治疗和疾病诊断中的应用
前景非常广阔。
总的来说，细胞因子流式技术在生命科学领域中具有重要的应用价值。
它的应用不仅可以促进我们对于细胞因子在生物学过程中的作用机制
的深入理解，而且可以在实际应用中为疾病的防治和药物开发做出重要的贡献。
细胞内因子的流式检测(共10张PPT)
注意事项
➢ 使用适当细胞表面阻断试剂，减少非特异性的背景染色，保证结果的准
确性
①Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯 化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
荧光素的选择以：保检测证相最对低佳表达的细检胞因测子效如IL果-4时。，比应选如用，PE或要AP检C标测记I；FN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；
黑色代表的是未使用破膜剂的染色结果；
比如，要检测如IF果N-γ用则可CD选4择做PM表A和面Iono标my记cin同，时刺由激于； 多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度
荧光素的选择质：检网测内相对，低以表达利细胞于因准子如确IL检-4时测，应细选胞用P产E或生AP细C标胞记因； 子的能力。
Monensin 一般使用含1％皂甙、0.
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。
Brefeldin-A(BFA) 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMC
②表面结合的细胞因子的阻断：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，阻断细
胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合引起的背景。
➢ 荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；
单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
细胞内细胞因子染色是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。
流式检测细胞因子原理
流式检测细胞因子原理嘿，朋友们！今天咱来唠唠流式检测细胞因子原理这档子事儿。
你说细胞因子啊，那可真是细胞世界里的小精灵，它们在身体里跑来跑去，传递着各种重要的信号呢！那流式检测就像是个超级侦探，专门来捕捉这些小精灵的踪迹。
想象一下，细胞因子就像是一群调皮的小孩子，在细胞的大游乐场里玩耍。
而流式检测呢，就好比一个厉害的管理员，能准确地把每个孩子都分辨出来，还能知道它们在干啥。
流式检测的原理其实挺有意思的。
它就像是一场精准的筛选比赛。
首先呢，有特殊的抗体，就像一个个小标签，能准确地贴在特定的细胞因子上。
这些抗体带着荧光标记，一闪一闪的，可显眼啦！然后呢，把细胞混悬液放进流式细胞仪这个大机器里，就像把孩子们放进一个特别的通道。
细胞们一个一个地通过，那些被抗体标记的细胞因子就会发出独特的荧光信号。
这就好比孩子们身上的标签在闪闪发光。
这时候，流式细胞仪这个厉害的家伙就能把这些荧光信号都捕捉到，然后分析出来，告诉你都有哪些细胞因子，有多少量。
这可太神奇了，不是吗？就好像你一下子能知道游乐场里每个孩子的具体情况一样。
流式检测细胞因子的好处可多了去了。
它能快速地告诉我们身体里的免疫状态啊，炎症反应啊等等。
医生们就像是有了一双火眼金睛，能根据检测结果更准确地诊断疾病，制定治疗方案呢！这难道不厉害吗？而且啊，流式检测还很灵敏呢！哪怕只有一点点细胞因子，它也能揪出来。
这就像一个超级敏锐的小侦探，任何蛛丝马迹都逃不过它的法眼。
咱再想想，如果没有流式检测，那医生们得多头疼啊！就像在黑暗中摸索一样，不知道身体里到底发生了啥。
但有了它，一切都变得清晰明了啦！总之啊，流式检测细胞因子原理就像是一场奇妙的科学之旅。
它让我们能更深入地了解身体这个神秘的世界，为我们的健康保驾护航。
它可真是个了不起的技术，不是吗？大家一定要好好了解了解它呀！。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能知足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用愈来愈显的重要非常。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手腕包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方式观看细胞因子蛋白表达及mRNA表达能够识别Th1和Th2细胞，此方式可取得较强的细胞内信号，但此方式工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有专门大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行普遍推行。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的显现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的时期。
下面要紧对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
初期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆">克隆证明了不同细胞因子的合成，如T）与H1（IL－2，IFN－TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆">克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭露。
近来，Jung与Picker采纳了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin （BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方式使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激进程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方式可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方式证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
流式胞内细胞因子检测
流式胞内细胞因子检测I.导言单细胞胞内细胞因子分析方法在持续不断改进中，分析技术包括ELISPOT，原位杂交(in situ hybridization)，免疫组织化学(immunohistochemistry)，有限稀释分析和单细胞PCR等。
相比较流式细胞术是一种强大的分析技术，可以同时分析单个细胞的多个参数，包括大小和粒度，以及由荧光抗体表征的表面和细胞内标记物的表达。
胞内细胞因子和趋化因子对应的荧光标记单克隆抗体应用已经非常成熟，也适用于混合细胞群内胞内染色和多色分析。
表面和胞内相结合的多色免疫荧光染色提供了一种高分辨率方法，用于鉴定表达特定细胞因子的细胞的性质和频率。
已经有非常多的应用案例如细胞因子表达受限制的（如，Th4与Th2样）或不受限制的（如，Th0）各种细胞类型的分析。
除了能够同时对单个细胞进行高特异性和高灵敏的多个参数同时测量外，该方法还能够快速收集大量细胞信息，进行统计学意义上的分析。
胞内细胞因子的染色取决于细胞因子特异性单克隆抗体的鉴定，及其与固定-透化过程的相容性。
已经报道了使用多聚甲醛固定和用去污剂皂苷对细胞膜透化的组合的最佳细胞内细胞因子染色。
多聚甲醛固定允许保持细胞形态和细胞内抗原性，同时还使细胞能够承受去污剂的透化作用。
皂苷的膜透化使细胞因子特异性单克隆抗体穿透内质网和高尔基体的细胞膜，胞质溶胶和膜。
细胞因子染色的关键参数包括：细胞类型和激活方案-活化后细胞收获的时间-细胞活化过程中包含蛋白质转运抑制剂-和抗细胞因子抗体的选择等。
II.一般方法A.刺激细胞已经报道了各种用于刺激细胞产生细胞因子的体外方法。
多克隆活化剂包括有：佛波酯和钙离子载体；植物血凝素;葡萄球菌肠毒素B；和针对TCR/CD3复合物亚基的单克隆抗体（有或没有针对共刺激受体如CD28的抗体）。
注意：据报道，单独使用PMA进行细胞活化会导致小鼠T细胞表面CD4表达的瞬时丧失；用PMA和钙离子载体一起活化细胞会引起CD4表达的更大和更持久的降低，以及小鼠胸腺细胞、小鼠和人外周T淋巴细胞中CD8表达的降低。
血液流式细胞术检测细胞因子方法
血液流式细胞术检测细胞因子方法
血液流式细胞术是一种用于分析和鉴定血液中不同类型细胞的高效技术。
在医学领域，它被广泛应用于研究和临床诊断中。
近年来，血液流式细胞术也被用于检测和分析细胞因子，这对于研究免疫反应、炎症和其他疾病过程具有重要意义。
细胞因子是一类分泌性蛋白质，它们在细胞间传递信号，调节免疫反应、细胞增殖和分化等生物学过程。
通过血液流式细胞术检测细胞因子，可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞因子在疾病发生发展中的作用，为疾病的诊断和治疗提供重要信息。
血液流式细胞术检测细胞因子的方法主要包括以下几个步骤，首先，通过特定的抗体对血液样本中的细胞进行标记，这些抗体可以与目标细胞因子结合。
然后，利用流式细胞仪对标记的细胞进行检测和分析，流式细胞仪可以测量细胞的大小、形状、表面标记物和内部成分，从而确定细胞中细胞因子的含量和分布。
最后，利用专业的数据分析软件对流式细胞仪获取的数据进行处理和解读，得出细胞因子的定量和定性结果。
血液流式细胞术检测细胞因子方法具有高灵敏度、高通量和多
参数分析的优势，能够同时检测多种细胞因子，为疾病的研究和诊断提供全面的信息。
随着技术的不断发展和完善，血液流式细胞术检测细胞因子的应用范围将会更加广泛，为医学研究和临床诊断带来新的突破和进展。
细胞因子流式
细胞因子流式
细胞因子是一类由免疫细胞或其他细胞分泌的蛋白质或肽类物质，它们可以在体内通过自分泌或相互作用的方式来调节生物体免疫系统和炎症反应的功能。
流式细胞仪和细胞因子分析技术已经成为现代免疫学和癌症研究中必不可少的实验手段。
以下是细胞因子流式分析相关的参考内容：
1. 细胞因子流式分析技术
流式细胞仪在细胞因子分析中的应用越来越广泛。
通过标记各种细胞因子特异性荧光抗体，可以用流式细胞仪分析不同细胞中的细胞因子产生和释放情况。
2. 常见的细胞因子
常见的细胞因子包括：肿瘤坏死因子（TNF）、白介素（IL）
家族、干扰素（IFN）、肿瘤生长因子（TGF）、趋化因子、
生长因子等。
3. 细胞因子水平的变化
某些疾病和炎症状态会导致细胞因子的水平升高或降低。
例如，在许多癌症患者中，IL-6水平会升高，而在某些炎症疾病中，IL-10水平会降低。
4. 流式细胞仪在分析细胞因子水平的优点
流式细胞仪在细胞因子分析中的优势包括快速、精确、可靠、高通量、多参数同时检测等。
5. 细胞因子在癌症免疫治疗中的作用
很多癌症病人免疫系统受损，细胞因子在提高免疫功能和炎症反应方面起到了关键作用。
在免疫治疗中，细胞因子可以用来激活T细胞，增强肿瘤免疫杀伤力。
6. 细胞因子检测在预测疾病进程中的应用
细胞因子水平的变化可以作为一种预测疾病进程和治疗效果的监测手段。
通过定期检测不同时间点的细胞因子水平，可以有效评估疾病的进展和治疗效果。
流式细胞仪和细胞内细胞因子染色
流式细胞仪和细胞内细胞因子染色
无红细胞的单细胞悬浮液制备的脾细胞，刀豆蛋白A爆炸或PBL在FACS缓冲液（PBS中，用1％牛血清白蛋白和0.05％NaN的3）和细胞进行染色，在黑暗中在冰上20分钟，进行表面的表达CD8α（APC-CY7），CD4（PerCP CY5.5），CD3ε（FITC），CD137（FITC），CD19（PerCP-Cy5.5标记），或NK1.1（PE-CY7所有的抗体，BD生物科学，圣地亚哥，CA）。
细胞内染色，细胞透性使用的Cytofix / Cytoperm
因子使用肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-α或IFN-γ（PR-700，BD生物科学）。
四聚体分析，进行温育的细胞悬浮液与H2-K b / TRP-2的180-188四聚体（SVYDFFVWL，APC-标记，Sanquin，）或H2-K b / OVA 257-264四聚体，实物礼品CM 25分钟，在37°C和5％CO 2之前，随后的表面抗体染色。
表面MHC-I类检测是由孵化IFN-γ引物和未曝光B16.F10细胞与小鼠抗鼠MHC I类抗体，圣迭戈，随后孵育检测的山羊抗小鼠IgG2a抗体，测量样品在FACS广东II流式细胞仪（Beckton Dickinson公司，圣迭戈，CA）。
使用FlowJo软件的数据进行了分析。
细胞内细胞因子的流式检测讲解
刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN-γ 则可选择 PMA 和Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的
CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，
4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照 ：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的
免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
① Fc 受体阻断 ： 使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在
小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
② 表面结合的细胞因子的阻断 ：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，
阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
荧光素的选择： 检测相对低表达细胞因子如 IL-4时，应选用PE或APC
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。 一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
检测细胞因子的方法
检测细胞因子的方法
检测细胞因子的方法有很多种。
下面是一些常用的方法：
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种常用的检测细胞因子的方法。
它通过将特异性抗体固定在试验板上，然后将待测样品加入到板上，利用特异抗体与待测细胞因子结合，再加入特异性检测抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，最后添加底物，测定光密度来确定细胞因子的浓度。
2. 流式细胞仪：流式细胞仪可以用来检测细胞因子在单个细胞水平上的表达情况。
它通过标记特定的细胞因子抗体或标记分子，在细胞水槽中运行待测细胞悬液，然后通过激光束照射细胞，测量细胞因子的荧光强度来确定其表达水平。
3. 实时荧光定量PCR（qPCR）：qPCR可以用来测定细胞因子的mRNA水平。
它通过与待测细胞因子的mRNA序列特异性杂交，然后使用荧光探针或染料来检测PCR扩增产物的累积量，进而确定细胞因子的mRNA水平。
4. 蛋白质芯片：蛋白质芯片是一种高通量检测细胞因子的方法。
通过将已知细胞因子的抗体固定在芯片上的不同点位上，然后将待测细胞因子加入到芯片上进行反应，最后使用荧光标记的二抗来检测反应产物，从而确定细胞因子的浓度。
5. 化学发光：化学发光法可以用于检测细胞因子的浓度。
它通过在反应体系中加入底物，在酶催化下发生发光反应，发光强度与细胞因子的浓度成正比。
需要根据实验要求和资源条件选择合适的方法进行细胞因子的检测。
细胞内因子流式细胞术实验流程
细胞内因子流式细胞术实验流程细胞内因子流式细胞术实验可真是个有趣又有点小复杂的实验呢。
一、实验前的准备。
咱们得先把要用的试剂和仪器都准备好。
试剂方面，像固定液、破膜液这些那是必不可少的。
还有特异性的荧光标记抗体，这就像是给细胞内因子准备的小标签，能让咱们在流式细胞仪里轻松找到它们。
仪器的话，流式细胞仪得提前调试好，确保它状态良好，就像给一个即将上场比赛的运动员做个全身检查一样。
还有那些小的实验器材，比如离心管、移液枪头之类的，也都要准备充足。
要是在实验做到一半发现移液枪头不够了，那可就像做饭做到一半发现盐没了一样让人着急呢。
二、细胞的采集和处理。
接下来就是细胞啦。
如果是从组织里分离细胞，那可得小心又小心。
就像从一个宝藏里小心翼翼地取出宝石一样。
细胞取出来之后，要先把它们洗干净，把那些杂质都去掉，让细胞们清清爽爽的。
然后计数，知道咱们到底有多少个细胞在参与这个实验。
要是细胞数量太多或者太少，都可能影响实验结果哦。
这就像参加聚会，人太多太挤或者人太少没气氛都不好。
然后把细胞固定起来，这一步就像是给细胞拍个快照，让它们保持当时的状态。
固定之后再破膜，这就像是打开细胞的小房子，好让抗体能够进去找到细胞内的因子。
不过这个破膜的过程可不能太暴力，不然细胞就像被大风吹坏的小帐篷一样，结构被破坏了，那实验也就没法好好进行了。
三、抗体标记。
现在轮到抗体上场啦。
把咱们准备好的荧光标记抗体加到细胞里，这个时候就像是给细胞内因子穿上漂亮的荧光衣服一样。
不过加抗体的时候要注意量，太多了可能会有非特异性结合，就像给一个人穿太多衣服，都分不清哪个是原本该穿的了。
太少呢，又可能标记不上，就像衣服太小穿不上一样。
加完抗体之后，要给它们足够的时间去结合，就像两个人见面之后要聊聊天、熟悉熟悉，这个过程可不能着急。
四、流式细胞仪检测。
最后就是把标记好的细胞放到流式细胞仪里检测啦。
这个时候就像是把一群打扮好的小演员送到舞台上一样。
流式细胞仪会根据细胞发出的荧光信号来判断细胞内因子的情况。
十二项细胞因子检测（流式法）的临床意义与检验须知
十二项细胞因子检测（流式法）的临床意义与检验须知为提高我院疾病诊断技术水平，从即日起，检验科利用流式高通量检测技术开展十二项免疫功能相关细胞因子联合检测项目。
本项目将为感染、肿瘤、自身免疫病、妇产科和生殖医学科相关疾病等多种临床疾病的诊治提供重要依据，为前来医院就诊的临床患者提供更为优质全面的检验服务。
细胞因子是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）及某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，参与机体免疫反应和炎症反应，包括白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等。
不同患者在感染过程中反应不同，如感染流感后，机体免疫反应过强，促炎性细胞因子过度释放，引起严重免疫病理损伤称之为“细胞因子风暴”。
“细胞因子风暴”的目标是清除病毒，但也可能导致患者自身的机体损伤。
在流感发展成重症前，采取临床干预至关重要，因此需监测细胞因子，及早识别并监测过度炎症反应，能够为临床的诊疗提供有力帮助。
细胞因子监测范围主要包括感染、肿瘤、自身免疫性疾病、手足口病、胰腺炎或不明原因发热患者；抗生素、免疫调节剂、激素用药前、用药后；手术后；ICU患者等。
一、适用科室：肿瘤科、ICU、呼吸科、感染科、风湿免疫科、血液科、器官移植科、放化疗科、外科、皮肤科、肾内科、眼科、妇科等科室均可以开展，其结果可以为疾病的辅助诊断、指导用药、监测疗效及预后提供参考。
细胞因子12项包括：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ、IFN-α。
方法学：流式免疫荧光法二、收费标准：513元∕人（甲类医保）三、医嘱：医生工作站直接搜索“细胞因子12项”四、抽血要求及报告时限：1-2ml EDTA抗凝血浆（紫管）×1管，无需空腹，随时送检，当日或次日下午4点发出检验报告。
五、临床意义：细胞因子临床意义IL-1β可促进成纤维细胞增殖和胶原合成，参与纤维化；对胰岛β细胞有毒性，与Ⅰ型糖尿病有关；可刺激神经胶质细胞增生，形成瘢痕，与癫痫发病有关；有抗肿瘤作用，能协同IL-2、IFN-γ诱导CTL和NK细胞的杀伤活；与自身免疫病和抑制排斥有关。
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细胞内细胞因子的流式细胞仪检测点击次数：621 作者：佚名发表于：2008-07-24 15:51转载请注明来自丁香园来源：51protocol一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆">）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆" 克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。
胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。
具有其它方法难以比拟的优点：快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。
二、所需仪器1、流式上样管及细胞培养皿或板2、25%CO2，37℃孵箱3、混匀振荡器4、离心机5、加样器、Tips6、流式细胞仪三、常用的标本类型和处理方法全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。
如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
自身血浆中外周血单个核细胞（PBMCs）：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。
组织培养基中的外周血单个核细胞（PBMCs）：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。
调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。
溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
四、所需试剂1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂依据实验需要选择特殊表面标志CD45圈定所有淋巴细胞CD3 圈定T淋巴细胞CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群CD19/或CD20圈定B淋巴细胞CD56圈定NK淋巴细胞CD14圈定单核细胞2、荧光标记的细胞因子抗体R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体3、溶血素用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscienc e目录号00-4333）溶解红细胞4、激活剂①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）DMSO中调节浓度0.1mg/mLL），－20℃储存。
勿反复冻融 分装（20每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液②Ionomycin （Alexis，目录号ALX-450-006-M001）于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL－20℃储存每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液g/mL细胞悬液μ③Ionomycin终浓度1Staphylococcal enterotoxin B（SEB）（Sigma，Catalog No.S-4881）无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL4℃储存g/mL细胞悬液μSEB终浓度10④CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞⑤CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml5、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内①Brefeldin-A（BFA）（eBioscience，目录号00-4506）于DMSO中调节浓度5mg/mL分装（20L），-20℃储存。
勿反复冻融。
每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液g/mL细胞悬液。
激活最后4－5小时BFA终浓度10注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降②Monensin （eBioscience，目录号00-4505）6、不含谷氨酰胺的RPMI-16407、固定剂细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。
含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）8、破膜剂含1%皂甙、0.05%叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合9、其它试剂无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。
五、细胞培养和刺激的基本方法细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。
下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法人Fractalkine/CX3CL1 方法1人IL-8/CXCL8 方法3 (24 小时)人MCP-1/CCL2 方法3 (24 小时)人MIP-1a/CCL3 方法3 (24 小时)人MIP-1b/CCL4 方法3 (24 小时)人RANTES/CCL5 方法1小鼠IL-2 方法9小鼠IL-4 方法10小鼠IL-5 方法10小鼠IL-6 方法11小鼠γIFN 方法9 or 方法12小鼠αTNF- 方法9为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂（如3uM monensin，10mg/ml的BFA）方法1：只使用转染细胞检测方法2：人的PBMCs使用PMA （10 ng/ml）和Ionomycin （1 uM）刺激4-24 小时.方法3：人的PBMC 使用LPS （0.5 - 1 ug/ml）刺激24 小时.方法4：人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL -2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA（10 ng/ml）和Ion omycin （1 uM）刺激6小时20mL于Falcon管中，加入100mL激活后的全血（细胞浓度维持在2×106 /mL）混匀，室温暗处孵育15分钟；方法5：CD4 T 细胞使用PHA （10 ng/ml）刺激4 days方法6：T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b （Lorre, et al., 1994，Clin Immuno Immunopath 70:1）方法7：使用PMA （50 ng/ml）和Ionomycin （500 ng/ml）刺激（10 ng/ml，目录号285-IF-100）刺激2 小时，然后使用IFN（10 ng/ml）LPS（1 方法8：PBMCs细胞使用重组人IFN ug/ml）刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.方法9：EL4 在包被抗小鼠CD3抗体（25 ug/ml）的培养板中，使用抗CD28抗体（2 ug/ml）PMA（5ng/ml）Ionomycin（500 ng/ml）刺激6小时方法10：CD4＋T细胞在包被小鼠CD3（25ug/ ml）抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28（2 ug/ml）的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML -005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA（5 ng/ml）、Ionomycin（500 ng/ml）和monensin刺激6小时。
方法11：小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时方法12：小鼠脾细胞使用PMA（5 ng/ml）和Ionomycin（500 ng/ml）刺激6小时六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）1、收获细胞肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书），混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时2、阻断Fc受体用于消除非特异性的结合染色①在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。