体外试验与生物新技术在毒理学中的应用
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依据体外试验在决策过程中所起 的作用将其分为3类：
➢筛选试验：提供决策过程的最初的资料。 ➢附加试验：为协作部门或法律部门的最终决
策过程提供资料，但仅有它是不够充分的。
➢替代试验：在大量实验的基础上，使体外毒 性试验能替代整体动物试验。
体外试验的基本原理
➢体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效 应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏感 性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用 的结果。
一、PCR技术
PCR(polymerase chain reaction)技术 称聚合酶链式反应技术，又称无细胞克隆 技术(“free Bacteria”cloning technique)， 是一种对特定的DNA片段在体外进行快速 扩增的新方法。
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二、mRNA定性与定量测定
➢许多外源化学物和内源性活性物质皆可引 起基因表达的改变，主要是基因转录水平 的变化。对mRNA的测定在此类研究中尤 为重要。
三、细胞培养在毒理学中的应用
（一）细胞类型的选择 ➢选择迅速生长的细胞株，用以观察受试物对整
体细胞的一般毒作用； ➢机理研究多不用细胞系。
（二）代谢活化
➢培养细胞对需代谢活化的化学物不敏感； ➢解决方法：
✓加S9+NADPH生成系统 ✓与原代肝细胞混合培养
（三）受试物的给予
➢水溶性低的受试物：先溶于有机溶剂，再加 入培养液中（需设有机溶剂对照） ✓有机溶剂在培养液中的浓度应低于1%； ✓需添加S9时，有机溶剂浓度应低于0.1%。
三、脏器灌流的优缺点
优点：
➢在接近生理状况的条件下研究脏器功能； ➢保持了完整的脏器和细胞结构及生理生化特性； ➢排除其他组织、脏器的干扰； ➢便于严格控制受试物浓度； ➢易于采样分析。
缺点：
➢只能在有限的时间内进行； ➢操作复杂。
第三节 细胞毒理学在毒理学中的应用
到目前为止，分离的细胞是毒理学中使 用最广泛和最深入的体外实验系统。体外系 统分离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、 原代培养细胞、细胞株、细胞系及复合培养 的细胞。
一、细胞毒理学兴起的原因
➢公众要求减少实验中使用动物数量； ➢非整体动物实验可显著地减少常规整体动
物实验所需的高额费用； ➢人们越来越不满意实验动物与人体结果之
间相关性的缺乏。
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表12-3 毒理学研究中常用细胞
各种物种的成纤维细胞 淋巴母细胞 腹水瘤细胞 淋巴细胞 角质细胞 肝细胞 肝癌细胞 肾脏髓质和皮质细胞
大家好
第八章
体外试验与生物新技术 在毒理学中的应用
第一节 体外试验
体外试验的必然趋势: ➢大量新化学物成为食品成分； ➢整体动物试验需消耗大量时间和经费； ➢动物保护主义兴起； ➢生物技术的发展和进步。
体外试验的发展，并不排斥体内 试验本身的重要性，两者必须相互补 充、相互验证才能为毒理学研究提供 坚实的科学基础。
➢ 亚细胞组分主要用于毒作用的分子机制研究。 ➢ 现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是线粒体、
微粒体及细胞膜。
第四节 分子毒理学在毒理学中的应用
一些常用的分子生物学技术，如PCR技术、 核酸杂交技术、DNA测序技术以及一系列突变检 测技术已广泛应用于外源化合物和环境致癌物引 起的DNA损伤、基因突变、加合物形成及癌基因 和抑癌基因研究等方面。特别是近年来基因差异 分析技术、转基因技术、基因芯片技术等分子生 物学新技术的建立和引入，大大提高了毒理学研 究的整体水平。
➢通常采用northern杂交、核酸原位杂交检 测mRNA。
三、转基因技术
导入的外源基因对遗传损伤敏感性高， 导入动物体内后其敏感性仍高，可在低剂量 下检测，特别适宜于观察慢性低水平接触时 的DNA损伤。
➢ 一般是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路，为 此应结扎肝动脉、上腔静脉，在恒温条件下灌流。
➢ 肝灌流时间不能过久，以4h之内为宜，否则肝细 胞的功能与生存不能维持。
二、肠灌流技术
➢利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些 化合物的吸收及动力学过程。
➢如用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠， 在保持原有血液循环体系下，将肠两端插 管，清洗净肠中内容物，在恒温环境中灌 入灌流液。
➢体外试验的前提条件是将敏感细胞或某分子 靶部位例如酶，在体外条件下，维持其正常 的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，
体外试验的优点
➢能控制环境因素； ➢可排除相互作用的系统如免疫系统、神经
内分泌系统的影响； ➢快速、经济； ➢易于利用人体细胞，较好地解决物种差异
的问题。
体外试验的缺点
➢ 体外到体内外推的问题 体外试验是依据毒性作用的始发阶段及继
续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差 异，如何将产生体外毒性的体外浓度与相应体 内剂量联系的问题是最终未解决的难题。
它需要更好的工具——预测性毒物代谢动 力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的 毒物代谢动力学模型。
体外试验的缺点
➢体外毒性试验难以预测慢性毒性 因为，慢性毒性病理过程的机理所知
甚少，缺乏发展体外试验的理论依据，再 者，某些体外系统仍难以达到长期维持生 理状态的要求。
体外试验的缺点
➢不能提供某些必要信息 如每日允许摄入量、化学物在体内的
ຫໍສະໝຸດ Baidu分布等。
第二节 脏器灌流技术
一、肝脏灌流技术
➢ 毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常 见方法。
➢ 在灌流液中加入外源化学物，此外要维持灌流液 的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。
➢不溶性受试物：混悬于培养液
（四）观察指标
➢细胞形态 ➢细胞存活率：台盼蓝染色（着色者为死亡细胞） ➢IC50：半数抑制浓度 ➢代谢能力：检测代谢酶、底物等 ➢生物大分子的合成与降解：RNA、蛋白质
四、 亚细胞组分在毒理学在的应用
➢ 将细胞中各亚细胞组分分离和纯化，对于深入 研究外源化学物的靶位点、探讨化学物毒性效 应的机理均十分重要。
肺的各种类型细胞 培养的背根胶质细胞 培养的睾丸细胞 膀胱细胞 心脏 细 胞 脊髓微血管细胞 脂肪细胞
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二、细胞培养仪器与设备
➢ 离心机、消毒灭菌设备、超净工作台 ➢ 水纯化装置 ➢ PH计 ➢ 渗透压仪 ➢ 过滤消毒装置 ➢ 二氧化碳培养箱：5%CO2、95%O2，饱和湿度。 ➢ 倒置显微镜 ➢ 培养器皿：细胞培养瓶、培养皿、多孔培养板
依据体外试验在决策过程中所起 的作用将其分为3类：
➢筛选试验：提供决策过程的最初的资料。 ➢附加试验：为协作部门或法律部门的最终决
策过程提供资料，但仅有它是不够充分的。
➢替代试验：在大量实验的基础上，使体外毒 性试验能替代整体动物试验。
体外试验的基本原理
➢体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效 应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏感 性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用 的结果。
一、PCR技术
PCR(polymerase chain reaction)技术 称聚合酶链式反应技术，又称无细胞克隆 技术(“free Bacteria”cloning technique)， 是一种对特定的DNA片段在体外进行快速 扩增的新方法。
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二、mRNA定性与定量测定
➢许多外源化学物和内源性活性物质皆可引 起基因表达的改变，主要是基因转录水平 的变化。对mRNA的测定在此类研究中尤 为重要。
三、细胞培养在毒理学中的应用
（一）细胞类型的选择 ➢选择迅速生长的细胞株，用以观察受试物对整
体细胞的一般毒作用； ➢机理研究多不用细胞系。
（二）代谢活化
➢培养细胞对需代谢活化的化学物不敏感； ➢解决方法：
✓加S9+NADPH生成系统 ✓与原代肝细胞混合培养
（三）受试物的给予
➢水溶性低的受试物：先溶于有机溶剂，再加 入培养液中（需设有机溶剂对照） ✓有机溶剂在培养液中的浓度应低于1%； ✓需添加S9时，有机溶剂浓度应低于0.1%。
三、脏器灌流的优缺点
优点：
➢在接近生理状况的条件下研究脏器功能； ➢保持了完整的脏器和细胞结构及生理生化特性； ➢排除其他组织、脏器的干扰； ➢便于严格控制受试物浓度； ➢易于采样分析。
缺点：
➢只能在有限的时间内进行； ➢操作复杂。
第三节 细胞毒理学在毒理学中的应用
到目前为止，分离的细胞是毒理学中使 用最广泛和最深入的体外实验系统。体外系 统分离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、 原代培养细胞、细胞株、细胞系及复合培养 的细胞。
一、细胞毒理学兴起的原因
➢公众要求减少实验中使用动物数量； ➢非整体动物实验可显著地减少常规整体动
物实验所需的高额费用； ➢人们越来越不满意实验动物与人体结果之
间相关性的缺乏。
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表12-3 毒理学研究中常用细胞
各种物种的成纤维细胞 淋巴母细胞 腹水瘤细胞 淋巴细胞 角质细胞 肝细胞 肝癌细胞 肾脏髓质和皮质细胞
大家好
第八章
体外试验与生物新技术 在毒理学中的应用
第一节 体外试验
体外试验的必然趋势: ➢大量新化学物成为食品成分； ➢整体动物试验需消耗大量时间和经费； ➢动物保护主义兴起； ➢生物技术的发展和进步。
体外试验的发展，并不排斥体内 试验本身的重要性，两者必须相互补 充、相互验证才能为毒理学研究提供 坚实的科学基础。
➢ 亚细胞组分主要用于毒作用的分子机制研究。 ➢ 现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是线粒体、
微粒体及细胞膜。
第四节 分子毒理学在毒理学中的应用
一些常用的分子生物学技术，如PCR技术、 核酸杂交技术、DNA测序技术以及一系列突变检 测技术已广泛应用于外源化合物和环境致癌物引 起的DNA损伤、基因突变、加合物形成及癌基因 和抑癌基因研究等方面。特别是近年来基因差异 分析技术、转基因技术、基因芯片技术等分子生 物学新技术的建立和引入，大大提高了毒理学研 究的整体水平。
➢通常采用northern杂交、核酸原位杂交检 测mRNA。
三、转基因技术
导入的外源基因对遗传损伤敏感性高， 导入动物体内后其敏感性仍高，可在低剂量 下检测，特别适宜于观察慢性低水平接触时 的DNA损伤。
➢ 一般是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路，为 此应结扎肝动脉、上腔静脉，在恒温条件下灌流。
➢ 肝灌流时间不能过久，以4h之内为宜，否则肝细 胞的功能与生存不能维持。
二、肠灌流技术
➢利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些 化合物的吸收及动力学过程。
➢如用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠， 在保持原有血液循环体系下，将肠两端插 管，清洗净肠中内容物，在恒温环境中灌 入灌流液。
➢体外试验的前提条件是将敏感细胞或某分子 靶部位例如酶，在体外条件下，维持其正常 的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，
体外试验的优点
➢能控制环境因素； ➢可排除相互作用的系统如免疫系统、神经
内分泌系统的影响； ➢快速、经济； ➢易于利用人体细胞，较好地解决物种差异
的问题。
体外试验的缺点
➢ 体外到体内外推的问题 体外试验是依据毒性作用的始发阶段及继
续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差 异，如何将产生体外毒性的体外浓度与相应体 内剂量联系的问题是最终未解决的难题。
它需要更好的工具——预测性毒物代谢动 力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的 毒物代谢动力学模型。
体外试验的缺点
➢体外毒性试验难以预测慢性毒性 因为，慢性毒性病理过程的机理所知
甚少，缺乏发展体外试验的理论依据，再 者，某些体外系统仍难以达到长期维持生 理状态的要求。
体外试验的缺点
➢不能提供某些必要信息 如每日允许摄入量、化学物在体内的
ຫໍສະໝຸດ Baidu分布等。
第二节 脏器灌流技术
一、肝脏灌流技术
➢ 毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常 见方法。
➢ 在灌流液中加入外源化学物，此外要维持灌流液 的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。
➢不溶性受试物：混悬于培养液
（四）观察指标
➢细胞形态 ➢细胞存活率：台盼蓝染色（着色者为死亡细胞） ➢IC50：半数抑制浓度 ➢代谢能力：检测代谢酶、底物等 ➢生物大分子的合成与降解：RNA、蛋白质
四、 亚细胞组分在毒理学在的应用
➢ 将细胞中各亚细胞组分分离和纯化，对于深入 研究外源化学物的靶位点、探讨化学物毒性效 应的机理均十分重要。
肺的各种类型细胞 培养的背根胶质细胞 培养的睾丸细胞 膀胱细胞 心脏 细 胞 脊髓微血管细胞 脂肪细胞
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二、细胞培养仪器与设备
➢ 离心机、消毒灭菌设备、超净工作台 ➢ 水纯化装置 ➢ PH计 ➢ 渗透压仪 ➢ 过滤消毒装置 ➢ 二氧化碳培养箱：5%CO2、95%O2，饱和湿度。 ➢ 倒置显微镜 ➢ 培养器皿：细胞培养瓶、培养皿、多孔培养板