第二章 生物样品的制备
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第二章 样品的采取、制备、
生物鉴定法
biological identification 精密度precision 准确度accuracy 灵敏度sensitivity 偶然误差accidental error 偏差deviation
变异系数
coefficient of variation 标准偏差standard deviation
将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中瓶签上将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中瓶签上注明名称采样日期交货数量采样方法及注明名称采样日期交货数量采样方法及其他应说明的情况并由经手人签封其他应说明的情况并由经手人签封样品的采取样品的采取制备处理和保存样品的采取制备处理和保存前页前页前页前页后页后页后页后页首页首页首页首页
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样品的采取、制备、处理和保存
采样实例
全脂奶粉取样
V 桶箱包装：开启总数的1％，用83㎝长的开口钎，先加 以杀菌，然后自容器的四角及中心各采一钎，放在盘 中，采取约总量的1‰为检验用。
V 瓶装、听装：按批号分开，自该批产品堆放的不同部 位采取总数的1‰，但不得少于2件。尾数超过500件应 加抽1件。
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加标样品additional sample
样品的采取、制备、处理和保存
第一节 样品(sample)的采取
正确采样(sampling)的意义和概念 V 采样：从产品中抽取有一定代表性样品，供分析检验的 过程。
V 检样：由整批食物的各个部分采取的少量样品称为检样 V 原始样品(original sample)：把许多份检样综合在一起称
V 有机物破坏法：食品中无机盐或金属离子的测定。 )干法灰化(dry ashing):通过灼烧手段分解食品的方法。 ) 湿法灰化(wet ashing):通过加入强氧化剂(如浓硝酸、 高氯酸、高锰酸钾等)消化食品的方法。
biological identification 精密度precision 准确度accuracy 灵敏度sensitivity 偶然误差accidental error 偏差deviation
变异系数
coefficient of variation 标准偏差standard deviation
将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中瓶签上将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中瓶签上注明名称采样日期交货数量采样方法及注明名称采样日期交货数量采样方法及其他应说明的情况并由经手人签封其他应说明的情况并由经手人签封样品的采取样品的采取制备处理和保存样品的采取制备处理和保存前页前页前页前页后页后页后页后页首页首页首页首页
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样品的采取、制备、处理和保存
采样实例
全脂奶粉取样
V 桶箱包装：开启总数的1％，用83㎝长的开口钎，先加 以杀菌，然后自容器的四角及中心各采一钎，放在盘 中，采取约总量的1‰为检验用。
V 瓶装、听装：按批号分开，自该批产品堆放的不同部 位采取总数的1‰，但不得少于2件。尾数超过500件应 加抽1件。
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加标样品additional sample
样品的采取、制备、处理和保存
第一节 样品(sample)的采取
正确采样(sampling)的意义和概念 V 采样：从产品中抽取有一定代表性样品，供分析检验的 过程。
V 检样：由整批食物的各个部分采取的少量样品称为检样 V 原始样品(original sample)：把许多份检样综合在一起称
V 有机物破坏法：食品中无机盐或金属离子的测定。 )干法灰化(dry ashing):通过灼烧手段分解食品的方法。 ) 湿法灰化(wet ashing):通过加入强氧化剂(如浓硝酸、 高氯酸、高锰酸钾等)消化食品的方法。
生物样品制备
1.2 注意事项 • 采样要有代表性(体液：几μL ，器官组织：几 mg); • 采样时机； • 采样部位准确； • 采样后应立即加以处理，如采好血样后立即加 抗血凝剂，组织器官加防腐剂，动物样品速冻处 理，植物样品脱水处理。 • 采用工具需消毒，最好经过无毒处理。
2 细胞破碎 2.1 目的
破坏细胞外壳，使细胞内含物有效地释放出来。 即：将生物体细胞内及多细胞生物组织中的待测组 分(如激素、酶、基因工程产物等)充分释放到溶液 中。 不同的生物体
(2) 盐析法 原理：利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶 解度不同程度的降低来沉淀除去蛋白质。 在低盐浓度下，蛋白质溶解度随着盐浓度升 高 而增加－－盐溶作用； 当盐浓度不断升高时，不同蛋白质溶解度又以
不同程度下降，并先后析出沉淀－－盐析作用。 （这是蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团的静电引力造成的。由于水中
表面活性剂处理法：
常用的有：十二烷基磺酸钠
氯化十二烷基吡啶
去氧胆酸钠
其他方法：
改变细胞膜透性、破坏蛋白质与脂类结合等。 如真空干燥、制成丙酮粉。 注意：
• 无论用哪一种方法破碎细胞，都需要在一定的
稀盐溶液或缓冲溶液中进行；
• 一般还需加入保护剂防止生物大分子变性和
降解。
二 生物大分子的提取与蛋白质的去除
加入少量盐，增加了溶液的极性，减弱了蛋白质分子间的作用力，促使其溶解 度增大。当盐浓度增加到一定程度时，水活度被降低，蛋白质表面的电荷大量 被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子又相互聚集而沉淀析出。）
盐析法的优点： 对设备和条件要求低，安全，应用范围广泛； 一般可在室温下操作； 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、 氯化钠、磷酸钠等。 硫酸铵的盐析能力强，饱和液浓度大，溶解
gsg-第二章 生物样品的制备
32
细胞破碎相关的器械与器材
• 1)电动组织捣碎机
• 原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在 高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。 • 市售仪器多数是可调速机型，有不同口径 、头端式样的转子供选择，平头转子适于 制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制 备组织和含纤维物质的匀浆。 • 应用：一般用于动物组织，植物肉质种子， 柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高 转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械 切力很大，制备较大分子样品很少使用。 动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和 细菌需加入石英砂加强效果。
2. 通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、 化学以及生物学性质
3. 生物材料的破碎和预处理 4. 分离纯化方法的选择和探索 5. 选择相应、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备 物的均一性（即纯度）的方法 6. 产物的浓缩、干燥和保存 基本原则： 以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得 尽可能多的目标产品
可将自然流出的唾液1～2mL ，置干净容器内置冰冻保存 ，或者立即
放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置4℃冰箱 保存。
18
生物材料的选择
（四）组织 1.匀浆化法（简单，回收率低）
2.蛋白沉淀法（简单，回收率低）
3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） 4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的 药物或毒物）
33
超声波细胞破碎机
• 原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器
。由超声波发生器和超声换能器两部分极成。
• 相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满 足0.1~250ml的容量需要。 • 应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用 于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消
细胞破碎相关的器械与器材
• 1)电动组织捣碎机
• 原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在 高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。 • 市售仪器多数是可调速机型，有不同口径 、头端式样的转子供选择，平头转子适于 制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制 备组织和含纤维物质的匀浆。 • 应用：一般用于动物组织，植物肉质种子， 柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高 转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械 切力很大，制备较大分子样品很少使用。 动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和 细菌需加入石英砂加强效果。
2. 通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、 化学以及生物学性质
3. 生物材料的破碎和预处理 4. 分离纯化方法的选择和探索 5. 选择相应、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备 物的均一性（即纯度）的方法 6. 产物的浓缩、干燥和保存 基本原则： 以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得 尽可能多的目标产品
可将自然流出的唾液1～2mL ，置干净容器内置冰冻保存 ，或者立即
放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置4℃冰箱 保存。
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生物材料的选择
（四）组织 1.匀浆化法（简单，回收率低）
2.蛋白沉淀法（简单，回收率低）
3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） 4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的 药物或毒物）
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超声波细胞破碎机
• 原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器
。由超声波发生器和超声换能器两部分极成。
• 相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满 足0.1~250ml的容量需要。 • 应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用 于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消
第二章 试样的采取、制备和分解
§2—1 试样的采集
1、采样数量
数量要求：
1）至少满足三次重复检测的需要；2）有需要时必 须满足备考样品的需要；3）满足样品制备的需要。 数量过多——造成浪费 数量过少——不能满足代表性要求
在满足需要的前提下，样品数量越少越好。一般根 据经验公式计算最低采样量。
§2—1 试样的采集
四、采样记录和样品保存
采样时应记录被采物料的状况和采样操作， 如物料的名称、来源、编号、数量、包装情 况、存放环境、采样部位、所采样品数量、 采样日期、采样人等。 样品采集好后应包装，贴上标签，送至制样 室，如不能及时分析，一般只能存放6个月， 特殊样品另当别论。
冷冻干燥法 样品放在冷冻干燥室内，抽真空至 1.3-6.5bar（10-50mmHg),水变成冰，2-3天后冰 全部升华。 用于水样的浓缩，植物、动物血清和其它含有易 挥发组分的干燥
NBS的果叶、牛肝、菠菜叶、松针、米粉、面粉、 河沉积物等标准物质用冷冻干燥技术，未发现易 挥发的As,Hg等损失，I有明显损失，Br在酸性溶 液中有损失。
0.2
9.03 2.26 0.80
0.3
13.55 3.39 1.20
0.5
22.6 5.65 2.00
1.0
45.2 11.3 4.00
20
40 60 80
0.83
0.42 0.25 0.177
0.069
0.018 0.006 0.003
0.14
0.035 0.013 0.006
0.21
0.053 0.019 0.0将表面刮去0.1m，深入0.3m 挖取一 个子样的物料量，每个子样的最小质量不小于5kg。最后合并 所采集的子样。
生物样品前处理、制备、分离
生物样品前处理、制备、分离及保存器材
添加副标题
中国刑警学院法医系
1. 概 述 1.1 生物样品处理制备的主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵许多生物样品在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物样品一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物样品提取制备最困难之处。 ⑷生物样品的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
样品置耐压的圆底烧瓶中，将瓶浸入干冰-乙醇混合物内，使瓶内物迅速冻结成硬块，然后连接高真空度的真空泵。
*
增加过滤推动力。常压、加压、减压。
加助滤剂。如硅藻土、活性炭、细砂等。
提高过滤时的温度。以减少溶液粘度，增大溶质的溶解度，但不适于热敏物质。 离心过滤法，利用离心力促使滤液通过过滤介质，适于分离小量组织样品。
加压和减压过滤在过滤介质的下面都必须有支持滤板，如强度较大的烧瓷滤板等。
3.2 超滤 超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。
滤渣：滤渣越厚，过滤速度越慢。
过滤液性状：过滤液中有沉淀、胶状物或其它可压缩的物质，均能造成滤膜孔堵塞，减慢过滤速度。
*
3.1.3 提高过滤速度的常用方法
选择适当的过滤介质 应考虑：①孔径大小应适于截流被分离的固体颗粒，孔径过大，则滤液不清，过小则滤速慢。②孔的数目多，孔道短且直，则滤速快，否则滤速慢。③耐酸碱，化学稳定性好。④有一定机械强度，易于回收。⑤使用寿命长，成本低。 过滤介质的材质： ①棉、麻、丝织品； 玻璃纤维、垂熔玻璃、石棉或烧瓷滤板、涤纶等； 滤纸（工业用和分析用，慢速、中速、快速），实验室里最常用。
体内药物分析
体内药物分析第二章生物样品与样品制备1.体内药分的对象：人体和动物体液、组织、器官、排泄物 2．体内药物分析的特点：样品量少，不易重新获得；样品复杂，干扰杂质多；供临床用药监护的检测分析方法要求简便、快速、准确，以便迅速为临床提供设计合理的用药方案及中毒解救措施；实验室拥有多种仪器设备，可进行多项分析工作；工作量大，测定数据的处理和阐明有时不太容易。
需相关学科参与。
3．体内药物分析样品的种类：最常用且易获得的分析样品有：血样、尿样、唾液和粪便。
特殊情况下：乳汁、泪液、脊髓液、胆汁、羊水、各种组织4．血清：血清是由血液中纤维蛋白原等的影响引起血液凝结而析出的澄清黄色液体，约为全血的30%?50%5．尿液：尿液的主要成分：水、含氮化合物、盐类；体内药物清除主要通过尿液排出，药物以其原型或代谢物及其缀合物等形式排出；尿药测定主要用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、药物代谢率的研究，并可推断患者是否按医嘱用药。
6．生物样品分析的前处理：是指测定生物样品中的药物及其代谢物时，对样品进行分离、纯化、浓集，必要时对待测组分进行衍生化，为测定创造良好的条件。
7．为何进行前处理？1）药物进入体内除原药外还有多种形式存在2）生物样品的介质组成比较复杂，尤其蛋白质严重影响分离效果，必须进行前处理3）除去介质中含有的大量内源性物质等杂质，提取出低浓度的被测药物，同时浓集药物或代谢物的浓度，使其在所用分析技术的检测范围内。
8．生物样品处理方法选择的一般原则：待测药物的理化性质；待测药物测定的目的与浓度范围。
9．去除蛋白质的方法：加与水相混溶的有机溶剂；加入中性盐；加入强酸；加入含锌盐及铜盐的沉淀剂；酶解法。
10．生物样品的分析由两步组成：样品的前处理（分离、纯化与浓集）和对提取物的仪器分析；提取法是应用最多的分离、纯化方法；提取的目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集，以供测定；提取法分为液 -液提取法和液 - 固提取法。
生物样品的制备与提取
第二章生物样品的制备§2. 1 生物分析化学分析对象的复杂性生物样品往往是一种具有高度复杂性的体系，这种复杂性表现在组成、含量、动力学范围、时空依存性等各个方面，这使得生物样品的处理有很大的难度。
因此，与经典分析化学的样品制备相比，生物分析化学的样品制备有以下特点：（1）生物样品的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。
如人类血浆蛋白质组学的阶段性研究结果表明，正常人血浆中的蛋白质至2005年时已鉴定了3020种。
有的生物分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是很困难的。
（2）许多生物分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。
分离纯化的步骤繁多，流程长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。
（3）生物分子往往有很宽的动力学浓度范围。
如不同的蛋白质在细胞内的浓度分布范围相差106～1010倍，而同一种蛋白质在不同的生理或病理状态下浓度相差有时也很大。
（4）许多生物分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物分子提取制备最困难之处。
过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活。
（5）生物分子的分离和制备几乎都是在溶液中进行的，很难准确估计和判断温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种成分的综合影响，因而实验结果常常带有很大的经验成份，实验的重复性较差，分析仪器、分析方法学、乃至个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。
制备生物分子的基本原则是：以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得尽可能多的目标产品。
通常包括以下步骤：①确定要制备的生物分子的目的和要求；②通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、化学以及生物学性质；③生物材料的破碎和预处理；④分离纯化方案的选择和探索；⑤选择相应的、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备物的均一性（即纯度）的方法；⑥产物的浓缩、干燥和保存。
采样、样品制备和预处理
平均，均匀地分出的一部分
复检样品：在对检验结果有争议或分歧时作
复检用 保留样品：需封存保留一段时间（通常一个
月），以备有争议时再作验证，但易变质 食品不作保留。
4.采样的一般方法
随机抽样
代表性取样
按照随机原则，从大批 初料中抽取部分样品。
所有初料的各个部分都 有被抽到的机会
用系统抽样法进行采样，根据 样品随空间（位置）、时间变 化的规律，采集能代表其相应 部分的组成和质量的样品。 （如分层取样、随生产过程流 动定时取样、按组批取样、定 期抽取货架商品等 ）
10）感官不合格产品不必进行理化检验，直接判为 不合格产品。
二、样品制备
（一）样品制备
按采样规程采取的样品往往数量过多，颗粒太大， 组成不均匀。
必须对样品进行粉碎、混匀、缩分——样品制备
1.样品制备的总原则
要防止易挥发性成分的逸散 、避免样品组成和 理化性质发生变化 ；
做微生物检验的样品，要按照无菌操作规程制 备
（8）超声波辅助萃取（Ultrasonic Assisted Extraction，UAE）
超声波发生器能发出高频振荡讯号，通过换 能器可以转换成高频机械振荡而传播到介质 中，超声波在介质中疏密相间地向前辐射， 使介质流动而产生数以万计的微小气泡，由 空化效应而形成超过1000个大气压的瞬间 高压，从而加速了溶剂萃取过程。
亚临界水与常温常压下的水在性质上有 较大差别，它类似于有机溶剂
水在250℃时介电常数为27，介于常温 常压下乙醇(ε=24)和甲醇(ε=33)之间
对中等极性和非极性有机物具有一定的 溶解能力
适用：处理各种固体和半固体样品中的 挥发性和半挥发性有机物
静态SBWE主要是通过控制加热的温度， 压力和时间等因素来到达最优萃取条件。
复检样品：在对检验结果有争议或分歧时作
复检用 保留样品：需封存保留一段时间（通常一个
月），以备有争议时再作验证，但易变质 食品不作保留。
4.采样的一般方法
随机抽样
代表性取样
按照随机原则，从大批 初料中抽取部分样品。
所有初料的各个部分都 有被抽到的机会
用系统抽样法进行采样，根据 样品随空间（位置）、时间变 化的规律，采集能代表其相应 部分的组成和质量的样品。 （如分层取样、随生产过程流 动定时取样、按组批取样、定 期抽取货架商品等 ）
10）感官不合格产品不必进行理化检验，直接判为 不合格产品。
二、样品制备
（一）样品制备
按采样规程采取的样品往往数量过多，颗粒太大， 组成不均匀。
必须对样品进行粉碎、混匀、缩分——样品制备
1.样品制备的总原则
要防止易挥发性成分的逸散 、避免样品组成和 理化性质发生变化 ；
做微生物检验的样品，要按照无菌操作规程制 备
（8）超声波辅助萃取（Ultrasonic Assisted Extraction，UAE）
超声波发生器能发出高频振荡讯号，通过换 能器可以转换成高频机械振荡而传播到介质 中，超声波在介质中疏密相间地向前辐射， 使介质流动而产生数以万计的微小气泡，由 空化效应而形成超过1000个大气压的瞬间 高压，从而加速了溶剂萃取过程。
亚临界水与常温常压下的水在性质上有 较大差别，它类似于有机溶剂
水在250℃时介电常数为27，介于常温 常压下乙醇(ε=24)和甲醇(ε=33)之间
对中等极性和非极性有机物具有一定的 溶解能力
适用：处理各种固体和半固体样品中的 挥发性和半挥发性有机物
静态SBWE主要是通过控制加热的温度， 压力和时间等因素来到达最优萃取条件。
第二章--微生物的纯培养和显微技术
第二节 显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及其原理 二、显微观察样品的制备 三、显微镜下的微生物
几个基本概念：
一、显微镜的种类及原理
1.普通光学显微镜（复式显微镜）
机械装置: 镜座、支架、载物台、调焦螺旋等 光学系统: 物镜、目镜、聚光镜等
使用油镜时加镜油的目的: (1)增加照明亮度 (2)增加显微镜的分辨率
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线 照射后可激发荧光；另有一些物质本身虽 不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗 体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧 光显微镜就是对这类物质进行定性和定量 研究的工具之一
105
荧 光 显 微 镜 观 察
5、 透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM)
原理：用一束电子作为它的能源，电子的波长很短，能够 检测极细微的物体，如病毒和分子。
应用：通过细胞超薄切片，观察细胞内部的详细结构如细 胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）
6、 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM)
原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在 样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子，二次电子由 探测器收集，并转变为光信号。
光学显微镜
光学理论依据
德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的 在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距 离被称为最小距离（d）
最小距离=0.5/nsin= 0.5/NA
分辨率（R) ∝ 1/d
分辨率(最小可分辨距离)=0.5λ∕ n sinθ = λ∕2NA
波长与分辨率
高压蒸汽灭菌锅
2、接种操作
接种工具： 白金or镍铬合金接种针/环
第二章蛋白质样品的制备
亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含 DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸 和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽 （aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素 (bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价 格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱 中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。
2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
⑸ 甲酮（TPCK）
通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分 不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
白。
第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。
2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
⑸ 甲酮（TPCK）
通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分 不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
白。
第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
第2章 生物样品制备技术
5、用以收集细胞，细胞器，生物大分子等
6、分离条件温和 ，但是温度需要控制
.
（二）等电点沉淀法
等电点沉淀法利用蛋白质是具不同等电点的两性电解质
，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离 的方法 。 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的 蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，因此单独使用此
价格昂贵 为小分子多肽，在双向电 泳结果中出现 抑肽素pepstatin在pH9时 不能发挥其抑制作用
1 mM EDTA ， 1 mM EGTA
抑制金属蛋白酶
除去影响双向电泳的污染物 :
污染物
样品制备过程中带来的盐、残留缓冲液和 其它带电小分子
除杂技术
1、 透 析 2、 旋 转 透 析 3 、凝胶过滤 4 、沉淀 / 重悬法 1、DNase-l RNase-A 2、 超 速 离 心 3、 超 声 TCAI 丙酮沉淀法 离心
蛋白质样品处理中经常使用的添加剂:
1、变性剂 (尿素，打开氢键、增溶)
2、去垢剂 (CHAPS ，SDS等，消除疏水基团之间的相互
作用，增强蛋白质在其pI值处的溶解性)
3、两性电解质 (减少蛋白聚合，维持其溶解性)
4、还原剂 (DDT ，二硫苏糖醇，用于打开二硫键) 5、炕基化-SH (保护其不被再氧化)
由于样品可含有数千种乃至上万种生物分子同处于一个 体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的一劳永
逸的分离程序，但很多基本手段是相同的。为了避免盲目性
，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验 。
常用的分离纯化方法和技术有: 离心法、沉淀法(包括:
盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等)、透析法、色谱法、 等电聚焦制备电泳法等。
2第二章 样品的采集、制备与保存
制样时一般用40目（0.42mm）。 4）保存 鲜样采回后马上分析，或在4℃保存；风干样同土壤。
二、农/畜产品样品采集、制备与保存
2. 籽粒样品
1)个别植株的采样 一株即一个样品，重量>25g
2)试验小区的采样（重量>500g）
作为植株采样 收获后采样 3）成批物（重量>500g） 4）制备 去杂，去不完善粒（空壳，裂纹，病变…）,晒干，装瓶
一、土壤样品的采集、制备与保存
3.土样的制备 A.样品制备的目的
1、挑出植物的根、石块等非土部分，使样品能真正代表 土壤本身的组成； 2、样品磨细后增大了土粒的表面积，有利于测定时土粒 与试剂反应迅速、完全。 3、使分析用的少量土样有较高代表性，减少称样误差； 4、使样品能长期保存，不致因微生物作用而养分变质。
A.包装化肥
• •
•
•
<10袋：逐袋采样，在3/4处采样 10~50袋：采集袋数>20% 50~100袋： >10% >100袋： >10袋，（总数的2%）
B.散装化肥（至少10点）
分为上、中、下三层，东、南、西、北各采一个点。
C.液体
5%，一个样品至少500ml，用玻璃管。
三、肥料样品的采集、制备与保存
B.制备
1）清污 一般不水洗，用湿沫布擦干净（防易溶养分渗出） 若刚施肥或打药，用0.1%-0.3%洗衣粉去垢，清水快速淋 洗后马上擦干
二、农/畜产品样品采集、制备与保存
2）烘干 剪碎 杀青（90℃烘15-30min，使酶失活） 烘干（~60℃
）
3）粉碎过筛（粉碎机）
称样重 <1g 1~2g >2g 粉碎粒径 0.25~0.1 mm 0.5 1 mm பைடு நூலகம்m
生物样品制备
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生物样品制备
•(2) 盐析法
▪ 原理：利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶
解度不同程度的降低来沉淀除去蛋白质。
▪ 在低盐浓度下，蛋白质溶解度随着盐浓度升 高
而增加－－盐溶作用；
▪ 当盐浓度不断升高时，不同蛋白质溶解度又以
不同程度下降，并先后析出沉淀－－盐析作
用。（这是蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团的静电引力造成的。由
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生物样品制备
•三 微透析技术
❖微透析(microdialysis)技术起源于２０世纪 ６０年代，目前微透析技术在用色谱分析，
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生物样品制备
•二 生物大分子的提取与蛋白质的去除 •1、生物大分子的提取 1.1 生物大分子 ▪是指在分子量在数千到数百万的大分子。 ▪主要包括多肽、蛋白质、酶、核酸、多糖等， •在细胞破碎时被充分释放出来。 ▪为了将它们制备成色谱分析的样品需要用一定 的溶剂将它们抽提出来，与细胞残渣分离。
•③蛋白质浓度的影响 • 在相同盐析的条件下，蛋白质浓度越大越 易沉淀。 • ④温度的影响 • 一般可在室温下进行。
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生物样品制备
•（3）有机溶剂沉淀法 ▪ 蛋白质的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。 降低溶液的介电常数，能增加蛋白质分子上 不 同电荷的引力，使其溶解度变小，同时还破 坏 蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。 ▪ 乙醇和丙酮是最常用的有机溶剂，丙酮的介电 常数小于乙醇，故沉淀的能力较强。
❖研磨：细菌和植物材料，加玻璃砂效果更好。
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生物样品制备
•(2)物理法
•原理：通过各种物理作用使组织细胞破碎。
❖反复冻融法：适于大部分动物细胞及细胞内的
3 生物样品与样品制备
2.3 样品的预处理技术
（五）化学衍生化（为什么要衍生化？） 1.光谱分析法 （1）紫外分光光度法 （2）荧光分析法 2.色谱分析法 （1）GC法中的化学衍生化法（GC衍生的目的是什么？） （2）HPLC法中的化学衍生化法（有几种衍生化方法？）
QUESTION TIME
天然产物化学方面 药理学方面
1.1 生物样品的种类、采集和制备
（一）血液 1. 血样的采集（采动脉血好还是静脉血好？）
2. 血样的制备（如果你取血样会选择血浆、血清还是 全血？）
1.1 生物样品的种类、采集和制备
（1）血浆的制备 （2）血清的制备 血浆(plasma)（肝素是什么?怎么用？） • 血样—— 血清(serum)（血清和血浆的区别？）
2.3 样品的预处理技术
（三）分离、纯化与浓集 1.液液萃取法 （1）溶剂的选择与纯度要求 （2）有机溶剂和水相的体积 （3）水相的pH值 2.固相萃取法 （1）SPE的原理 （2）SPE固相的选择 （3）萃取方法的选择 （4）各种萃取方法之间的比较 （5）SPE方法的优缺点
2.3 样品的预处理技术
2.2 样品制备时应考虑的问题
（一）药物的性质和存在形式 （二）待测药物的浓度范围 （三）药物测定的目的 （四）选用生物样品的类型 （五）样品预处理与分析技术的关系
2.3 样品的预处理技术
（一）经有机破坏的方法 1.湿法破坏 2.干法破坏 3.氧瓶燃烧 （二）去除蛋白质 1.溶剂溶解法 2.加入中性盐 3.加入强酸 4.加入锌盐和铜盐的沉淀剂 5.超滤法 6.酶解法 7.加热法
（3）萃取方法的选择
亲脂性
解离性
酸碱性
亲脂、酸性或中性——硅胶、大孔树脂等 亲脂、碱性——大孔树脂 亲水、可解离——离子交换树脂 亲水、不解离——沉淀蛋白直接进样
生物样品的制备
常可以避免水解酶的破坏。
例：胰岛素的溶剂提取 胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但组织样品中共
存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8％乙
醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0，进行提取，因为： ①乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活 ②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++ ③pH 2.5～3.0下糜蛋白酶活性低
分离的方法。 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的 蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，因此单独使用此 法效果不理想，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其它沉淀
剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。
此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用 于沉淀目标蛋白。
三、生物样品的膜分离
透析 留，盐和小分子扩散通过 • 截留分子量指标 超滤 下小分子溶剂和溶质透过一 定孔径的膜（乙酸纤维或硝
2 、 pH 值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与 pH 值 密切相关，一般提取溶剂的 pH 应在蛋白质和酶的稳定范 围内（pH=6～8 ），通常选择在偏离等电点的 pH 条件。 例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用稀酸提取。
3 、温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和
酶，提取时一般在0～5℃的低温操作。
体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，离心分离取上清液；
5、加入RNaseA 37℃温育30分钟分解去除RNA； 6、温育后加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，离 心取上清液中加入无水乙醇，混合静置后得白色絮状沉淀； 7、取絮状沉淀并在75%乙醇中清洗后风干，溶于TE溶液 中4 ℃保存或者-80 ℃长期保存；
防止肽链上的巯基的氧化。
二、有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的
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斯维得贝格单位（Svedberg unit）:10-13S 沉降速度：
在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。
K系数： 用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。
3
离心技术的分类
粗制品提取
1）差速离心法---不同粒子在离心力场沉降的差别 2）速率区带离心法---粒子在梯度液中沉降系数不同 3）等密度离心法---粒子颗粒密度不同
的目的。
2.7.1 固相萃取的模式及原理
固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其
主要分离模式与液相色谱相同，可分为正相、
反相、离子交换等几种类型。固相萃取所用的 吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同，只是 在粒度上有所区别。 吸附剂： 正向固相萃取 ---极性 反相固相萃取---非极性或极性较弱
2.7.2 固相萃取常用的吸附剂
剧烈程度
应用对象
2.5 生物大分子的提取
2.5.1 水溶液提取 盐浓度（离子强度） pH 影响 因素 温度 防止降解作用 搅拌与氧化
2.5.2 有机溶剂提取 对于一些难溶的蛋白质和酶，常用不同比例的有机 溶剂提取。 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。 有些蛋白质和酶既能溶于稀酸、稀碱，又能溶于含
中性盐沉淀 （盐析法）
盐析的操作方法—固体硫酸铵加入法
蛋白质的浓度
盐析的影响因素
pH 温度
基本原理：降低水溶液的介电系数 2
有机溶剂 沉淀法
有机溶剂的选择和浓度的计算—乙醇、甲醇、丙酮 V=V0(S2-S1)/(100-S2)
温度 样品浓度 pH 离子强度
影响因素
热变性 3
选择性变性 沉淀法
有机溶剂变性 选择性酸碱变性
激光捕获显微切割技术（LCM）是在显微状态或显 微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、 细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、 分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的 显微分离收集技术。
2.3.1 LCM的特点
（1）LCM可以从任何组织中快速、精确地分离出纯的 特异细胞及细胞群。
4
ห้องสมุดไป่ตู้
梯度溶液的制备
理想梯度材料特点：
完全惰性，易分离
黏度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小
无腐蚀作用 易纯化，成本低 浓度便于测定 物理性质、热力学性质已知
梯度材料的应用
介质 DNA RNA 核蛋白 膜 细胞器 细胞 病毒
蔗糖
聚蔗糖 氯化铯 Percoll 碘化物
-+++ +
2.4 细胞的破碎
各种细胞破碎方法的应用范围
细胞破碎方法
机械法 研磨法 组织捣碎法（匀浆法） 物理法 反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法 化学与生物化学方法 自溶法 溶胀法 酶解法 温和 剧烈 温和 剧烈 剧烈 温和 温和 温和 温和 固体组织细胞、微生物细胞 固体组织细胞、微生物细胞 细菌细胞、组织培养细胞 悬浮细胞 微生物细胞、含有细胞壁的细胞 细菌细胞或病毒 组织及各种细胞 血细胞、组织培养细胞 植物细胞、细菌细胞、真菌细胞
非目的物变性沉淀
4
等电点沉淀法：利用具有不同等电点的良性电解质在达到中 性时溶解度最低，易发生沉淀的性质，从而实现分离的方法
5
有机聚合物沉淀法：早起应用于提纯免疫球蛋白 及沉淀一些细菌和病毒。近年来应用于核酸和酶
的纯化。
PEG沉淀解释： 聚合物与大分子发生共沉淀作用
亲水性强，生物大分子脱水
以氢键形成复合物，在重力作用下沉淀 空间位置排斥排斥
2.6.3 透析
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的 分离纯化技术之一，在生物大分子制备过程中，
除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质和浓
缩样品等都要用到透析的技术。只需要使用专用 的半透膜即可完成。
2.6.4 超滤
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力 下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜， 并使大分子溶质不能通过，留在膜一边，从而使大 分子物质得到了部分的纯化。 微孔过滤、超滤、反渗透
不动，载物台移动，激光逐点打到样品区
2. Laser Micro-Dissection 正置显微镜，紫外 激光束自动扫描切割样品边缘
LCM切割原理图
LCM实例与应用广泛应用于各种肿瘤研究
A：正常细胞;
B：腺瘤;
C：癌组织。 激光显微捕获大肠癌细胞
1：H&E染色(20倍放大);
2：LCM前Hematoxylin染色; 3：LCM后Hematoxylin染色; 4：切割下的上皮细胞。
存性
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
生物分析化学的样品制备 特点：
（1）生物样品的组成极其复杂
（2）许多生物分子的含量极微 （3）具有很宽的 动力学浓度范围 （4）提取制备过程中极易失活 （5）实验结果易受操作的影响
制备生物分子的基本原则：
（1）确定要制备的生物分子的目的和要求 （2）掌握目标产物的物理、化学及生物学性质
（4）各种物理性质—分子大小、穿膜能力、带点 情况、离心沉降表现
（5）化学性质—对各种化学试剂的稳定性
（6）对其他生物分子的亲和力
（7）在细胞内的定位等
分离纯化基本原理：
利用混合物中几个组分分配系数的差异 物理力场
2.2 生物材料的选择
生物材料来源于动物、植物和微生物及其代 谢产物，应尽可能选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的生物材料。
固相微萃取（SPME）是在固相萃取基础上 发展起来的一种新的萃取分离技术，具有操作时 间短、样品量小、无需萃取溶剂、适于分析挥发 性与非挥发性物质、重现性好等优点。
2.7.3 固相萃取的装置及操作程序
（1）活化吸附剂 操作 程序 （2）上样 （3）洗涤和洗脱
2.7.4 血清、血浆中高丰度蛋白的去除
蛋白质含量60-80mg/ml 10000种 目前，从血清中除去高丰度蛋白质的方法主要有亲和 柱色谱法和化学试剂除去法。
高丰度蛋白清除柱---混合床免疫亲和柱
2.7.5 固相微萃取
植物材料： 季节性、地理位置、生长环境
动物材料：年龄、性别、营养状况、遗传因 素、生理状态 微生物：菌种代数、培养基成分之间的差异
材料选定后加工处理： 动物组织：去结缔组织、脂肪、破碎细胞
植物：去壳、除脂
微生物：菌体与发酵液分开
生物材料-----冰冻保存
2.3 激光捕获显微切割技术
2.6.5 冰冻干燥
冰冻干燥是指将生物大分子的水溶液冰冻，然 后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉的过
程。 特点：
样品不起泡、不沸腾 不黏壁、易取出 易溶于水
注意事项：
样品溶液 样品溶液的容器 溶液冰冻 冻干
2.7 固相萃取与固相微萃取
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将 液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基 体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱 或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物
固相萃取实质上是一种液相分离，故原则上讲，可
作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。固相萃
取中的吸附剂的选择主要根据目标化合物的性质和样品 基体性质。目标化合物的极性与吸附剂的极性非常相似 时，可以得到目标化合物的最佳吸附。
选择分离模式和吸附剂：
溶解度 是否可能离子化 是否形成共价键 吸附点竞争度
1
离心力与相对离心力
离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任
务物体都受到一个向外的离心力进行的。 相对离心力（ relative centrifugal force，RCF）： RCF=F离心力/F重力
2
沉降系数、沉降速度、K系数
沉降系数S：
颗粒在单位离心力作用下的陈啊静速度称该颗粒的沉降系数。
++ +
+
+ +++
++
+ + +++
++
+ ++
+++
+
+++ ++ ++
++
++ ++ + ++
2.6.2 沉淀法
沉淀是溶质从溶液中析出的过程。 操作简便、成本低 原理：根据不同溶质在溶剂中溶解度不同从而 使其分离 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或 留在液相。
中性盐的选择—硫酸铵 1
第二章 生物样品的制备
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
2.2 生物材料的选择
目 录
2.3 激光捕获显微切割技术
2.4 细胞的破碎
2.5 生物大分子提取 2.6 生物大分子的分离与纯化 2.7 固相萃取与固相微萃取
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
分析对象： 生物大分子----蛋白质、多肽、核酸、多糖 生物小分子----具有生物活性的小分子化合 物（内源性小分子、外源性小分子） 复杂性：组成、含量、动力学范围、时空依
有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采
用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼 有去除杂质、提高纯化效果的作用。
2.6 生物大分子的分离与纯化
2.6.1 离心技术 （centrifuge technique）
离心技术是根据颗粒在作迅速圆周运动时受到一
个外向的离心力的行为为发展起来的一种分离技术。 具有比较温和、分离样品量大等特点。
（2）利用显微切割技术实在组织细胞或染色体的原位
取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究对象的历 史背景明确。 （3）显微切割技术可以保证所取材料在一定层次上的 同质性。
在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。
K系数： 用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。
3
离心技术的分类
粗制品提取
1）差速离心法---不同粒子在离心力场沉降的差别 2）速率区带离心法---粒子在梯度液中沉降系数不同 3）等密度离心法---粒子颗粒密度不同
的目的。
2.7.1 固相萃取的模式及原理
固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其
主要分离模式与液相色谱相同，可分为正相、
反相、离子交换等几种类型。固相萃取所用的 吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同，只是 在粒度上有所区别。 吸附剂： 正向固相萃取 ---极性 反相固相萃取---非极性或极性较弱
2.7.2 固相萃取常用的吸附剂
剧烈程度
应用对象
2.5 生物大分子的提取
2.5.1 水溶液提取 盐浓度（离子强度） pH 影响 因素 温度 防止降解作用 搅拌与氧化
2.5.2 有机溶剂提取 对于一些难溶的蛋白质和酶，常用不同比例的有机 溶剂提取。 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。 有些蛋白质和酶既能溶于稀酸、稀碱，又能溶于含
中性盐沉淀 （盐析法）
盐析的操作方法—固体硫酸铵加入法
蛋白质的浓度
盐析的影响因素
pH 温度
基本原理：降低水溶液的介电系数 2
有机溶剂 沉淀法
有机溶剂的选择和浓度的计算—乙醇、甲醇、丙酮 V=V0(S2-S1)/(100-S2)
温度 样品浓度 pH 离子强度
影响因素
热变性 3
选择性变性 沉淀法
有机溶剂变性 选择性酸碱变性
激光捕获显微切割技术（LCM）是在显微状态或显 微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、 细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、 分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的 显微分离收集技术。
2.3.1 LCM的特点
（1）LCM可以从任何组织中快速、精确地分离出纯的 特异细胞及细胞群。
4
ห้องสมุดไป่ตู้
梯度溶液的制备
理想梯度材料特点：
完全惰性，易分离
黏度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小
无腐蚀作用 易纯化，成本低 浓度便于测定 物理性质、热力学性质已知
梯度材料的应用
介质 DNA RNA 核蛋白 膜 细胞器 细胞 病毒
蔗糖
聚蔗糖 氯化铯 Percoll 碘化物
-+++ +
2.4 细胞的破碎
各种细胞破碎方法的应用范围
细胞破碎方法
机械法 研磨法 组织捣碎法（匀浆法） 物理法 反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法 化学与生物化学方法 自溶法 溶胀法 酶解法 温和 剧烈 温和 剧烈 剧烈 温和 温和 温和 温和 固体组织细胞、微生物细胞 固体组织细胞、微生物细胞 细菌细胞、组织培养细胞 悬浮细胞 微生物细胞、含有细胞壁的细胞 细菌细胞或病毒 组织及各种细胞 血细胞、组织培养细胞 植物细胞、细菌细胞、真菌细胞
非目的物变性沉淀
4
等电点沉淀法：利用具有不同等电点的良性电解质在达到中 性时溶解度最低，易发生沉淀的性质，从而实现分离的方法
5
有机聚合物沉淀法：早起应用于提纯免疫球蛋白 及沉淀一些细菌和病毒。近年来应用于核酸和酶
的纯化。
PEG沉淀解释： 聚合物与大分子发生共沉淀作用
亲水性强，生物大分子脱水
以氢键形成复合物，在重力作用下沉淀 空间位置排斥排斥
2.6.3 透析
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的 分离纯化技术之一，在生物大分子制备过程中，
除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质和浓
缩样品等都要用到透析的技术。只需要使用专用 的半透膜即可完成。
2.6.4 超滤
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力 下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜， 并使大分子溶质不能通过，留在膜一边，从而使大 分子物质得到了部分的纯化。 微孔过滤、超滤、反渗透
不动，载物台移动，激光逐点打到样品区
2. Laser Micro-Dissection 正置显微镜，紫外 激光束自动扫描切割样品边缘
LCM切割原理图
LCM实例与应用广泛应用于各种肿瘤研究
A：正常细胞;
B：腺瘤;
C：癌组织。 激光显微捕获大肠癌细胞
1：H&E染色(20倍放大);
2：LCM前Hematoxylin染色; 3：LCM后Hematoxylin染色; 4：切割下的上皮细胞。
存性
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
生物分析化学的样品制备 特点：
（1）生物样品的组成极其复杂
（2）许多生物分子的含量极微 （3）具有很宽的 动力学浓度范围 （4）提取制备过程中极易失活 （5）实验结果易受操作的影响
制备生物分子的基本原则：
（1）确定要制备的生物分子的目的和要求 （2）掌握目标产物的物理、化学及生物学性质
（4）各种物理性质—分子大小、穿膜能力、带点 情况、离心沉降表现
（5）化学性质—对各种化学试剂的稳定性
（6）对其他生物分子的亲和力
（7）在细胞内的定位等
分离纯化基本原理：
利用混合物中几个组分分配系数的差异 物理力场
2.2 生物材料的选择
生物材料来源于动物、植物和微生物及其代 谢产物，应尽可能选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的生物材料。
固相微萃取（SPME）是在固相萃取基础上 发展起来的一种新的萃取分离技术，具有操作时 间短、样品量小、无需萃取溶剂、适于分析挥发 性与非挥发性物质、重现性好等优点。
2.7.3 固相萃取的装置及操作程序
（1）活化吸附剂 操作 程序 （2）上样 （3）洗涤和洗脱
2.7.4 血清、血浆中高丰度蛋白的去除
蛋白质含量60-80mg/ml 10000种 目前，从血清中除去高丰度蛋白质的方法主要有亲和 柱色谱法和化学试剂除去法。
高丰度蛋白清除柱---混合床免疫亲和柱
2.7.5 固相微萃取
植物材料： 季节性、地理位置、生长环境
动物材料：年龄、性别、营养状况、遗传因 素、生理状态 微生物：菌种代数、培养基成分之间的差异
材料选定后加工处理： 动物组织：去结缔组织、脂肪、破碎细胞
植物：去壳、除脂
微生物：菌体与发酵液分开
生物材料-----冰冻保存
2.3 激光捕获显微切割技术
2.6.5 冰冻干燥
冰冻干燥是指将生物大分子的水溶液冰冻，然 后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉的过
程。 特点：
样品不起泡、不沸腾 不黏壁、易取出 易溶于水
注意事项：
样品溶液 样品溶液的容器 溶液冰冻 冻干
2.7 固相萃取与固相微萃取
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将 液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基 体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱 或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物
固相萃取实质上是一种液相分离，故原则上讲，可
作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。固相萃
取中的吸附剂的选择主要根据目标化合物的性质和样品 基体性质。目标化合物的极性与吸附剂的极性非常相似 时，可以得到目标化合物的最佳吸附。
选择分离模式和吸附剂：
溶解度 是否可能离子化 是否形成共价键 吸附点竞争度
1
离心力与相对离心力
离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任
务物体都受到一个向外的离心力进行的。 相对离心力（ relative centrifugal force，RCF）： RCF=F离心力/F重力
2
沉降系数、沉降速度、K系数
沉降系数S：
颗粒在单位离心力作用下的陈啊静速度称该颗粒的沉降系数。
++ +
+
+ +++
++
+ + +++
++
+ ++
+++
+
+++ ++ ++
++
++ ++ + ++
2.6.2 沉淀法
沉淀是溶质从溶液中析出的过程。 操作简便、成本低 原理：根据不同溶质在溶剂中溶解度不同从而 使其分离 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或 留在液相。
中性盐的选择—硫酸铵 1
第二章 生物样品的制备
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
2.2 生物材料的选择
目 录
2.3 激光捕获显微切割技术
2.4 细胞的破碎
2.5 生物大分子提取 2.6 生物大分子的分离与纯化 2.7 固相萃取与固相微萃取
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
分析对象： 生物大分子----蛋白质、多肽、核酸、多糖 生物小分子----具有生物活性的小分子化合 物（内源性小分子、外源性小分子） 复杂性：组成、含量、动力学范围、时空依
有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采
用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼 有去除杂质、提高纯化效果的作用。
2.6 生物大分子的分离与纯化
2.6.1 离心技术 （centrifuge technique）
离心技术是根据颗粒在作迅速圆周运动时受到一
个外向的离心力的行为为发展起来的一种分离技术。 具有比较温和、分离样品量大等特点。
（2）利用显微切割技术实在组织细胞或染色体的原位
取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究对象的历 史背景明确。 （3）显微切割技术可以保证所取材料在一定层次上的 同质性。