分子荧光光谱法

菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
实验一 分子荧光光谱法
分子荧光分析法的基本原理
介绍荧光光谱的产生、主要影响因素、 介绍荧光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度 与被测物质之间的关系
荧光分析仪器 分子荧光定量分析
1. 概述
一、分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后， 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃 迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态， 迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态， 这种现象称为分子发光， 这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的 分析方法为分子发光分析法
O
O
N
H
N H
（四）取代基的类型 ——取代基对荧光物质的荧光特征和 ——取代基对荧光物质的荧光特征和 强度也有很大影响。分成三类： 强度也有很大影响。分成三类： OH、 （1）增强荧光的取代基 —— 有 -OH、OR、 OR、 -NH2、-NHR、-NR2等给电子基团 NHR、 电子（孤对电子） 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与 轨道平行， 电子， 苯环上的 π 轨道平行，共享了共轭 π 电子， 扩大了共轭体系，使荧光波长长移， 扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强 度增强
但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
基态单重态 S0
S0, S1, S2, S3分别代表基态, 第一, 二, 三激发单重态 分别代表基态, 第一, 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8
若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变， 若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变， 由基态单重态→激发三重态， 由基态单重态→激发三重态，净自旋 ≠ 0。这种跃 迁为禁阻跃迁
2. 刚性平面结构—较稳定的平面结构 刚性平面结构— 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构
-
o
o o
-
o o
c
c
-
-
o
o
o
o
荧光素：氧桥把两 荧光素： 个环固定在一个平 面上， 面上，具有平面结 构，强荧光物质 酚酞：无氧桥把两 酚酞： 个环固定， 个环固定，不能很 好的共平面， 好的共平面，为非 荧光物质
发荧光的分子数 激发态分子总数
ϕ f 是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物 是一个物质荧光特性的重要参数， 质发射荧光的能力， 越大，荧光越强， 0~1之间 质发射荧光的能力， ϕ f 越大，荧光越强，在0~1之间
一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是 一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是 最强最有用的荧光体
（2）减弱荧光的取代基 ——-COOH 、 -NO2 、 ——-COOR 、-NO、-SH 吸电子基团, 使荧光波长短 NO、 吸电子基团, 移，荧光强度减弱 • 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 芳环上被F Cl、Br、 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。 磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量 增加而减弱，磷光相应增强， 增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子 效应。 效应。
1. 共轭体系——有较强的荧光 共轭体系——有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， π电子共轭 程度越大，越易产生荧光; 环越多， 程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越 大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强 产生荧光波长越长，
φf 苯 萘 蒽 0.11 0.29 0.46 λ ex /nm 205 286 365 λem /nm 278 310 400 350
（3）影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
- SO3H等
三、环境对荧光的影响
1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出 不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移， 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移， 荧光强度增大 2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度 温度的影响——低温下测定 低温下测定， 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变， 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而 非辐射跃迁随温度升高显著增大。 非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光 物质都随溶液温度升高荧光效率下降， 物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强 度减弱。 度减弱。
法
二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强（ 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光 强度， 强度，可提高荧光强度
激发 激发光 强 发射荧光 强 物质
采用高灵敏度的检测系统可大大提高 灵敏度， 灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法 低2~4个数量级 个数量级
2. 选择性好 不同的物质用不同的光进行激发， 不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发 光波长 不同的物质发射的荧光不同， 不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光 波长 比较容易排除其它物质的干扰， 比较容易排除其它物质的干扰，选择性好 3. 实验方法简单 4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广 待测样品用量少；仪器价格适中； 具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 广泛应用在生物化学、分子生物学、 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧 产品分析、环境分析等领域。 产品分析、环境分析等领域。 荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法 荧光法比磷光法应用广泛，
3. pH的影响 pH的影响
大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧 光性质受溶液pH的影响很大 光性质受溶液pH的影响很大 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体， 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具 有各自的荧光效率和荧光波长 例： 苯酚 pH≈1有 有 荧光 pH≈13 无荧光 离子化后自旋平行
T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态 分别表示第一、 三重态分子具有顺磁性， 三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为 10-4~1S
分子中电子受激跃迁到激发态后， 分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分 子是不稳定的， 子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有 两种方式： 两种方式：无辐射去激和辐射去激 2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去 体系内的多余的能量以热的形式释放。包括： 激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括： 内部转换（IC） 内部转换（IC）—相同的多重态之间的转换 S-S 系间窜跃（ISC） 系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换 S-T 振动驰豫（VR） 同一电子能级中， 振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动 能级到较低振动能级的过程 外部转移— 外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用及能量转移， 相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消 灭 发生系间窜跃电子需转向， 间进行， 发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内部 转换困难
例 1，2 - 二苯乙烯
H H C =
H C =
C
H C
顺式：非平面构型 非荧光体
反式：平面构型 强荧光体
（三）金属螯合物的荧光
大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光， 些螯合物都能产生很强的荧光， 些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属 离子的测定 或不发荧光，但与M 不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与Mn+形 成螯合物后变为平面构型， 成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产 生荧光 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+— Al3+、Mg2+ 羟基喹啉为弱荧光体， 形成螯合物后，能形成刚性结构， M 形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光 荧光
S0
图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图
二、荧光与分子结构的关系
了解荧光与分子结构的关系， 了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产 生荧光，在什么条件下产生， 生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么 特征以便更好地运用荧光分析技术， 特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把 不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体， 不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体， 弱荧光体变成强荧光体 （一）荧光效率 荧光强度常用荧光量子效率φ 荧光强度常用荧光量子效率φf 来描述 荧光量子效率 ϕf =
2. 荧光光谱法
一、荧光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后， 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁 产生荧光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 π* → π π* →n
基 态 在光致激发和去激发光的过程中，分子中 在光致激发和去激发光的过程中， 的价电子（ 电子） 的价电子（ π、n电子）处于不同的自旋状 电子 态，通常用电子自旋状态的多重性来描述
较高激发态 吸收能 量受激 基 态 光辐射 退激
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分 为以下几类： 为以下几类：
荧光—荧光分析法 荧光 荧光分析法
光致发光： 光源来激发而发光 光致发光：以光源来激发而发光
磷光—磷光分析法 磷光 磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 来激发而发光— 电致发光： 电能来激发而发光 生物发光： 生物体释放的能量激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 激发而发光— 化学发光： 化学反应能激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析