第二章 生物样品的制备
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固相微萃取（SPME）是在固相萃取基础上 发展起来的一种新的萃取分离技术，具有操作时 间短、样品量小、无需萃取溶剂、适于分析挥发 性与非挥发性物质、重现性好等优点。
4
梯度溶液的制备
理想梯度材料特点：
完全惰性，易分离
黏度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小
无腐蚀作用 易纯化，成本低 浓度便于测定 物理性质、热力学性质已知
梯度材料的应用
介质 DNA RNA 核蛋白 膜 细胞器 细胞 病毒
蔗糖
聚蔗糖 氯化铯 Percoll 碘化物
-+++ +
的目的。
2.7.1 固相萃取的模式及原理
固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其
主要分离模式与液相色谱相同，可分为正相、
反相、离子交换等几种类型。固相萃取所用的 吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同，只是 在粒度上有所区别。 吸附剂： 正向固相萃取 ---极性 反相固相萃取---非极性或极性较弱
2.7.2 固相萃取常用的吸附剂
剧烈程度
应用对象
2.5 生物大分子的提取
2.5.1 水溶液提取 盐浓度（离子强度） pH 影响 因素 温度 防止降解作用 搅拌与氧化
2.5.2 有机溶剂提取 对于一些难溶的蛋白质和酶，常用不同比例的有机 溶剂提取。 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。 有些蛋白质和酶既能溶于稀酸、稀碱，又能溶于含
（3）生物材料的破碎和预处理
（4）分离纯化方案的选择和探索 （5）选择相应、可靠的分析技术 （6）产物的浓缩、干燥和保存
样品处理需要考虑的生物分子的物理、化学 及生物学性质：
（1）在水和各种有机溶剂中的溶解度
（2）在不同温度、pH的溶液和各种缓冲液中的 稳定性
（3）固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性
2.7.3 固相萃取的装置及操作程序
（1）活化吸附剂 操作 程序 （2）上样 （3）洗涤和洗脱
2.7.4 血清、血浆中高丰度蛋白的去除
蛋白质含量60-80mg/ml 10000种 目前，从血清中除去高丰度蛋白质的方法主要有亲和 柱色谱法和化学试剂除去法。
高丰度蛋白清除柱---混合床免疫亲和柱
2.7.5 固相微萃取
植物材料： 季节性、地理位置、生长环境
动物材料：年龄、性别、营养状况、遗传因 素、生理状态 微生物：菌种代数、培养基成分之间的差异
材料选定后加工处理： 动物组织：去结缔组织、脂肪、破碎细胞
植物：去壳、除脂
微生物：菌体与发酵液分开
生物材料-----冰冻保存
2.3 激光捕获显微切割技术
非目的物变性沉淀
4
等电点沉淀法：利用具有不同等电点的良性电解质在达到中 性时溶解度最低，易发生沉淀的性质，从而实现分离的方法
5
有机聚合物沉淀法：早起应用于提纯免疫球蛋白 及沉淀一些细菌和病毒。近年来应用于核酸和酶
的纯化。
PEG沉淀解释： 聚合物与大分子发生共沉淀作用
亲水性强，生物大分子脱水
以氢键形成复合物，在重力作用下沉淀 空间位置排斥排斥
百度文库
2.4 细胞的破碎
各种细胞破碎方法的应用范围
细胞破碎方法
机械法 研磨法 组织捣碎法（匀浆法） 物理法 反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法 化学与生物化学方法 自溶法 溶胀法 酶解法 温和 剧烈 温和 剧烈 剧烈 温和 温和 温和 温和 固体组织细胞、微生物细胞 固体组织细胞、微生物细胞 细菌细胞、组织培养细胞 悬浮细胞 微生物细胞、含有细胞壁的细胞 细菌细胞或病毒 组织及各种细胞 血细胞、组织培养细胞 植物细胞、细菌细胞、真菌细胞
2.6.3 透析
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的 分离纯化技术之一，在生物大分子制备过程中，
除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质和浓
缩样品等都要用到透析的技术。只需要使用专用 的半透膜即可完成。
2.6.4 超滤
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力 下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜， 并使大分子溶质不能通过，留在膜一边，从而使大 分子物质得到了部分的纯化。 微孔过滤、超滤、反渗透
中性盐沉淀 （盐析法）
盐析的操作方法—固体硫酸铵加入法
蛋白质的浓度
盐析的影响因素
pH 温度
基本原理：降低水溶液的介电系数 2
有机溶剂 沉淀法
有机溶剂的选择和浓度的计算—乙醇、甲醇、丙酮 V=V0(S2-S1)/(100-S2)
温度 样品浓度 pH 离子强度
影响因素
热变性 3
选择性变性 沉淀法
有机溶剂变性 选择性酸碱变性
（2）利用显微切割技术实在组织细胞或染色体的原位
取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究对象的历 史背景明确。 （3）显微切割技术可以保证所取材料在一定层次上的 同质性。
（4）LCM可以与多种分子生物学、免疫学及病理
学技术结合使用。
2.3.2 LCM的仪器与操作
1. PixCell IIe LCM System 倒置显微镜，光束
有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采
用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼 有去除杂质、提高纯化效果的作用。
2.6 生物大分子的分离与纯化
2.6.1 离心技术 （centrifuge technique）
离心技术是根据颗粒在作迅速圆周运动时受到一
个外向的离心力的行为为发展起来的一种分离技术。 具有比较温和、分离样品量大等特点。
（4）各种物理性质—分子大小、穿膜能力、带点 情况、离心沉降表现
（5）化学性质—对各种化学试剂的稳定性
（6）对其他生物分子的亲和力
（7）在细胞内的定位等
分离纯化基本原理：
利用混合物中几个组分分配系数的差异 物理力场
2.2 生物材料的选择
生物材料来源于动物、植物和微生物及其代 谢产物，应尽可能选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的生物材料。
存性
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
生物分析化学的样品制备 特点：
（1）生物样品的组成极其复杂
（2）许多生物分子的含量极微 （3）具有很宽的 动力学浓度范围 （4）提取制备过程中极易失活 （5）实验结果易受操作的影响
制备生物分子的基本原则：
（1）确定要制备的生物分子的目的和要求 （2）掌握目标产物的物理、化学及生物学性质
固相萃取实质上是一种液相分离，故原则上讲，可
作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。固相萃
取中的吸附剂的选择主要根据目标化合物的性质和样品 基体性质。目标化合物的极性与吸附剂的极性非常相似 时，可以得到目标化合物的最佳吸附。
选择分离模式和吸附剂：
溶解度 是否可能离子化 是否形成共价键 吸附点竞争度
第二章 生物样品的制备
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
2.2 生物材料的选择
目 录
2.3 激光捕获显微切割技术
2.4 细胞的破碎
2.5 生物大分子提取 2.6 生物大分子的分离与纯化 2.7 固相萃取与固相微萃取
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
分析对象： 生物大分子----蛋白质、多肽、核酸、多糖 生物小分子----具有生物活性的小分子化合 物（内源性小分子、外源性小分子） 复杂性：组成、含量、动力学范围、时空依
斯维得贝格单位（Svedberg unit）:10-13S 沉降速度：
在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。
K系数： 用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。
3
离心技术的分类
粗制品提取
1）差速离心法---不同粒子在离心力场沉降的差别 2）速率区带离心法---粒子在梯度液中沉降系数不同 3）等密度离心法---粒子颗粒密度不同
++ +
+
+ +++
++
+ + +++
++
+ ++
+++
+
+++ ++ ++
++
++ ++ + ++
2.6.2 沉淀法
沉淀是溶质从溶液中析出的过程。 操作简便、成本低 原理：根据不同溶质在溶剂中溶解度不同从而 使其分离 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或 留在液相。
中性盐的选择—硫酸铵 1
1
离心力与相对离心力
离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任
务物体都受到一个向外的离心力进行的。 相对离心力（ relative centrifugal force，RCF）： RCF=F离心力/F重力
2
沉降系数、沉降速度、K系数
沉降系数S：
颗粒在单位离心力作用下的陈啊静速度称该颗粒的沉降系数。
2.6.5 冰冻干燥
冰冻干燥是指将生物大分子的水溶液冰冻，然 后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉的过
程。 特点：
样品不起泡、不沸腾 不黏壁、易取出 易溶于水
注意事项：
样品溶液 样品溶液的容器 溶液冰冻 冻干
2.7 固相萃取与固相微萃取
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将 液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基 体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱 或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物
激光捕获显微切割技术（LCM）是在显微状态或显 微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、 细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、 分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的 显微分离收集技术。
2.3.1 LCM的特点
（1）LCM可以从任何组织中快速、精确地分离出纯的 特异细胞及细胞群。
不动，载物台移动，激光逐点打到样品区
2. Laser Micro-Dissection 正置显微镜，紫外 激光束自动扫描切割样品边缘
LCM切割原理图
LCM实例与应用广泛应用于各种肿瘤研究
A：正常细胞;
B：腺瘤;
C：癌组织。 激光显微捕获大肠癌细胞
1：H&E染色(20倍放大);
2：LCM前Hematoxylin染色; 3：LCM后Hematoxylin染色; 4：切割下的上皮细胞。
4
梯度溶液的制备
理想梯度材料特点：
完全惰性，易分离
黏度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小
无腐蚀作用 易纯化，成本低 浓度便于测定 物理性质、热力学性质已知
梯度材料的应用
介质 DNA RNA 核蛋白 膜 细胞器 细胞 病毒
蔗糖
聚蔗糖 氯化铯 Percoll 碘化物
-+++ +
的目的。
2.7.1 固相萃取的模式及原理
固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其
主要分离模式与液相色谱相同，可分为正相、
反相、离子交换等几种类型。固相萃取所用的 吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同，只是 在粒度上有所区别。 吸附剂： 正向固相萃取 ---极性 反相固相萃取---非极性或极性较弱
2.7.2 固相萃取常用的吸附剂
剧烈程度
应用对象
2.5 生物大分子的提取
2.5.1 水溶液提取 盐浓度（离子强度） pH 影响 因素 温度 防止降解作用 搅拌与氧化
2.5.2 有机溶剂提取 对于一些难溶的蛋白质和酶，常用不同比例的有机 溶剂提取。 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。 有些蛋白质和酶既能溶于稀酸、稀碱，又能溶于含
（3）生物材料的破碎和预处理
（4）分离纯化方案的选择和探索 （5）选择相应、可靠的分析技术 （6）产物的浓缩、干燥和保存
样品处理需要考虑的生物分子的物理、化学 及生物学性质：
（1）在水和各种有机溶剂中的溶解度
（2）在不同温度、pH的溶液和各种缓冲液中的 稳定性
（3）固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性
2.7.3 固相萃取的装置及操作程序
（1）活化吸附剂 操作 程序 （2）上样 （3）洗涤和洗脱
2.7.4 血清、血浆中高丰度蛋白的去除
蛋白质含量60-80mg/ml 10000种 目前，从血清中除去高丰度蛋白质的方法主要有亲和 柱色谱法和化学试剂除去法。
高丰度蛋白清除柱---混合床免疫亲和柱
2.7.5 固相微萃取
植物材料： 季节性、地理位置、生长环境
动物材料：年龄、性别、营养状况、遗传因 素、生理状态 微生物：菌种代数、培养基成分之间的差异
材料选定后加工处理： 动物组织：去结缔组织、脂肪、破碎细胞
植物：去壳、除脂
微生物：菌体与发酵液分开
生物材料-----冰冻保存
2.3 激光捕获显微切割技术
非目的物变性沉淀
4
等电点沉淀法：利用具有不同等电点的良性电解质在达到中 性时溶解度最低，易发生沉淀的性质，从而实现分离的方法
5
有机聚合物沉淀法：早起应用于提纯免疫球蛋白 及沉淀一些细菌和病毒。近年来应用于核酸和酶
的纯化。
PEG沉淀解释： 聚合物与大分子发生共沉淀作用
亲水性强，生物大分子脱水
以氢键形成复合物，在重力作用下沉淀 空间位置排斥排斥
百度文库
2.4 细胞的破碎
各种细胞破碎方法的应用范围
细胞破碎方法
机械法 研磨法 组织捣碎法（匀浆法） 物理法 反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法 化学与生物化学方法 自溶法 溶胀法 酶解法 温和 剧烈 温和 剧烈 剧烈 温和 温和 温和 温和 固体组织细胞、微生物细胞 固体组织细胞、微生物细胞 细菌细胞、组织培养细胞 悬浮细胞 微生物细胞、含有细胞壁的细胞 细菌细胞或病毒 组织及各种细胞 血细胞、组织培养细胞 植物细胞、细菌细胞、真菌细胞
2.6.3 透析
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的 分离纯化技术之一，在生物大分子制备过程中，
除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质和浓
缩样品等都要用到透析的技术。只需要使用专用 的半透膜即可完成。
2.6.4 超滤
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力 下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜， 并使大分子溶质不能通过，留在膜一边，从而使大 分子物质得到了部分的纯化。 微孔过滤、超滤、反渗透
中性盐沉淀 （盐析法）
盐析的操作方法—固体硫酸铵加入法
蛋白质的浓度
盐析的影响因素
pH 温度
基本原理：降低水溶液的介电系数 2
有机溶剂 沉淀法
有机溶剂的选择和浓度的计算—乙醇、甲醇、丙酮 V=V0(S2-S1)/(100-S2)
温度 样品浓度 pH 离子强度
影响因素
热变性 3
选择性变性 沉淀法
有机溶剂变性 选择性酸碱变性
（2）利用显微切割技术实在组织细胞或染色体的原位
取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究对象的历 史背景明确。 （3）显微切割技术可以保证所取材料在一定层次上的 同质性。
（4）LCM可以与多种分子生物学、免疫学及病理
学技术结合使用。
2.3.2 LCM的仪器与操作
1. PixCell IIe LCM System 倒置显微镜，光束
有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采
用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼 有去除杂质、提高纯化效果的作用。
2.6 生物大分子的分离与纯化
2.6.1 离心技术 （centrifuge technique）
离心技术是根据颗粒在作迅速圆周运动时受到一
个外向的离心力的行为为发展起来的一种分离技术。 具有比较温和、分离样品量大等特点。
（4）各种物理性质—分子大小、穿膜能力、带点 情况、离心沉降表现
（5）化学性质—对各种化学试剂的稳定性
（6）对其他生物分子的亲和力
（7）在细胞内的定位等
分离纯化基本原理：
利用混合物中几个组分分配系数的差异 物理力场
2.2 生物材料的选择
生物材料来源于动物、植物和微生物及其代 谢产物，应尽可能选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的生物材料。
存性
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
生物分析化学的样品制备 特点：
（1）生物样品的组成极其复杂
（2）许多生物分子的含量极微 （3）具有很宽的 动力学浓度范围 （4）提取制备过程中极易失活 （5）实验结果易受操作的影响
制备生物分子的基本原则：
（1）确定要制备的生物分子的目的和要求 （2）掌握目标产物的物理、化学及生物学性质
固相萃取实质上是一种液相分离，故原则上讲，可
作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。固相萃
取中的吸附剂的选择主要根据目标化合物的性质和样品 基体性质。目标化合物的极性与吸附剂的极性非常相似 时，可以得到目标化合物的最佳吸附。
选择分离模式和吸附剂：
溶解度 是否可能离子化 是否形成共价键 吸附点竞争度
第二章 生物样品的制备
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
2.2 生物材料的选择
目 录
2.3 激光捕获显微切割技术
2.4 细胞的破碎
2.5 生物大分子提取 2.6 生物大分子的分离与纯化 2.7 固相萃取与固相微萃取
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
分析对象： 生物大分子----蛋白质、多肽、核酸、多糖 生物小分子----具有生物活性的小分子化合 物（内源性小分子、外源性小分子） 复杂性：组成、含量、动力学范围、时空依
斯维得贝格单位（Svedberg unit）:10-13S 沉降速度：
在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。
K系数： 用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。
3
离心技术的分类
粗制品提取
1）差速离心法---不同粒子在离心力场沉降的差别 2）速率区带离心法---粒子在梯度液中沉降系数不同 3）等密度离心法---粒子颗粒密度不同
++ +
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2.6.2 沉淀法
沉淀是溶质从溶液中析出的过程。 操作简便、成本低 原理：根据不同溶质在溶剂中溶解度不同从而 使其分离 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或 留在液相。
中性盐的选择—硫酸铵 1
1
离心力与相对离心力
离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任
务物体都受到一个向外的离心力进行的。 相对离心力（ relative centrifugal force，RCF）： RCF=F离心力/F重力
2
沉降系数、沉降速度、K系数
沉降系数S：
颗粒在单位离心力作用下的陈啊静速度称该颗粒的沉降系数。
2.6.5 冰冻干燥
冰冻干燥是指将生物大分子的水溶液冰冻，然 后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉的过
程。 特点：
样品不起泡、不沸腾 不黏壁、易取出 易溶于水
注意事项：
样品溶液 样品溶液的容器 溶液冰冻 冻干
2.7 固相萃取与固相微萃取
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将 液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基 体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱 或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物
激光捕获显微切割技术（LCM）是在显微状态或显 微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、 细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、 分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的 显微分离收集技术。
2.3.1 LCM的特点
（1）LCM可以从任何组织中快速、精确地分离出纯的 特异细胞及细胞群。
不动，载物台移动，激光逐点打到样品区
2. Laser Micro-Dissection 正置显微镜，紫外 激光束自动扫描切割样品边缘
LCM切割原理图
LCM实例与应用广泛应用于各种肿瘤研究
A：正常细胞;
B：腺瘤;
C：癌组织。 激光显微捕获大肠癌细胞
1：H&E染色(20倍放大);
2：LCM前Hematoxylin染色; 3：LCM后Hematoxylin染色; 4：切割下的上皮细胞。