实验 水中细菌总数的测定 水中大肠杆菌的测定

实验2 水中大肠菌群数的测定

一、目的要求

1．了解大肠菌群数量在引用水中的重要性

2．学习掌握多管发酵法和滤膜法测定大肠菌群数

二、原理

若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。最广泛应用的指示菌是大肠菌群，它的定义是：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37ºC、24～48h培养能产酸产气，根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。我国规定每升自来水中大肠菌群不得检出；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10000个。

检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。

三、实验仪器和材料

1．锥形瓶（500 ml）、试管（18 mm×180 mm）、大试管（容积150 ml）、移液管1 ml 及10ml、培养皿（直径90 mm）、接种环、试管架1个。

2．革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液

3．显微镜

4．自来水（或受粪便污染的河、湖水）400ml

5．蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液、5％碱性品红乙醇溶液、2％伊红水溶液、0.5％美蓝水溶液。

6．10％NaOH、10％HCl、精密pH试纸6.4～8.4。

四、实验前准备工作

（一）配培养基

1．乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵法的复发酵用）

配方：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1 ml、蒸馏水1 000ml、pH＝7.2～7.4。

制备：按配方分别称取蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1 000 ml蒸馏水，调整pH为7.2～7.4。加入1．6％溴甲酚紫乙醇溶液1 ml，充分混匀后分装于试管内，每管10 ml，另取一小倒管装满培养基倒放入试管内。塞好棉塞、包扎。置于高压灭菌锅内以0.7kg/cm2（115℃）灭菌20min，取出置于阴冷处备用。

2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（供多管法初发酵用）

按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于试管中，每管5ml。再分装大试管，每管装50ml，然后在每管内倒放装满培养基的小导管、塞棉塞、包扎，置高压灭菌锅内以0.7kg/cm2（115℃）灭菌20min，取出置于阴冷处备用。

3．品红亚硫酸钠培养基（即远滕氏培养基），供多管发酵法的平板划线用

配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂20～30g、蒸馏水1000ml、无水亚硫酸钠5g左右、5％碱性品红乙醇溶液。

制备：先将琼脂加入900ml蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，加蒸馏水补足至l 000 ml，调整pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再

加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶内，置高压灭菌锅内以0.7 kg/cm2灭菌20min，取出置于阴冷处备用。

现市场上有售配制好的乳糖发酵培养基，使用方便。

4．伊红美蓝培养基

配方：蛋白胨10g、乳糖10 g、磷酸氢二钾2 g、琼脂20～30 g、蒸溜水1000ml、2％伊红水溶液10 m1、0.5％美蓝水溶液13 ml

制备：按品红亚硫酸钠的制备过程制备。

现市场上有售配制好的伊红美蓝培养基，使用方便。

五、实验方法与步骤

（一）大肠菌群的测定

1．多管发酵MPN法（按三个步骤进行）

多管发酵法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度高的水中的大肠菌群测定。

（1）生活饮用水的测定步骤

①初步发酵试验在2支各装有50 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大发酵管中，以无菌操作各加入100ml水样。在10支各装有5 ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，以无菌操作各加入10ml水样．混匀后冒于37ºC恒温箱中培养24h，观察其产酸产气的情况。

情况分析：

a．若培养基红色不变为黄色，小导管没有气体，即不产酸不产气，为阴性反应，表明无大肠菌群存在。

b．若培养基由红色变为黄色，小导管有气体产生，即产酸又产气，为阳性反应，说明有大肠菌群存在。

c．培养基由红色变为黄色说明产酸，但不产气，仍为阳性反应，表明有大肠菌群存在。结果为阳性者，说明水可能被粪便污染，需进一步检验。

d．若小倒管有气体，培养基红色不变，也不浑浊，是操作技术上有问题，应重作检验。

②确定性试验用平板划线分离，将经培养24 h后产酸（培养基呈黄色）、产气或只产酸不产气的发酵管取出，以无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于品红亚硫酸钠培养基（或伊红美蓝培养基）平板上划线分离，共三个平板。置于37℃恒温箱内培养18～24 h，观察菌落特征。如果平板上长有如下特征的菌落并经涂片和进行革兰氏染色，结果为革兰氏阴性的无芽孢杆菌，则表明有大肠菌群存在。

在品红亚硫酸钠培养基平板上的菌落特征：

a．紫红色，具有金属光泽的菌落；

b．深红色，不带或略带金属光泽的菌落；

c．淡红色，中心色较深的菌落。

在伊红、美蓝培养基平板上的菌落特征：

a．深紫黑色，具有金属光泽的菌落；

b．紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；

c. 淡紫红色，中心色较深的菌落。

③复发酵试验以无菌操作，用接种环在具有上述菌落特征、革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌的菌落上挑取一环于装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基的发酵管内，每管可接种同一平板上（即同一初发酵管）的1～3个典型菌落的细菌。盖上棉塞置于37ºC恒温箱内培养24h，有产酸、产气者证实有大肠菌群存在。

根据证实有大肠菌群存在的阳性菌（瓶）数查表。报告每升水样中大肠菌群数。

（2）水源水中大肠菌群的测定步骤（一）

①稀释水样根据水源水的清洁程度确定水样的稀释倍数，除严重污染外，一般稀释倍数为10-1及10-2，稀释方法如实验七中所述的10倍稀释法（均需无菌操作）。