免疫荧光检测
免疫荧光检测技术的应用研究
免疫荧光检测技术的应用研究免疫荧光检测技术（immunofluorescence assay，IFA）是生物学研究中常用的一种方法。
利用荧光探针标记抗体或抗原，用荧光显微镜观察标记物的分布和定位，从而确定分子在细胞或组织中的位置和数量。
IFA因其灵敏度高、特异性好等优势，被广泛应用于病毒、细菌、细胞结构等方面的研究。
本文将从四个方面介绍IFA的应用研究，分别是免疫荧光染色、细胞和组织成像、固相免疫荧光检测、IFA的发展趋势。
一、免疫荧光染色免疫荧光染色是IFA最常见的应用之一。
它可以用于检测细胞和组织中的抗原分布、定量抗原表达水平、细胞增殖和病理损伤等。
例如，病毒颗粒在感染过程中，会表达一些病毒特异性蛋白，免疫荧光染色可以用于检测这些蛋白在细胞中表达的位置和数量。
此外，免疫荧光染色还可以用于人类肿瘤标志物的检测，如果往人类肿瘤细胞中注入抗体标记可以推断肿瘤合成的蛋白，从而得出诊断结果。
二、细胞和组织成像IFA除了可以用于固定的细胞和组织外，它还可以用于定位和追踪特定分子和细胞的位置。
相对于常规显微镜，荧光显微镜的分辨率更高，可以显示像分子水平的高分辨率成像。
除此之外，化学标记的方式可以用取得的荧光颜色和荧光强度的区别来区分不同的分子。
这与发生在细胞内的许多生物过程有关，如细胞增殖、聚集和分化等。
三、固相免疫荧光检测固相免疫荧光检测包括拓扑免疫荧光检测和固相酶联免疫荧光检测。
拓扑免疫荧光检测主要是针对细胞膜上的抗原定向开发的一种方法，可以在体外检测膜蛋白的反映。
与此不同，固相酶联免疫荧光检测的应用范围更广，可以检测寄生虫、细菌、病毒等微生物向某单一特异性抗原结构分子特别的抗体。
固相免疫荧光检测具有高灵敏度、高特异性、简便快速等优点，是常用于临床诊断和疫苗检测的关键技术之一。
四、IFA的发展趋势随着生物学研究和临床诊断的需要，IFA技术正在不断地发展。
例如，近年来免疫荧光技术应用于动态跟踪细胞生理活动和长时间成像。
免疫荧光检测的基本原理与技术
免疫荧光检测的基本原理与技术免疫荧光检测是一种常用于生物医学研究和临床诊断的技术手段，它通过标记抗体或抗原的荧光探针来实现对特定生物分子的高度敏感和选择性检测，具有很高的灵敏度和分辨率。
本文将介绍免疫荧光检测的基本原理与技术。
一、基本原理免疫荧光检测是基于免疫学理论的，其中最重要的原理是抗体与抗原的特异性结合。
抗原是指能够诱导机体免疫反应并与抗体特异性结合的分子，抗体则是由生物体对抗原刺激产生的特异性蛋白质。
在免疫荧光检测中，首先需要标记荧光物质的抗体或抗原，一般常用荧光染料如荧光素和荧光素同功酶等。
这些荧光染料可以通过共价偶联或非共价结合的方式与抗体或抗原结合，形成荧光标记的抗体或抗原。
当标记好的抗体或抗原与待检测的样品中的目标生物分子结合时，通过荧光显微镜观察，荧光信号可以被捕捉和记录下来。
荧光信号的强弱与待测物质的浓度有关，可以通过定量分析来获得样品中目标生物分子的含量。
因此，免疫荧光检测可以实现对各种生物分子的定性和定量分析。
二、技术步骤免疫荧光检测通常需要进行一系列的步骤，包括试样制备、标记物制备、免疫反应、荧光显微镜观察和结果分析等。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作。
1. 试样制备试样制备是免疫荧光检测的第一步，它决定了后续免疫反应的成功与否。
首先需要从待测样品中提取目标生物分子，并将其纯化和浓缩。
这些样品可以是血液、组织、细胞等。
对于血液样品，可以通过离心和纯化步骤来获取血清或血浆，使样品中的干扰物质最小化。
2. 标记物制备标记物制备是将荧光染料与抗体或抗原结合的步骤。
一般来说，需要事先准备好标记物，如标记荧光素的抗体。
标记荧光染料可以通过化学反应或酶促反应将其与抗体或抗原发生结合。
3. 免疫反应免疫反应是免疫荧光检测的核心步骤，它通过免疫荧光染色来实现对样品中目标生物分子的检测。
在进行免疫反应时，将标记好的抗体或抗原加入到准备好的样品中，允许它们与样品中的目标生物分子结合。
随后，对免疫反应进行洗涤和缓冲处理，以去除未结合的抗体或抗原，并减少背景噪音信号。
免疫荧光原理
免疫荧光原理引言：免疫荧光是一种基于免疫学原理的生物检测技术。
它利用荧光标记的抗原或抗体与待检测的目标分子发生特异性结合，通过荧光显微镜观察荧光信号的强弱，从而实现对目标分子的定量分析和检测。
免疫荧光技术在医学、生物科学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
一、免疫荧光的基本原理免疫荧光原理基于抗原与抗体相互作用的免疫学原理。
当外源抗原进入机体后，机体的免疫系统会产生特异性抗体来对抗抗原。
这种抗原与抗体的结合是高度特异性的，类似于钥匙和锁的关系。
免疫荧光标记涉及到两个主要的成分：抗原和抗体。
抗原通常是欲检测的分子，它可以是病原体、蛋白质、细胞表面分子等。
抗体是由免疫细胞产生的一种特异性蛋白质，它可以识别并结合特定的抗原。
二、免疫荧光标记的方法免疫荧光的标记方法多种多样，其中最常用的是直接标记和间接标记。
直接标记是将荧光染料直接连接到抗体上。
这种方法简单直接，但荧光染料的选择有限，不同荧光染料的光稳定性和荧光强度可能会有差异。
间接标记是通过将荧光标记的二抗与抗原结合，间接地实现对目标分子的检测。
首先，原位结合抗体与抗原，然后用含有荧光标记的第二抗体与第一抗体结合。
这种方法能够显著提高荧光强度和稳定性，并且可以选择不同种类的荧光标记。
三、免疫荧光的应用领域免疫荧光技术在医学、生物学和医学诊断中有广泛的应用。
在医学研究中，免疫荧光技术可以用来研究细胞的结构和功能，特别是细胞分子的表达和定位。
通过标记特定蛋白质或细胞器，科学家可以观察并研究其在不同细胞类型中的分布和功能。
在生物科学研究中，免疫荧光可以用来检测和定量分析蛋白质、酶、激素等分子的表达水平。
这有助于研究生物过程、分子信号传导和细胞功能等方面的重要问题。
在医学诊断中，免疫荧光广泛应用于临床分析和疾病诊断。
例如，免疫荧光可以用于检测和定量分析病原体（如细菌、病毒、真菌等）的存在和活性水平。
它也可以用于检测和定量分析特定抗原或抗体在患者体液中的水平，从而实现对感染、自身免疫疾病和肿瘤等疾病的诊断。
免疫荧光结果解读
免疫荧光是一种常用的检测方法，用于检测和定位蛋白质、抗体和其他生物分子。
在免疫荧光结果解读中，需要了解以下几个方面：
1. 阳性和阴性结果：免疫荧光结果通常分为阳性和阴性两种。
阳性表示样本中存在目标分子，而阴性则表示不存在。
2. 荧光强度：荧光强度是指样本中荧光信号的强度。
荧光强度高表示目标分子数量多，荧光强度低则表示目标分子数量少。
3. 染色模式：染色模式是指样本中荧光信号的分布方式。
常见的染色模式有均匀染色、斑点状染色、线状染色等。
4. 背景噪声：背景噪声是指非特异性结合或其他因素引起的荧光信号。
高背景噪声会影响结果的准确性。
5. 比较分析：免疫荧光结果需要与正常对照组进行比较分析，以确定是否存在异常情况。
免疫荧光法
免疫荧光法免疫荧光法是一种利用免疫分析（免疫学）与荧光技术结合的分析技术，是免疫分析中应用最为广泛的技术之一。
该技术是在荧光技术的基础上，采用特殊抗体作为检测指示物，开启免疫细胞生物学的新型检测技术。
它具有很高的灵敏度、特异性和可重复性，应用范围广泛，是免疫检测中最重要的方法之一。
免疫荧光法是在免疫原理的基础上开发出来的一种以特异性抗体为指示物的高敏感度检测方法，它能够检测膜结构蛋白的定位、蛋白质的表达水平及生物化学变化过程、蛋白质的交互作用、细胞周期变化、细胞表面活性等多种信息。
由于抗体的特异性，免疫荧光法可以迅速准确地检测指定的分子，可以检测微量的分子，灵敏度很高。
免疫荧光法的原理有三：抗原抗体复合物形成；抗原抗体复合物与荧光标记抗体复合；介质中激发荧光反应。
在这三种原理中，抗原抗体复合物形成是核心，此复合物形成后，会在介质中激发荧光反应，从而得到实验结果。
其步骤大致为侦测抗原→复合抗体抗原→复合荧光标记抗体→荧光反应。
免疫荧光法的应用主要有：检测蛋白质的表达水平；检测细胞1:1 1:n相互作用；检测细胞内的活性；还可用于检测细胞的活力、细胞增殖和细胞凋亡以及复杂细胞生理过程。
由于免疫荧光法的特殊性和敏感性，它已成为生物应用研究中不可缺少的高灵敏检测技术，广泛应用于癌症、血液病和免疫系统病等医学研究。
在这种技术的发展过程中，也有一些不足之处。
其一，荧光增强效果及其大小与抗体的结合程度有关，这就要求抗体的特异性要求相对较高；其二，由于抗体的特异性和敏感性受到环境的影响，不同的环境可能会导致不同的检测结果；其三，抗体价格较高，成本高。
因此，免疫荧光法需要进一步改进和优化，以提高其准确性和效率。
比如在抗体的制备过程中，可以采用抗原免疫表达定向突变技术，研制特异性、耐用性和稳定性较好的抗体，从而有效提高免疫荧光法的敏感性和特异性；另外还可以通过研究不同的荧光探针及其结合作用，开发高效的荧光反应技术，以追求荧光增强效果的最佳化；另外还可以采用基因工程等方法，来降低抗体的成本。
免疫荧光检测肺组织步骤
免疫荧光检测肺组织步骤免疫荧光检测的步骤：1. 组织的固定和切片首先，需要对待检测的肺组织进行固定和切片的处理。
固定是为了保持组织的完整性和结构，常用的固定剂包括甲醛、乙醛等。
切片是将固定后的组织切成薄片，常用的工具是刀片或冰冻刀片。
切片后的组织可以用于后续的染色和免疫荧光检测。
2. 抗体的选择在进行免疫荧光检测时，需要选择适当的一抗和二抗。
一抗是特异性的与待检测蛋白结合的抗体，常用的一抗包括多克隆抗体和单克隆抗体。
二抗是标记有荧光染料或酶的抗体，用于检测一抗与待检测蛋白的结合情况。
3. 抗原的修复在进行免疫荧光检测时，组织中的抗原常常会经过固定和切片等处理而失去活性或部分变性，需要进行抗原修复处理。
抗原修复是通过加热（热诱导抗原修复，如在微波炉中加热）或酶解（酶诱导抗原修复，如用蛋白酶处理）等手段，使抗原重新恢复原有的结构和活性，有利于后续的抗体结合和检测。
4. 抗体的染色将选择的一抗和二抗加到抗原修复后的组织切片中，使其与待检测的蛋白结合。
一般情况下，先加入一抗，然后加入二抗，最后用荧光显微镜观察抗体的结合情况。
一抗一般会标记与蛋白结合的位置，而二抗则标记有荧光染料或酶的位置，通过这种方式可以清晰地观察到待检测蛋白的分布情况。
5. 显微观察和图像采集在加入抗体后，需要使用荧光显微镜观察样品，并采集图像。
通过观察样品的荧光染色情况，可以得到待检测蛋白的定位和分布情况。
同时，通过图像采集，可以记录下样品的图片和数据，便于后续的分析和比较。
6. 数据分析和结果解读最后，需要对采集到的数据进行分析和结果解读。
通过对免疫荧光检测得到的图像和数据进行比较和分析，可以了解待检测蛋白在肺组织中的表达和定位情况。
同时，可以通过不同条件下的比较，评估待检测蛋白在不同生理或病理状态下的变化。
最终，得到结论并对结果进行解读。
注意事项：1. 抗原修复的方法和时间需要根据待检测的蛋白和组织类型进行调整，不同类型的抗原可能需要不同的修复条件。
免疫荧光检测技术的原理及应用
免疫荧光检测技术的原理及应用原理介绍免疫荧光检测技术是一种基于免疫反应原理的检测方法。
其原理是通过将待检样品中的目标物与荧光标记的抗体结合，然后通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
免疫荧光检测技术能够高度灵敏地检测目标物，并且具有多样性、高通量性和高特异性的特点。
应用领域免疫荧光检测技术在许多领域中得到了广泛的应用。
1. 生命科学研究在生命科学研究中，免疫荧光检测技术被广泛应用于蛋白质定位、分析和定量。
通过将荧光标记的抗体与目标蛋白结合，可以在细胞或组织中精确定位目标蛋白，进一步研究其功能和作用机制。
此外，免疫荧光检测技术还可以用于检测细胞的分化状态、凋亡过程等。
2. 医学诊断免疫荧光检测技术在医学诊断中扮演着重要角色。
通过利用荧光标记的抗体与病原微生物或异常细胞结合，可以准确检测出有关疾病的相关指标。
例如，在临床诊断中，免疫荧光检测技术可以用于检测乙型肝炎病毒、艾滋病病毒等病原体，以及癌症标志物等。
3. 农业与食品安全监测免疫荧光检测技术在农业和食品安全监测中具有重要应用。
通过将荧光标记的抗体与农作物病原体、有害微生物或食品中的污染物结合，可以快速、高效地检测出潜在的食品安全风险。
这项技术对于保护农业生产和食品安全具有重要意义。
4. 环境监测免疫荧光检测技术可以应用于环境监测，用于检测空气、水、土壤等环境中的有害物质。
通过将荧光标记的抗体与目标分子结合，可以实现对污染物的高灵敏度和高特异性的检测，为环境保护和污染治理提供有力支持。
免疫荧光检测技术的优势免疫荧光检测技术具有以下优势：•高灵敏度：荧光标记的抗体可以非常灵敏地检测到目标物，具有较低的检测限度。
•高特异性：与其他方法相比，免疫荧光检测技术具有较高的特异性，可以准确识别目标物。
•多样性：免疫荧光检测技术可以用于多种类型的目标物检测，包括蛋白质、细胞、病原体等。
•高通量性：免疫荧光检测技术可以通过自动化设备实现高通量的检测，提高工作效率。
免疫检验方法科普
免疫检验方法科普免疫检验是现代医学中常用的一种检验方法，它通过检测体内免疫系统的相关指标来评估人体免疫功能、诊断疾病以及监测治疗效果。
免疫检验方法包括免疫荧光、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、放射免疫法等。
下面将对这些免疫检验方法进行科普介绍。
一、免疫荧光免疫荧光是一种通过荧光显微镜观察标记物与抗体结合情况的检验方法。
该方法可以快速检测感兴趣的抗原或抗体分子在组织或细胞中的分布情况。
免疫荧光广泛应用于临床诊断中，如自身免疫性疾病、感染性疾病以及肿瘤等的诊断。
二、酶联免疫吸附测定法（ELISA）酶联免疫吸附测定法是一种通过酶标记的抗体或抗原与待检测物相互作用后，通过酶的催化作用来检测目标物质的方法。
ELISA方法的优势在于灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，被广泛应用于疾病的早期诊断、治疗效果监测以及科研领域。
三、放射免疫法放射免疫法是利用放射性同位素标记抗原或抗体，通过放射性测量方法来检测和测定抗原抗体反应的一种检验方法。
这种方法具有高灵敏度和高特异性，可以用于测定微量分子的含量，如激素、肿瘤标志物等。
免疫检验方法的基本原理是利用免疫系统的特异性识别和结合抗原抗体的特性。
抗原是免疫系统识别的目标物质，抗体是特异性结合抗原的免疫蛋白分子。
免疫检验方法通过检测抗原抗体结合的情况，来检测待测物质的存在或者浓度。
免疫检验方法的应用非常广泛。
临床上，免疫检验可以用来诊断各种疾病，如感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等。
在生物科学研究中，免疫检验也被广泛应用于生物标志物的检测、蛋白质定量、免疫组化等方面。
免疫检验方法的优势在于其高灵敏度和高特异性。
通过选择合适的抗原和抗体，可以使免疫检验的灵敏度达到非常高的水平。
此外，免疫检验方法还可以通过自动化设备进行快速、准确的检测，大大提高了检测的效率。
然而，免疫检验方法也存在一些局限性。
例如，免疫检验结果可能受到其他因素的干扰，如药物的影响、抗体的交叉反应等。
此外，对于某些疾病，免疫检验的灵敏度和特异性可能不够高，需要结合其他检测方法进行综合分析。
免疫荧光技术基本原理
免疫荧光技术基本原理
免疫荧光技术是一种利用免疫反应原理进行检测的方法，通过标记荧光物质来检测目标物质的存在。
免疫荧光技术的基本原理如下：
1. 免疫反应：在免疫体系中，由于抗原与抗体之间存在特异性结合作用，可以通过免疫反应的方式将需要检测的目标物质与抗体结合起来。
2. 标记：将荧光物质与抗体结合，形成荧光标记的抗体。
常见的荧光物质有荧光素、荧光染料等，可以通过共价结合或非共价结合的方式将荧光物质与抗体结合。
3. 检测：将荧光标记的抗体加入样品中，使其与目标物质结合。
通过荧光显微镜或荧光分析仪等设备，可以观察到荧光信号的强度和位置。
4. 数据分析：通过荧光信号的强度和位置，可以判断目标物质的存在与否。
荧光信号的强度与目标物质的浓度呈正相关，荧光信号的位置可以反映目标物质在样品中的分布情况。
免疫荧光技术具有灵敏度高、特异性强、可定量检测等优点，广泛应用于生命科学研究、临床诊断等领域。
免疫荧光的原理和注意事项
免疫荧光的原理和注意事项
免疫荧光是一种用于检测细胞或组织中特定蛋白质的方法。
它
的原理是利用荧光染料标记的抗体与待检测的蛋白质结合，然后通
过荧光显微镜观察标记物的荧光信号。
这种技术常用于免疫细胞化
学研究、免疫组织化学研究以及临床诊断。
在进行免疫荧光实验时，有一些注意事项需要特别关注。
首先，选择合适的抗体和荧光染料至关重要，需要确保它们能够特异性地
结合待检测的蛋白质，并且具有足够的荧光强度。
其次，样本的处
理和固定非常重要，因为不恰当的处理可能会导致假阳性或假阴性
结果。
此外，实验过程中需要严格控制实验条件，包括温度、时间
和荧光显微镜的参数等，以确保实验结果的准确性和可重复性。
另外，免疫荧光实验中的负对照和正对照也是非常重要的。
负
对照用于确认荧光信号的来源是否为特定抗原，通常使用未与荧光
染料标记的抗体进行处理。
而正对照则用于验证实验条件和荧光显
微镜的性能，通常使用已知的阳性样本进行处理。
总的来说，免疫荧光技术是一种非常强大的工具，能够帮助科
研人员和临床医生观察和分析细胞或组织中特定蛋白质的表达和定
位。
然而，为了获得可靠的结果，实验者需要严格控制实验条件，并且在实验过程中注意选择合适的抗体和荧光染料，以及正确处理样本和控制实验质量。
常见免疫学检测方法
常见免疫学检测方法免疫学检测是一种重要的临床检测方法，通过检测免疫系统的功能来评估机体的健康状况。
在临床中，常见的免疫学检测方法包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术和免疫电泳等。
本文将对这些常见的免疫学检测方法进行详细介绍。
一、免疫荧光法免疫荧光法是一种通过荧光显微镜观察样本中荧光染色物的方法，用于检测抗原和抗体的相互作用。
这种方法可以用于检测多种疾病的诊断和病原体的鉴定。
通过标记荧光染料的抗体与待检测物相结合，然后在荧光显微镜下观察荧光信号的强度和位置，以确定样本中是否存在目标物质。
免疫荧光法具有高灵敏度和特异性，广泛应用于临床诊断。
二、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于疾病的早期诊断和治疗监测。
ELISA通过将待测物与特异性抗体结合，然后用酶标记的二抗结合抗体检测目标物质的含量。
ELISA 方法具有高灵敏度、高特异性和较宽的线性范围，可以同时检测多个样本，适用于大规模筛查和临床诊断。
三、流式细胞术流式细胞术是一种通过激光扫描和细胞荧光标记来分析和鉴定细胞的方法。
该方法可以检测细胞表面标记物、细胞内蛋白的表达以及细胞的功能状态。
流式细胞术通过将细胞悬浮液通过流式细胞仪，利用激光激发细胞中的荧光染料，然后通过多个光学参数来分析细胞的特征。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度和多参数分析的优势，被广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
四、免疫电泳免疫电泳是一种通过电场将免疫反应产物分离的方法，用于检测血清或其他生物液中的蛋白质成分。
免疫电泳将待检测样本与抗体结合后，通过电泳分离，然后在电泳胶上观察免疫反应产物的带型。
免疫电泳具有高分辨率和灵敏度，可以检测多种蛋白质异常，如免疫球蛋白、肿瘤标志物等，对于一些免疫相关疾病的诊断具有重要意义。
五、其他免疫学检测方法除了上述常见的免疫学检测方法，还有一些其他方法也被广泛应用于临床检测。
免疫荧光检测
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA)的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体（ANA)为例进行实习。
抗核抗体（antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称,能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞（如Hep—2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上.如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光.试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂.如需自行制备，方法如下：（1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞.冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2）Hep—2细胞抗原片制备:Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片,用洗涤洗去培养基.干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl.-30℃保存备用。
2．异硫氰酸荧光素（FITC)标记的抗人IgG抗体（FITC—抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
免疫荧光检测方法
免疫荧光检测方法
免疫荧光检测是一种基于抗原抗体反应的检测技术，利用荧光物质标记抗体，对组织或细胞内的抗原物质进行定位和定性分析。
以下是免疫荧光检测的两种主要方法：
1. 直接法：将标记的特异性荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
2. 间接法：滴加以/L，的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标
本片。
将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30分钟。
以上是免疫荧光检测方法的介绍，如有需要，建议咨询专业医师。
临床分析中的免疫荧光检测技术应用
临床分析中的免疫荧光检测技术应用免疫荧光检测技术是一种广泛应用于临床分析的重要技术手段。
该技术利用特定的抗体与待测样品中的抗原发生特异性结合，通过荧光染料标记的抗体来实现对结合物的检测和观察。
本文将重点介绍免疫荧光检测技术在临床分析中的应用，并且探讨其优势和局限性。
一、免疫荧光检测技术的原理及优势免疫荧光检测技术主要基于抗原-抗体反应原理，其中抗原可为来自病原体的特定蛋白质或其他化合物。
该技术通过特异性抗体的结合，实现对待检测抗原的定位和可视化。
相比传统的免疫组织化学染色技术，免疫荧光检测技术具有以下优势：1.高灵敏度：免疫荧光检测技术通过荧光信号的放大，能够检测到极低浓度的待测物质，从而提高检测的灵敏度。
2.高特异性：由于抗原-抗体反应的特异性，免疫荧光检测技术能够准确地区分目标分子和其他干扰物质，具有较高的特异性。
3.定量及定位：利用特定的荧光标记，免疫荧光检测技术可以进行定量分析，并且能够实现对待测物在细胞或组织中的准确定位。
二、免疫荧光检测技术在临床分析中的应用1.免疫疾病诊断免疫荧光检测技术在疾病诊断中具有重要的应用价值。
例如，在自身免疫性疾病的诊断中，可以通过检测自身抗体的存在及其在组织中的分布情况，来确定疾病的类型和程度。
2.感染病原体检测免疫荧光检测技术在检测感染病原体中起着关键的作用。
针对某些病原微生物，如病毒、细菌等，通过检测其特定抗原的荧光信号，可以快速且准确地诊断出感染情况。
3.肿瘤标志物检测免疫荧光检测技术在肿瘤标志物的检测上具有广泛应用。
通过检测血清或组织中的肿瘤标志物，可以帮助医生进行早期肿瘤筛查、疾病分期以及治疗效果的评估等。
4.免疫组织化学分析免疫荧光检测技术在免疫组织化学领域也得到广泛的应用。
通过使用特异性抗体和荧光染料，可以实现对组织中特定蛋白质的检测和定位，从而揭示疾病的发生机制和病理变化。
三、免疫荧光检测技术的局限性尽管免疫荧光检测技术具有诸多优势，但也存在一些局限性。
免疫荧光检测步骤
免疫荧光检测步骤
免疫荧光检测是一种用于检测生物样本中特定蛋白质或分子的技术。
以下是一般免疫荧光检测的基本步骤：
1. 样本准备：根据实验需求，准备适当的细胞、组织或切片样本。
确保样本的质量和保存条件符合要求。
2. 固定和通透：使用适当的固定剂（如多聚甲醛）固定样本，以保持样本的形态和结构。
对于细胞或组织样本，可能需要进行通透处理，以使抗体能够进入细胞内部。
3. 抗原修复：对于某些样本，可能需要进行抗原修复步骤，以暴露被掩盖或隐蔽的抗原表位。
4. 封闭：使用非特异性蛋白或血清封闭样本，以减少非特异性结合。
5. 一抗孵育：选择适当的一抗，将其稀释到适当的浓度，并与样本一起孵育，使一抗与目标抗原结合。
6. 洗涤：孵育后，用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的一抗。
7. 二抗孵育：选择与一抗种属匹配的荧光标记二抗，将其稀释到适当的浓度，并与样本一起孵育，使二抗与一抗结合。
8. 洗涤：再次用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的二抗。
9. 荧光显微镜观察：将样本置于荧光显微镜下，选择适当的激发波长和滤光片，观察荧光信号的分布和强度。
10. 图像分析：根据需要，可以使用图像分析软件对荧光图像进行分析和定量。
需要注意的是，免疫荧光检测的具体步骤可能因实验目的、样本类型和所使用的抗体而有所差异。
在进行实验之前，建议仔细阅读相关的实验方案和操作指南，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
免疫荧光检测技术在疾病诊断中的应用
免疫荧光检测技术在疾病诊断中的应用随着医疗技术的不断发展，现代医学诊疗已经朝着精准医学的方向发展。
而在疾病的诊断中，免疫荧光检测技术也得到了广泛的应用。
该技术通过标记抗体或抗原的荧光物质，可以准确而快速地检测到病原体或疾病标记物，为临床实践带来了很大的便利性和精准性。
一、免疫荧光检测技术原理免疫荧光检测技术是将标记有荧光物质的抗体和抗原结合在一起，从而可以通过荧光显微镜直接观察到有荧光标记的分子。
利用不同颜色的荧光物质，可以同时检测多种疾病特异性标记物。
免疫荧光检测技术的特点是具有快速、灵敏、特异性高等优点，同时可以检测到微量的抗原或抗体，对疾病的早期诊断、治疗和病原体研究等方面提供了有力的支持。
二、1. 感染性疾病的诊断免疫荧光检测技术广泛应用于感染性疾病的早期诊断。
与传统的检测方法相比，免疫荧光检测技术具有优点：（1）可以对抗体、抗原和病毒进行量化检测，从而确定疾病的程度和病毒感染的情况；（2）检测结果快速准确，并具有高特异性和高灵敏度，不会出现假阳性结果。
例如，临床常用的检测流感病毒的方法之一，就采用了免疫荧光检测技术。
这种方法通过检测病毒衍生物的荧光信号，可以确定感染者体内的病毒数量和病毒毒株的种类，从而实现感染性疾病的早期诊断和治疗。
2. 自身免疫疾病的诊断免疫荧光检测技术也被广泛应用于自身免疫性疾病的诊断中。
自身免疫性疾病的发生与人体免疫系统异常有关，其诊断需要依靠抗体和抗原的检测。
通过将抗体或抗原与荧光物质结合，可以使目标分子显示荧光标记，并在荧光显微镜下直接观察到。
例如，免疫荧光检测技术被广泛应用于系统性红斑狼疮、硬皮病等自身免疫疾病的诊断中。
免疫荧光检测技术不仅能够表征抗体的种类和丰度，还可以检测可疑病灶的位置、形态和分布等信息，从而为自身免疫疾病的诊断、治疗和研究提供了有力的支持。
3. 肿瘤标记物的检测免疫荧光检测技术也是肿瘤标记物检测的重要手段之一。
肿瘤标记物是在肿瘤细胞或衍生物中产生的特异性成分，可以作为肿瘤的诊断指标。
免疫荧光法
免疫荧光法
免疫荧光法是一种非常有效的，可以快速检测制药产品、细胞标记、蛋白质定量和分析等等生物学应用的一种实验技术。
该技术由一种将荧光探针与抗体结合的技术构成，可以检测抗原或抗体及衡量血清和组织水平的免疫学反应。
在免疫荧光法的临床实验中，抗体制备的过程和其标记的技术都可以很好地检测抗原，同时该技术也能够准确地计算出血清与组织水平的免疫学反应。
免疫荧光技术的关键步骤是将抗体和荧光探针结合在一起，使得抗体能够与单个细胞内的抗原发生结合。
抗体通常从抗原特异性的特异性抗体库中制备，但也可以从未经特异性处理的抗体中制备。
荧光探针可以是荧光素、金属离子或杂环，其作用是使抗体与抗原结合，这是免疫荧光法的基本原理。
免疫荧光法的成功大多是由于它的特性而得到的。
它可以很快地检测含有抗原的样品，从而减少抗原检测所需的时间。
它也可以比其他技术更精确地检测抗原，从而避免抗原误检、抗体误检等情况。
此外，该技术还可以在一个过程中完成抗原的定量和定性分析，从而可以更方便地检测抗原。
免疫荧光技术已经成功应用于肿瘤抗原的分析中，有助于提高抗原检测的灵敏度。
该技术还可以用于蛋白质定量和分析，用以检测有效的药物的药效，从而促进药物研发和药物测试。
此外，它还可以用于抗体识别，抗体筛选和抗原识别等方面。
总而言之，免疫荧光技术是一种很有效的技术，有助于快速检测
抗原、蛋白质定量和分析等生物学应用。
它的抗原检测能力非常出色，还可以精准地检测出血清与组织水平的免疫学反应。
此外，该技术还可以用于药物研发和药物测试，抗体识别和抗原识别等方面。
因此，免疫荧光技术在临床实验中的应用前景非常广阔。
检验科常见自身免疫疾病检测方法
检验科常见自身免疫疾病检测方法自身免疫疾病是一类由免疫系统异常引起的疾病，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病等多种疾病。
这些疾病的早期诊断对于及时采取治疗措施具有重要意义。
为了确定自身免疫疾病的诊断，医生通常会使用一系列的检测方法。
本文将介绍检验科常见的自身免疫疾病检测方法。
一、免疫荧光法免疫荧光法是一种常见的用于自身免疫疾病检测的方法，它是基于抗体与抗原的特异性结合原理。
通过给患者的血液标本添加适当的荧光标记抗体，然后观察标本中是否存在荧光染色的细胞或组织，以确定是否存在自身抗体的产生。
这种方法可以检测多种自身抗体，常用于类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病的早期筛查。
二、酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种利用酶标记的二抗体检测特定抗原或抗体的方法。
在自身免疫疾病的检测中，ELISA常用来测定患者血清中的自身抗体水平。
通过将待测血清与特定的抗原结合，然后加入酶标记的二抗体，再加入底物反应产生颜色，可以测定反应的光密度来判断抗体的存在与否以及水平的高低。
这种方法方便、灵敏度高，常用于硬皮病等自身免疫疾病的诊断。
三、免疫透析法免疫透析法是一种常用的半定量检测方法，它的原理是通过酸化或热变性改变标本中的抗体结构，使其无法与特定抗原结合。
通过将患者血清与已知抗原结合后，加入过量的未标记抗原和少量的标记抗原，观察标本中是否有特定结合的免疫复合物的形成。
这种方法具有操作简单、成本低廉的优点，适用于多种自身免疫疾病的检测。
四、流式细胞术流式细胞术是一种通过测定单个细胞表面或内部标记物来分析、计数和鉴定细胞群体的方法。
在自身免疫疾病的检测中，流式细胞术可用于检测特定自身抗体和免疫细胞亚群。
它通过将标本中的细胞与特定的荧光标记抗体结合，再通过仪器的光学装置分析细胞的特性。
流式细胞术具有高效、快速、灵敏度高的优势，被广泛应用于自身免疫疾病的诊断与监测。
五、免疫电泳法免疫电泳法是一种利用电场将蛋白质分离并测定其免疫特性的方法。
皮肤直接免疫荧光检查
皮肤直接免疫荧光检查
皮肤直接免疫荧光检查（Direct Immunofluorescence，DIF）是一种高敏感度的诊断方法，可以快速准确地检测人体表皮或者真皮组织中抗原抗体的结合情况。
它是利用荧光免疫学原理，将抗体标记上特殊的染色剂，使之能够发出某种特殊颜色的发光，从而对疾病的存在与否进行检测的一种方式。
皮肤直接免疫荧光检查（DIF）主要应用于诊断自身免疫性疾病，如牛皮癣、带状疱疹、类风湿性关节炎、系统性硬化症等等。
DIF也可以用于诊断肿瘤，如淋巴瘤和胃肠道肿瘤等。
皮肤直接免疫荧光检查是通过在特定的组织中，使用特殊的染色剂来检测抗原抗体结合情况的。
具体步骤如下：
1、准备样本：首先，将要检测的皮肤脱落部位取下，并将其放置在一个明确的清晰的晶片上，便于下一步的操作。
2、加入染料：然后，将检测所需的抗原抗体或抗体溶液加入到皮肤样本上，使其与抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
3、加入染色剂：接下来，将染色剂加入到皮肤样本上，使抗原-抗体复合物能够发出特殊颜色的发光。
4、照射紫外线：最后，将抗原-抗体复合物照射上紫外线，使其发出不同颜色的发光，从而检测疾病的存在与否。
如果结果显示，抗原-抗体复合物发出的发光呈现特定颜色，则表明存在某种特定疾病。
相反，如果抗原-抗体复合物未发出发光，则表明不存在该疾病。
皮肤直接免疫荧光检查是一种非常有效的诊断方法，它可以在短时间内准确地检测出患者患有哪些自身免疫性疾病或肿瘤。
此外，DIF也可以用来监测疾病的发展情况，从而帮助医生更好地控制病情。
带你了解免疫荧光微生物检测
带你了解免疫荧光微生物检测免疫荧光法是生物医学领域里至关重要的检测技术之一，它能迅速地检测到各种样品中所存在的微生物，其中包括但不仅限于血液，体液，食物及环境。
用特异性抗体鉴定细胞表面特征以达到检测微生物目的，是高灵敏，高精度和快速检测手段。
它将免疫学方法与荧光标记技术相结合，探索特异性蛋白抗原的细胞分布规律，能对对细胞抗原的高精度定位，为疾病预防提供了一种新手段，被广泛应用于检测和鉴定食品、药品、化妆品等产品中的病原微生物。
不仅具有快速检验的特点，而且在敏感度和特异度方面均表现出较高的水平，因此已成为诊断学中最为常用的方法之一，那你知道免疫荧光法的基本原理是什么吗？检测范围以及有点有哪些吗？免疫荧光检测微生物的价值是什么吗？下面我们一起了解一下。
一、免疫荧光法的基本原理免疫荧光法是一种分子生物学的检测技术，其基本原理在于将已知的抗原或抗体标记上的荧光素制成荧光标记物标记的抗体与微生物的表面抗原结合，然后利用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体），从而生成荧光标记的免疫复合物。
该原抗体复合物含有荧光素，当荧光素受到激发光的照射时，会发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），从而可以清晰地看到荧光所在的细胞或组织，进而确定抗原或抗体的性质和位置。
随着生物分析和分子生物学研究的发展，免疫分析法已经成为了现代临床医学检验的一个非常有前景的手段之一。
二、检测范围及优点1.检测范围（1）血清学检测。
可以采用免疫荧光技术来检测血液中的微生物。
血液样本可用于检测多种血清反应，包括但不限于肝炎病毒、艾滋病病毒、莱姆病等疾病的检测。
（2）微生物特异性抗原的检测。
利用酶联免疫技术，以大肠杆菌为指示菌制备了一种可用于生物传感器的快速检测方法，并对影响灵敏度的各种因素进行了研究。
微生物特异性抗原的探测是免疫荧光技术领域中备受瞩目的另一项重要研究。
在本研究中我们采用了一种简单而又实用的方法对这些菌进行定性检测。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫荧光技术(检测抗核抗体(ANA)得实验方案)荧光免疫技术就是以荧光物质标记得特异性抗体或抗原作为标准试剂,用于相应抗原或抗体得分析鉴定与定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术与荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术就是用荧光抗体对细胞、组织切片或其她标本中得抗原或抗体进行鉴定与定位检测,可在荧光显微镜下直接观察结果,称为荧光免疫显微技术,或就是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定与荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(AＮＡ)为例进行实习、抗核抗体(aｎtinｕclear anｔibodｙ,ANA)又称抗核酸抗原抗体,就是一组将自身真核细胞得各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNＡ、可提取得核抗原(ＥNA)与ＲNＡ等作为靶抗原得自身抗体得总称,能与所有动物得细胞核发生反应,主要存在于血清中,也可存在于胸水、关节滑膜液与尿液中、抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Heｐ－2)作抗原片,将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA,就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记得抗人ＩgG抗体又可与ANA结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1.抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备,方法如下:(１)肝印片制备:取4-8周龄小鼠,断颈杀死后,剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块,用生理盐水洗去血细胞,用滤纸吸干渗出得浆液。
将切面轻压于载玻片上,使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干,乙醇固定,冰箱可保存1周。
(2)Hｅｐ—2细胞抗原片制备:Hｅp－２细胞就是建株得人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片,用洗涤洗去培养基。
干燥后,用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备:取小鼠肝组织作冰冻切片,厚４μl。
-3０℃保存备用。
2.异硫氰酸荧光素(ＦITC)标记得抗人IgＧ抗体(FITC—抗人IｇＧ抗体)有商品供应,临用时按效价稀释。
３、0、０1mｏl/Ｌ pＨ7。
2 ＰBS４。
缓冲甘油取甘油9份加PＢＳ 1份、5。
待测血清、阳性与阴性对照血清临床标本筛选获得。
6。
器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等操作方法１.准备:检查加样板,生物载片恢复室温,标记、2、稀释:PBS－Tweｅn缓冲液稀释血清,设阴阳性对照。
3、加样:加样板放于泡沫塑料板上,加２5μl稀释后血清,至加样板得每一反应区,避免气泡、加完所有标本后开始温育。
4、温育:将生物薄片盖于加样板得凹槽里,反应开始,室温温育30分钟。
5。
冲洗:用烧杯盛ＰＢＳ－Tween缓冲液流水冲洗生物薄片,然后立即将其浸入盛有ＰBＳ－Tｗeｅn缓冲液得小杯中至少1分钟、不必混摇、6。
加样:滴加20μｌ荧光素标记得抗人球蛋白(结合物)至一洁净加样板得反应区,完全加完方可继续温育。
荧光素标记得抗人球蛋白用前需混匀并以PBS—Twｅen缓冲液稀释。
７.冲洗:用烧杯盛PBS－Tweeｎ缓冲液流水冲洗生物薄片,然后立即将其浸入盛有PBS—Tweｅn缓冲液得小杯中至少1分钟。
不必混摇。
8.封片:将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中,滴加甘油/ＰＢS至盖片:每反应区约1０μl。
从ＰBS—Tween缓冲液中取出１张生物薄片,用纸擦干背面与四边。
还要擦拭反应区间隙。
将生物薄片面朝下放在已准备好得盖玻片上,立即查瞧并调整使盖片嵌入载片得凹槽中。
然后继续下1张、结果判定荧光显微镜下观察1.细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞,不发荧光为阴性。
抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性,否则为阴性。
阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
2.根据细胞核着染色荧光得图像,可区分为:①均质型:细胞核呈均匀一致得荧光;②周边型(核膜型):细胞核周围呈现荧光;③斑点型(颗粒型):细胞核内呈现斑点状荧光;④核仁型:核仁部分呈现荧光。
⑤混合型:两种以上核染色;⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACＡ)注意事项1。
PBS－Tweｅn缓冲液在4℃下可存放两周、２。
根据每次实验得标本量决定需要稀释得FITＣ标记得抗人球蛋白得量,稀释后可在4℃下可存放１周、３、血清或FIＴC标记得抗人Ｉg应滴加至加样板上,不能直接滴到载片上。
4.载片盖到加样板上后,确保反应区与液滴完全接触后,才开始记时温育、5。
冲洗载片时水流要缓慢,以免冲洗掉基质。
载片上得反应区应保持湿润,不要将载片风干、6.封片进不可用力挤压盖玻片,以免损坏基质。
可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。
7、封片介质含有荧光稳定剂,应保存在2-8℃、封好得载片可于4℃长期保存、实验讨论方法评价间接免疫荧光技术就是检测ANＡ最常用得方法。
该方法简便、敏感,且可根据核染色形态确定核抗原得类型。
鼠肝印片细胞分布不均匀,多有重叠,冲洗时易丢失、Heｐ—2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原得特征,对诊断与鉴别不同类型得自身免疫病十分有利。
检测抗核抗体(ANA)得实验方案AＮＡ简介抗核抗体(antinuclｅar aｎtibodｉes,ANＡｓ)经典定义:针对细胞核成分得一大组抗体谱、抗核抗体新概念(FＡNA)传统定义:顾名思义就是指抗细胞核抗原成分得自身抗体得总称® 狭义定义现代定义:就是指抗细胞内所有抗原成分得自身抗体得总称。
对AＮA得理解已不再局限于核成分,而就是指抗核酸(nｕcleic acid)与核蛋白(nucleoprotｅin)抗体得总称® 广义定义靶抗原分布:细胞核细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期抗核抗体检测方法检测细胞内抗原自身抗体“金标准”－IIFANＡ检测方法进展:仅限于IＩF改良法(底物选择、制备方法)试图将ＥＬISA发推广为最基本得筛选方法未获成功复制细胞抗原全部成分极其困难®抗原存在得相对浓度、自然抗原决定簇得二级结构及高级结构荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性IIＦ法:HEp-2细胞底物(90％以上实验室采用)＃完整得ＡNAｓ抗原谱(细胞核、浆、骨架、周期)# 可预测分析AＮA靶抗原范围＃经验性强ELISＡ法:采用高度纯化抗原或全细胞抗原# 抗原谱有限(十余种)# 假阴性结果# 操作简单快速其她方法:金标法、比浊法ANＡ靶抗原多核苷酸:双链DNA、单链DNA、ＲＮＡ组蛋白:H1,H2A,Ｈ2Ｂ,H3,H4,Ｈ2A－H２B复合物核浆得核糖核蛋白:Ｕ1-nRNP、Ｓｍ、SＳ—A(Ｒo)、ＳS－B(La)、Ｋu、Ｍi-1、Ｍi—2、核点、增殖性细胞核抗原…核仁抗原:Ｓcｌ-70、U３—nRNＰ/原纤维蛋白、RNＡ多聚酶Ｉ、ＰM-Scl(PＭ－1)、7－2-RNP(Ｔｏ)、4－6—S—ＲNA、核仁形成中心(NOＲ)…核膜抗原:板层素(层粘连蛋白)着丝点:着丝点蛋白……ANＡ检出率与年龄与性别有关与个体得免疫稳定性相关使用足够敏感得方法,每个人都可检测出一些ANＡ、__＿__＿___天然ＡＮA__＿＿___＿＿生理性自身免疫维持机体内环境得生理稳定。
滴度较低,亲与力弱,大多为IgM型。
ANA检测方法初筛抗核抗体:IIF最佳基质 :联合生物薄片(ＨＥp—２细胞/猴肝冰冻组织)区分抗核抗体得靶抗原:ELIＳA、印迹法与免疫印迹法ＡNＡ初筛IＦT:HEp—2细胞/灵长类肝脏完整得抗原谱(细胞核及细胞浆)可预测靶抗原协助检测其它项目(如 ANＣＡ、ENＡ)ELＩSA:采用高度纯化得抗原初筛ANA抗原谱有限操作简单快速采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验为了使实验操作标准化,欧蒙开发了滴定平板技术? :滴加标本或标记抗体至加样板得反应区,然后将生物薄片载片盖在加样板表面得凹槽里,这时,载片上得所有生物薄片均与液滴接触,反应同时开始。
系统得几何结构决定了液滴得位置与高度。
因为液体被局限在一封闭得空间里,所以不再需要传统得“湿盒"。
并且可在一致得反应条件下同时温育任何数量得标本、准备:检查加样板就是否反应区亲水而周边疏水?如果不就是,可用湿纸巾擦拭,必要时可使用家用洗涤剂或Eｘtrａn ＭA ０1(默克公司),再用水彻底冲洗、需要消毒时,可于3％得Ｓｅｋuｓept Extｒa (汉高公司)中浸泡1小时。
只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。
不要触及生物薄片。
按照要求用记号笔对玻片进行标记。
稀释: 按照试剂盒使用说明稀释血清标本。
每次实验均需加入阳性与阴性对照。
对照血清使用前必须混匀。
加样:在加样板得每个反应区加入稀释血清,避免产生气泡。
滴加完所有待测标本后才开始温育(一次最多２00份)、使用聚苯乙烯加样板。
加样体积:１0 µl/反应区(3 ｘ３mm)2５µl／反应区(５ｘ５mm)70 µl／反应区(7 ｘ９mm)温育:将载片盖在加样板对应得凹槽里,反应即开始。
确保每个标本均能够与生物薄片相接触,而标本之间不相互接触、室温温育3０分钟。
清洗:用烧杯盛ＰBＳ—Tweｅn缓冲液,流水冲洗载片,然后立即放入装有PBS－Twee ｎ缓冲液得小杯中浸洗至少５分钟。
冲洗１秒钟小杯内浸洗5分钟加样:将荧光标记得抗人免疫球蛋白(酶结合物)加入洁净加样板得每个反应区。
完全加完所有得二抗后,方可继续温育(最多可加５0个载片)。
使用连续加样器、加样前应使用加样器混匀。
为节约时间,可在第一步温育得同时滴加酶结合物至另一个加样板得反应区中。
加样体积:10 µl/反应区(3x ３ｍm)20 µl/反应区(５ｘ5 mm)６０µｌ／反应区(7 ｘ9 mm)温育:从ＰＢS—Tweeｎ清洗缓冲液中取出一张载片,5秒钟内用吸水纸擦一下背面与边缘后,立即将载片覆有生物薄片得一面朝下,盖在加样板得凹槽里。
注意:为防止破坏基质,不要擦拭反应区得间隙、检查生物薄片就是否与液滴接触良好,然后继续下一张。
从现在开始,注意避免阳光直射载片。
室温温育30分钟、清洗: 用烧杯盛ＰBS-Tweｅn缓冲液,流水冲洗载片,然后立即放入装有PＢS—Tｗeen缓冲液得小杯中浸洗至少５分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加１0滴(15０µl)伊文氏蓝进行复染。
冲洗１秒钟小杯内浸洗５分钟封片: 在盖玻片上滴加甘油/PBS。
使用聚苯乙烯封片板。
从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片,用纸擦干背面与四边,注意不要擦拭反应区间隙。
将载片得生物薄片朝下置于准备好得盖玻片上,立即检查盖玻片就是否放入载片得凹槽里,如有必要,需调整位置,正确放置、然后再进行下一个载片得操作。
封片体积:10 µl/反应区(３x ３mm)1０µl／反应区(5 x ５mm)20 µｌ／反应区(7x9 mm)结果判断:荧光显微镜下观察荧光、具体操作荧光工作台得布置清洗载片得擦拭封片AＮA得结果间接免疫荧光法得独特优势(一种基质–可筛查上百种不同得抗体 )用HEp-２细胞检测自身抗体ANA荧光模型核均质型核仁型核颗粒型胞浆型ANA确认实验(１)ＩＦＴ:-HEｐ-2细胞／灵长类肝脏:特殊得荧光模型如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白ELIＳA:-ANA分项(含ＥNA 谱):包被高度纯化抗原斑点法/ 印迹法—ENA 谱:采用各种高度纯化得抗原ELIＳA:抗ENＡ谱印迹法:抗ENA谱印迹法:抗EＮA谱免疫印迹法ANA确认实验(２)Wｅstｅrｎblｏt:HEp—2细胞提取物－定性－适宜特别需要(如区分靶抗原Ro 52 或Ro 60)- 检测目前无法纯化得靶抗原得抗体(如PM－Ｓcl、Ｋu)结论初筛实验:免疫荧光技术(HEp－2细胞/灵长类肝脏)ELＩSA (纯化得多种核抗原)确认实验:EＬISＡ印迹法斑点法WesｔeｒnｂlotANA谱与相关疾病相关疾病得ＡNＡ谱ANA得各种荧光模型、靶抗原及相关性高滴度得ANA仅出现在自身免疫性疾病中自身免疫性疾病 AＮA阳性率(％)系统性红斑狼疮活动期 9５－10０非活动期80－100药物诱导得红斑狼疮 100混合性结缔组织病100类风湿性关节炎２0－40进行性系统性硬化症2０－５０多发性肌炎及皮肌炎８5－95干燥综合征３0－５0慢性活动性肝炎７０－80溃疡性结肠炎７0—８其它风湿病26SＬE抗核抗体得检出率靶抗原检出率(%)dsＤNA 3０-90Sm 5-30核糖体P蛋白5-15周期蛋白Ｉ(PCNA) 3ｓsDNA 7０—９5组蛋白４0—8０U1－nRＮP 15—４０SS—A ２0—６0ＳS—B １０-２0Ku ５－10心磷脂、b２－GP1 2０－４0抗细胞抗体荧光模型(immuｎｏflｕorescenｔpatteｒｎ)常见得荧光染色模型有6种:核均质型(hｏｍogeneoｕs pattｅrn,H)核颗粒型(Gｒanulogus ｐaｔteｒｎ,S)核仁型(ｎｕcleous patteｒn,Ｎ)核膜型(ｍembrａnｏｕｓｐaｔtern,Ｍ)着丝点型(ｃentromert pａttern,ＡCＡ)胞浆型(ｃｙtoplasmｉc patterｎ,ＡCYA)ＨEp－2细胞／灵长类肝脏:核均质型sｓDNA / ｄｓDNA靶抗原:单链、非天然DNA(嘌呤与嘧啶硷基对)双链、天然ＤＮＡ(脱氧核糖核酸结构)相关性: sｓDNA类风湿８0。