石蜡制片法
石蜡切片
石蜡切片（paraffin section）技术相关内容组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。
活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织***，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。
石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。
一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
1.取材应根据要求选取材料来源及部位。
例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。
材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。
2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。
固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。
固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。
例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。
固定液可分为单一固定液及混合固定液。
前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。
石蜡制片法实验课件111
试剂的配制
(一)70％、80％、90％乙醇 )70％、80％、90％乙醇 95％以下的各级浓度乙醇是用95％乙醇加蒸馏水稀 95％以下的各级浓度乙醇是用95％乙醇加蒸馏水稀 释而成。简单的稀释方法是：所需稀释的浓度是多少， 释而成。简单的稀释方法是：所需稀释的浓度是多少， 就量取多少毫升95 ％ 的乙醇 ， 再加蒸馏水至 95 ml即 就量取多少毫升 95％ 的乙醇， 再加蒸馏水至95 ml 即 可例如，配制70％乙醇，就量取70 可例如，配制70％乙醇，就量取70 m1 95％的乙醇，然 95％的乙醇， 后加入蒸馏水至95 ml即成。 后加入蒸馏水至95 ml即成。 (二)固定剂 常用的固定剂有4％甲醛溶液、Bouin液和Zenker液 常用的固定剂有4％甲醛溶液、Bouin液和Zenker液 等。Bouin液在组织学制片技术中应用甚广，其配方如 等。Bouin液在组织学制片技术中应用甚广，其配方如 下： 苦味酸饱和水溶液 75 ml 4％甲醛溶液 25 ml 冰醋酸 5 ml
切片
（九）粘片
切下来的切片经过镜检，将符合要求的切片粘在洁 净的载玻片上。粘片时先在载玻片涂薄层粘片剂（蛋白 甘油），将其放在烤片盒中置于50℃左右恒温箱内烤 甘油），将其放在烤片盒中置于50℃左右恒温箱内烤 干 。
蜡带
粘片
（十）脱蜡、染色、脱水透明和封片
粘片后要经过脱蜡、染色、再次脱水透明， 粘片后要经过脱蜡、染色、再次脱水透明，然后封 片永久保存。 片永久保存 。 下面以动物学中观察组织结构最常用的 HE染色法说明脱蜡、染色、脱水透明和封片的过程。 HE染色法说明脱蜡、染色、脱水透明和封片的过程。
染色
封片
实践： 学生每3 学生每3人一组，以大鼠肝脏为材料，熟 悉石蜡切片步骤。
石蜡切片的具体步骤与做法
石蜡切片的具体步骤与做法？石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。
石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，因此用得最多，它有很多优点：比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片（4um以下），能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存。
缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好，容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。
制片时间太长。
石蜡切片的制作过程（一）材料与用具1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。
2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。
（二）实验内容与步骤1．取材及固定取动物体上的小块组织成为组织块。
组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。
切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。
组织块取下后，先用先用0.85％的生理盐水漂洗以戏曲血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。
由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。
如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。
材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。
不同的组织应选用适当的固定液。
固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。
不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。
2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。
组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。
AFA固定液则不需要水洗。
3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。
石蜡切片法
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？） 脱水时间：视材料的性质、大小而定 小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h； 植物叶片：在各级AL中停留2-4h； 注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜， 则停留在70%酒精中。
二、实验步骤（2）
透明（置换） 常用透明剂：二甲苯； 透明原则：低浓度到高浓度 （½ 二甲苯+ ½ 100%酒精 二甲苯 二甲苯） 透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。
染色原理－－化学作用
化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和 中性染色剂，而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子) 和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳 离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸 性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳 离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸 性的组成成分．故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于 着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红、曙红)的亲 和力很大，易于着色。
甲醛－醋酸－酒精液(FAA) 50%或70％酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml 特点：过去称”标准固定液“或”万能固定液“；是 组织形态中常用的固定液；同时兼作保存液。是植物 制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和 丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳 类的固定。
石蜡制片技术
（六）烘干
将烫好的片子自然烘干，或 45℃烤片箱干燥1~2天，注意 防尘。
（七）脱蜡、染色、脱水、 透明
将玻片标本放于100%X（15-30min)→100%X(12min)→50%X+50%A(1-2min)→100%A(12min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番红 （85%A配制）(2-4h)→85%A(3-5s）→95%A(3-5s） →固绿（100%A配制）(30s)→95%A(12min)→100%A(1-2min)→100%A(1-2min） →50%X+50%A(1-2min)→100%X(12min)→100%X(1-2min) 注意番红染色时间要长些（至少3h以上），随后的两 次经过酒精的时间都应很短，以免洗掉染上的番红， 固绿的染色时间大约在20-30s,其他各步的时间大约1 至2分钟，均要视具体情况而定。
（二）固定和抽气
（一）将切取的植物材料放入固定液中， 使其细胞原生质在极短的时间内停止生命活 动，尽量保持细胞原有的细微结构，也可使 某些柔软的材料适当硬化，便于切片。材料 的长和宽最大不超过1cm。固定液为材料的 20倍左右。固定时间24小时，其间要放入抽 真空机中抽气15-30分钟至材料完全沉浸在固 定液下面。并用铅笔写好标签。
五、石蜡制片的操作流程
（一） 取材 （二）固定和抽气 （三）脱水、透明及渗蜡 （四） 包埋 （五）修块 、切片和烫片 （六）烘干 （七）脱蜡、染色、脱水、透明 （八）封片
（一）取材
选取经过自己设计实验的对照和处理 的材料，根据不同的要求，从植物体上 选取有代表性的器官或组织，取材力求 新鲜，以避免组织发生死后变化。取材 时要用快刀切割材料，不能挤压，所取 的材料不宜过大，在不影响观察的情况 下应尽可能小些，这样有利于药剂透入 组织和细胞中。
石蜡制片法实验报告
一、实验目的1. 了解石蜡制片的基本原理和操作步骤。
2. 掌握石蜡制片法在组织切片中的应用。
3. 提高实验操作技能，为后续病理学实验奠定基础。
二、实验原理石蜡制片法是一种常用的组织切片技术，其原理是将组织经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤，制成石蜡切片，便于观察和研究。
石蜡具有优良的透明性和可塑性，适用于制作较厚的切片。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜组织、固定液、70%、85%、95%、100%酒精、二甲苯、甘油蛋白、石蜡、载玻片、切片刀、切片机、烤箱、显微镜等。
2. 实验仪器：解剖针、眼科镊子、手术刀、量筒、漏斗、滴管、酒精灯、小木块、切片木框、切片盒、吸水纸、标签纸、熔蜡箱、展片台、真空泵等。
四、实验步骤1. 取材：将新鲜组织固定于4%多聚甲醛24小时以上，取出后修整平整，放入脱水盒内。
2. 脱水：将脱水盒放入吊篮，于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。
具体步骤如下：- 75%酒精1小时- 85%酒精1小时- 90%酒精1小时- 95%酒精1小时- 无水乙醇I 30分钟- 无水乙醇II 30分钟- 醇苯5-10分钟- 二甲苯I 5-10分钟- 二甲苯II 5-10分钟- 蜡I 1小时- 蜡II 1小时- 蜡III 1小时3. 浸蜡：将浸好蜡的组织放入包埋机内进行包埋。
先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出，按照包埋面的要求放入包埋框并贴上标签。
于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
4. 切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚约4微米。
切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烤箱内烤片。
待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
5. 染色：将石蜡切片依次放入二甲苯、无水乙醇、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中脱蜡至水，然后进行HE染色。
6. 洗片：将染色后的切片放入清水中洗去浮色。
7. 晾干：将切片放入干燥箱中晾干。
石蜡制片技术
石蜡制片技术［自己整理］石蜡制片又叫永久制片，是观察植物组织构造常用的制片方法之一。
其优点主要是适合各种植物组织的制片，切片的厚薄易于控制（最薄可达0.5微米），清晰度很好，亦适合作细胞学研究，并能够制成连续切片，制片易于长久保存，易于交流等。
但制片周期较长，易受条件限制，制片中使用化学试剂较多，对人有一定毒害，易使材料变脆、变硬或变形，某些内含物易于消失，常使组织变小，甚至使组织扭转变形，细胞所含物质缩小而折光性增强，影响观察正确性，且制片成本较高等。
虽然这样，但是石蜡制片仍不失为一种很好的制片方法，被人们常采用。
现将主要的基础理论和技术方法介绍如下：首先要明确,在这种条件下,植物的组织或部位不能直接用来切片,首先要按照该方法的要求,将材料进行程序化处理,终究要让所起填充作用的石蜡进入到材料的细胞中,然后带石蜡在切片机上进行切片,再染色、封藏。
这样的程序中，中间过程是十分复杂的，往往随材料的不同，而方法有所不同，在实际工作中要不断地摸索,不断地总结,只有这样,才有可能做出好的片子。
选择切片材料是全部切片工作的第一步，如果选择的材料不适当或有错误，以后的工作将是没有意义的。
选择材料时要注意具有代表性,植物的器官或器官的某一部位,其组织构造往往能够代表整个器官的基本情况,但不同部位,即便是同一器官,其组织构造,亦有一定的过渡差异,通常在选择材料时,要注意选择器官靠中间的部位作为试验材料,当然如果是作生长发育观察,则另当别论。
因此选好试验材料，对于整个实验至关重要。
当选择好材料后，实验的主要过程有以下步骤：材料的固定或软化——冲洗——脱水——透明——浸蜡——包埋——切片——贴片——烘片——脱蜡——二重染色——封片⒉制片程序简介：1)材料的固定或软化：最好用新鲜的固定材料（新鲜材料要迅速杀死植物细胞，最大程度保持组织和细胞的自然状态，这就是所说的杀死和固定）。
干材料可先行软化（常用温水浸泡，勤换水，勿使材料腐烂）。
植物石蜡切片法显微制片技术
取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。 取材的注意事项如下： （1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置
对照材料。 （2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶
片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意 刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。 雌、雄 蕊一般不需分割。 （3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时， 需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植 物细胞分裂活动较明显。 （4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）； 对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率 较低。
（五）脱水
• 材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分 解。而且透明剂与水是不相混合的，不利 于材料的透明和包埋等后期处理。因此需 用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让 石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关 键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能 与其他有机溶剂互相替代。
• 脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止 吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水 剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。
• 浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇。
• 每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。
（八）包埋
• 材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡 块，以备切片。
• 操作方法：根据切片材料大小，确定所 需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先 叠好纸盒。
（九）切片
• 即（二）固定
• 将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固 定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止， 并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变 化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折 光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新 鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、 大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上 标签。
石蜡切片的制作过程
石蜡切片的制作过程（一）花药切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。
3．脱水：经70％乙醇、85%乙醇，每级3~4h，含1%伊红的95％乙醇中3~4h（可以过夜），无水乙醇2次，每次1~2h。
4．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d5．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。
6．修蜡块、切片：粘蜡块时组织块直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡，浸水软化后放在切片机上坐横切片，切片厚12μm。
7．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。
8．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。
9．染色（番红-固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水各4~5s，苯胺番红染色5~10min，用蒸馏水洗去浮色。
10．脱水、透明：各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇），苯胺固绿复染30~40s，再经95%乙醇，无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯2次，各约4~5s，最后置二甲苯缸中。
11．封片、烘片：加拿大树胶封片。
封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。
最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。
制片日程（二）花芽纵切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。
3．整染：经70％乙醇、50%乙醇各2~4h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份，加入50%乙醇及乙醇各半的混合液1份）中整染2~3d。
4．水洗、反蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1~2次水，至样品由紫色变深蓝色为止，共需时约1d。
石蜡制片方法
▪包埋中出现旳问题及其处理方法 ➢问题 包埋后旳石蜡块应为均匀旳半透明状态， 但有时出现白色混浊旳结晶部分，这么在切片时 就有阻碍。 ➢原因 1.脱水不洁净。2.组织内部或石蜡中混 有透明剂。3.石蜡本身品质不良。4.纸盒中周围 旳石蜡先成凝固状态，中部旳石蜡凝固较晚。5. 石蜡冷凝得太慢。 ➢处理方法
1.摺包埋用旳纸盒并写好标签。 2.检验恒温箱中所熔旳新鲜石蜡是否够 用。
➢纸合旳折叠措施
3.在脸盆内放入冷水备用。 4.点燃酒精灯，准备好1把镊子，1支拨针。
➢包埋旳操作过程 1、右手持镊子，左手从恒温箱中取出盛满熔
化石蜡旳小瓶，并随手将恒温箱旳门关闭，立即 将小瓶中旳石蜡和材料一起倒入包埋用旳纸盒中， 假如纸盒中蜡旳量少，可再加入适量旳蜡。
15％，35％，50％，70％，85％，95％，100 ％。
2.一般经水洗旳材料，脱水可自35％开始， 柔弱旳材料自15％开始，若用酒精洗涤，则可直 接移入50％或70％酒精中继续脱水。
3.在每级中停留旳时间，依材料旳大小、性 质以及留在固定液中旳时间长短和固定液旳溶解 性而定。一股旳原则是：
(1)如洋葱、蚕豆等根尖和小片叶子一样大 小旳材料，每级停留约30分钟到1小时。
（3）福尔马林——醋酸——酒精混合液(FAA)
合用范围：合用于植物各器官解剖构造旳观察，
但不适于染色体观察研究。
配方： 50％或70％酒精
90毫升
冰醋酸
5毫升
福尔马林 5毫升
处理：1、一般柔软材料，可用50％酒精。
2、固定时间最短需18小时，也可无限期延长。
3、冲洗时材料可直接换入50％或70％酒精中洗一、
➢常用固定液旳配方
（1）福尔马林[Formalin，37—40％旳甲醛
石蜡切片制片流程(番红固绿滴染)
石蜡切片制片流程（番红固绿滴染）1.鲜样FAA（18：1：1）抽气固定24h以上。
2.易碎的材料可用甘油酒精软化剂（1：1）软化1周以上（乙二胺软化剂容易导致颜色变深）。
3.70%酒精浸泡1h。
4.80%酒精浸泡1h。
5.95%酒精浸泡1h。
6.吸水纸迅速吸干，100%酒精浸泡1h。
7.100%酒精浸泡1h。
8.含1/2酒精+二甲苯的溶液浸泡1h。
（若有浑浊，即脱水不完全，需要重新从95%酒精再脱水一次）。
9.纯二甲苯浸泡1h。
10.纯二甲苯浸泡1h。
11.加入约1/4二甲苯体积的碎蜡，放置约半小时，再加入1/4体积碎蜡（也可一步到位）。
12.视混合物熔点而定，40-50℃液体状态渗蜡1-2d。
13.视石蜡熔点而定，50-65℃（高于熔点3-5℃），含1/2二甲苯+石蜡的蜡锅浸蜡2h。
14.含1/3二甲苯+2/3石蜡的蜡锅浸蜡2h。
15.纯石蜡锅浸蜡2d以上。
16.包埋（若材料大、中间有空气可调高温度再抽气）（新蜡不易凝固，可在新蜡锅抽气再用老蜡包埋）。
17.空气中冷却（急剧冷却容易收缩不均而变形），削块成棱台形蜡块。
18.切片（8-20µm，若太薄易碎则调高厚度）。
19.40℃水中展片，用涂有粘片剂的载玻片捞片（展片时间不宜太短，易产生褶皱）（捞片的展片效果优于滴水展片，气泡少），40℃烘干。
20.40-50℃烤片2-3d（比石蜡熔点低5℃左右），让蜡带充分贴在玻片表面。
21.铅笔做好标记，二甲苯浸泡脱蜡20-30min。
22.二甲苯透明10-20min。
23.取出，滴加含1/2酒精+二甲苯的溶液，放置数秒，倾去。
（需要过渡酒精至与染色剂的酒精含量相同的浓度，染色）（以50%番红酒精溶液和95%固绿为例）。
24.滴加100%酒精，放置数秒，倾去。
25.滴加95%酒精，放置数秒，倾去。
26.滴加80%酒精，放置数秒，倾去。
27.滴加70%酒精，放置数秒，倾去。
28.滴加50%酒精，放置数秒，倾去。
石蜡切片法
根据所用材料的不同，选择不同的固定液。一般，各种器官，不论是根、茎、叶，还是花和果实，其组织切片均用FAA固定液，而根尖、茎尖、花药等材料的压片（非切片法）用卡诺固定液。
（3）材料体积的影响
对于微小材料可直接投入固定液，对于较大材料，则须将其先解剖成较小材料，再迅速投入固定液。若材料外部超过固定液上线，达不到固定作用时，应须立即放入渗透力很强的固定液中，如醋酸酒精溶液；或利用超声波发生器处理数min。
⑵ 纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存;主要用于显示分裂相.
(三)抽气
植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.
一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.
取材的注意事项如下:
(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料.
(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
浸蜡是一个渐进的过程,常用
(八)包埋
材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.
操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.
(九)切片
即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.
(十)贴片
是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.
SP法
石蜡切片制片流程：取材（0.5cm*0.5cm*0.3cm）→固定（10%甲醛）→修块(宁大勿厚)、洗涤→脱水（70%酒精2h →85%酒精2h → 95%酒精1.5h → 95%酒精1.5h → 100%酒精20-30min → 100%酒精20-30min）→透明（二甲苯Ⅰ20-30min →二甲苯Ⅱ20-30min）→浸蜡（软蜡30min、硬蜡1h）→包埋（硬蜡）→切片(20um、4um) →烤片（37°C过夜或60℃2－3小时）→脱蜡（二甲苯Ⅰ10min →二甲苯Ⅱ10min → 95%酒精1-2min → 85%酒精1-2min →75%酒精1-2min →蒸馏水→抗原修复15分钟→SP法免疫组化免疫组化流程：SP法1）脱蜡至水后进行抗原修复（水浴，枸橼酸盐溶液，95。
C，15分钟或80°C半小时），待冷却后PBS洗3次，每次各3分钟；2）除去PBS 液，加过氧化物酶阻断剂（试剂A），阻断30分钟；然后用PBS 洗3次各3分钟；3）除去PBS液，加triton透化15分钟；4）除去triton，加正常非免疫动物血清封闭液（试剂B），封闭30分钟；5）除去血清，滴加Ⅰ抗50μl，室温孵育2小时或者4℃过夜；后用PBS洗3次各3分钟；6）除去PBS，滴加Ⅱ抗（试剂C）40～50μl，室温孵育10分钟；后用PBS洗3次各3分钟；7）除去PBS，滴加一滴或50μl链霉菌抗生素-过氧化酶溶液（试剂D），室温下孵育10分钟；PBS洗3次每次3分钟；8）除去PBS，每张切片滴加DAB显色；9）自来水冲洗10至15分钟；10）苏木精复染2分钟，自来水冲洗，盐酸酒精分化5秒；11）自来水冲洗返蓝10分钟；12）脱水（70%酒精（2min）→ 85%酒精（1-2min）→ 95%酒精（1-2min）→三道100%酒精（1-2min））→透明（二甲苯Ⅰ2min →二甲苯Ⅱ2min）、封片、镜检。
快速石蜡制片法
天津天士力集团研究院药理所文件编号：
快速石蜡制片法
这是一种传统的制作法，在有的单位或者没有配备超声波快速石蜡处理仪的情况下而又急需诊断的一种制作法，较适合于小组织的制作。
（1）胃、肠粘膜组织快速制作法
1．10%缓冲福马林5 mins。
2．80%酒精5mins。
3．90%酒精5mins。
4．95%酒精5mins。
5．100%酒精5mins
6．二甲苯5mins
7．石蜡 15mins
注意事项：
1．全部步骤都在65℃的恒温箱中进行。
2．浸蜡也可在酒精灯上进行，但要小心，浸蜡温度过高，也可导致组织变脆。
3．包埋时，可用预先制作的蜡模(这样可节省石蜡硬化的时间)用镊子在酒精灯上烧红，然后点于蜡膜上，将组织放进去，然后放入冰箱的冰枚中冻起来，即可切片。
4．如遇取材多个部位多块组织时，就不能用上述的方法，否则多块组织包在一起时，不能处于同一水平面上，不利于切全组织。
（2）鼻咽部粘膜、宫内膜及穿刺物快速制作法。
1．10%缓冲福马林固定5-10mins。
2．80%酒精5-10mins。
3．90%酒精5-10mins。
4．95%酒精 5-10mins。
5．100%酒精5-10mins。
6．二甲苯5mins。
7．浸蜡 20mins
注意事项：
上述步骤都于65℃恒温箱中进行。
1。
石蜡制片技术
番红—固绿染色法
此法应用甚广，是研究植物一般形态结构 的重要方法。番红为碱性染料，常用的是混 合物（二甲基酚番红，三甲基酚番红），可 将细胞核、染色体、核仁等染成红色，对木 化、栓化、角化的细胞壁也有很好的染色效 果。
透明
将玻片标本放于100%X（15-30min)→100%X(12min)→50%X+50%A(1-2min)→100%A(12min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番红 （85%A配制）(2-4h)→85%A(3-5s）→95%A(3-5s） →固绿（100%A配制）(30s)→95%A(12min)→100%A(1-2min)→100%A(1-2min） →50%X+50%A(1-2min)→100%X(12min)→100%X(1-2min)
→100%A（2h）→100%A（2h） →3/4A+1/4X（2h）→1/2A+1/2X（2-3h、过 夜）→1/4A+3/4X（2h）→X（2h） →1/2X+1/2蜡（过夜）→渗蜡1（2h）→渗蜡 2（2h）→渗蜡3（2h）
（四） 包埋
将渗蜡后的材料和石蜡一起倒入小纸盒， 用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一 定的间隔排列整齐并使其竖直，倒入纯蜡进 行包埋。稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷 却凝固。
3、 烫片 滴一滴蛋白胶于干净载玻片中央，用干净的手指 涂抹均匀后，滴上清水，将取下的蜡带切成小段置于载玻片 上（放上两至三段），然后将载玻片放到展片台上(保持 40℃)烫片。 待充分烫平后用吸水纸吸去多余的水。
超声波快速石蜡制片法
超声波快速石蜡制片法来源：病理学园地临床活检用常规石蜡制片法制作，病理报告如没特殊情况，一般都需要三天才能发出。
其程序基本是活检当天下午取材，晚上组织脱水及浸蜡，第二天上午包埋切片及染色，当切片送达医生手里时，已是第二天的上午，下午看阅切片，至复检医生手里时，已是第三天的时间了。
这是一般的工作时间，可这对于急需获得病理结果的患者来说，三天时间确实太长，尤其是门诊病人，远道求医的患者，或者外地甚至国外的患者，三天的时间就意味着等待，住宿及消费。
为了解决上述的问题，减少患者的经济负担，为患者蠃来保贵的治疗时间，超声波快速石蜡制片法可胜任此项工作。
超声波的工作原理：超声波的高频振谐下以每秒80万次作缩张运动，在此振谐下，也促进了被超声波所作用的试剂中分子的运动。
由于分子运动加快，加速了组织与各种试剂的反应，使整个操作程序在短时间内完成。
超声波快速石蜡制片法程序：几种不同组织处理时间表（mins）步骤与试剂肠粘膜鼻咽部粘膜宫内膜等胶原纤维较多组织1．10%缓冲褔尔马林 4 5 102．丙酮 3 5-7 103．丙酮 3 5-7 104．二甲苯 3 5-7 105．石蜡 5 7-10 12注意事项：1.本法中所用的脱水剂为丙酮，它比酒精具有更强的脱水作用。
虽然从理论上讲，它对组织具有很强的收缩作用，但为了能在短时间内使组织能够彻底脱水，不得不首选它。
从已做的近千例次的实验中认为，它与常规切片相比较，没有什么区别。
2.有人提出，既然要快，何不用冰冻切片来制作，对于这个问题，肯定的回答是不能。
因为冰冻切片与石蜡切片不一样，虽然目前机器及技术都是一流，制出切片近似于石蜡切片，但还是达不到石蜡切片的好，切片不能作长期保存，这就会影响档案的保管和资料的积累。
3.为了减少组织的收缩，脱水剂第一缸用酒精代替，但为了使组织获得彻底脱水，时间要相对延长些。
4.丙酮沸点较低，70℃左右就会沸腾，如此挥发较快，因此组织脱水时，注入丙酮的量要够，否则很容易使其干涸。
常规石蜡切片制片方法
常规石蜡切片制片方法组织经系列酒精的脱水，经透明剂的作用，经熔化的石蜡的浸渍，包埋后所切成的切片称为石蜡切片。
组织脱水把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。
不管是正常的组织，还是有病变的组织，都含有不同程度量的水分。
据测定，人体的物质组成约含水55~67%，蛋白质15~18%，脂类10~15%，无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。
如果不把这些水分脱去，石蜡切片将无法进行，因为石蜡和水不能混合在一起，所以除去组织中的水分成为制片中的关键，用什么物质才能担当起这个重任呢，至今为止，国内所用的都是酒精。
因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合，所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。
酒精脱水力强，对组织又有硬化和易脆的不良影响。
在使用时，通常是从低浓度至高浓度，浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，组织经过这一系列处理后，基本可达到脱水的目的。
临床上如使用含酒精的固定液固定组织时，(Carnoy氏、AAF液)组织不需要经过低浓度的酒精，可直接进入95%酒精脱水。
组织脱水，目前常用的有两种方法1.人工组织脱水法该法经济实惠，灵活度高，可根据不同的组织及其大小来确定脱水时间，也可根据不同组织及大小分批进行脱水，其优点是：①可根据不同的组织及大小，任意增减脱水时间，达到脱水目的。
②可随时观察组织的变化，随时中断组织的脱水，不使组织过度硬脆。
③可以多层次地进行脱水。
缺点：①需耗费人力，每个步骤的递增都需要人工完成。
②不能大批量的进行脱水。
③必须在上班完成脱水或者定点于某一浓度的酒精中过夜，晚上无法进行梯度递增。
2.自动组织脱水机脱水法自动组织脱水机的机型品种繁多，大小不一，国内生产的轨道式和圆盘式两种，国外生产的有圆盘式和柜式两种，上述国内外四种型号的机子，我们都使用过，根据使用的效果做一简单介绍。
①轨道式自动组织脱水机。
这种机子容量小，脱水用的试剂不足一千毫升，组织块脱水用的提篮小，每次只能容纳40块组织左右，它适合于较小的单位，但不适合于大单位。
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石蜡制片法（用于免疫组织化学，HE染色）
发布日期:2008-10-27 热门指数:6172 收藏
石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。
此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。
该法多采用旋转式切片机进行切片。
石蜡制片操作程序如下：
（一）材料的采集与分割
采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。
采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。
为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。
分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。
分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
（二）杀死与固定
利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。
常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。
将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。
用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。
F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。
卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。
因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。
（三）脱水
脱水的目的是除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进行，因为这些程序中所用的药品都不能与水混合，所以必须脱水。
常用的脱水剂为酒精。
脱水过程应缓慢进行，不能操之过急或时间过长，以免组织变硬变脆或发生收缩现象。
脱水采用等级脱水（系列脱水），即从较低浓度酒精开始，逐渐替换到高浓度酒精。
一般为：50%→70%→80%→95%（此时可加少许番红，使组织着色便于包埋时定位）→无水酒精（两次），每级停留时间2~4小时或更长（无水酒精中时间宜短）。
用95%酒精配制各浓度酒精的方法：设原有酒精浓度为A，所需配制酒精浓度为B，则取Bml原有酒精，加上A-Bml蒸馏水，即可获得Aml的B%的究竟。
例如：95%酒精配成70%的酒精，则取70ml的95%酒精，加上25ml蒸馏水，则配成了95ml的70%的酒精。
（四）透明
透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使材料透明，增记折光系数；同时便于下步的浸蜡和包埋等程序（因
为究竟不能溶解石蜡）。
透明剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的药剂。
常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是逐级进行，可减少材料收缩。
一般步骤是：2/3纯酒精+1/3二甲苯→1/2纯酒精+1/2二甲苯→1/3纯酒精+2/3二甲苯→二甲苯（两次），每级停留时间0.5~2小时或更长些。
二甲苯穿透能力强，但又宜使材料收缩变脆，使用时不能在其中停留时间过长。
若材料放入二甲苯中时有白色混浊现象发生，说明材料脱水不彻底，应把材料退回至纯酒精中再行脱水。
（五）浸蜡
浸蜡的目的是逐渐除去透明剂,并为包埋剂所代替。
常用的包埋剂是石蜡。
浸蜡过程是使石蜡慢慢溶于浸有材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深入到材料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代，以便切片。
一般所用的石蜡分软蜡（熔点40℃以下）和硬蜡（熔点40℃以上）。
浸蜡过程一般是从低温到高温、从低熔点到高熔点逐渐进行，这一过程不能操之过急，否则浸蜡不彻底影响切片。
此外，软材料可用熔点较低石蜡，较硬的材料可用熔点较高的石蜡；冬季可用熔点较低的石蜡，夏季可用熔点较高的石蜡。
石蜡必须纯净，不含杂质。
整个浸蜡过程需在恒温箱内进行（按需要调整温度）。
材料最后一次二甲苯透明后即可浸蜡，浸蜡过程中逐渐使二甲苯挥发，并不断加入纯石蜡，直至石蜡饱和为止。
浸蜡时间大约1~2天。
（六）包埋（埋蜡、沉床）
材料浸蜡后再换两次已熔融的纯蜡，然后将材料和石蜡一起倒入提前叠好的包埋纸盒中，用加热的镊子迅速将材料按一定的间隔和所需的切面摆放整齐，同时用加热的镊子赶走材料周围的气泡，待纸盒表面的石蜡凝固后将纸盒平放入冷水中，使石蜡迅速凝固。
最后从纸盒中取出蜡块，以便保存。
注意将样品编号封于蜡块上，以免样品混淆。
（七）修块
将已包埋好的蜡块切成小块，每一小块包含一块材料。
然后按照所需的切面，用单面刀片将小蜡块切成梯形，并可粗视到材料切面。
然后用烧红的蜡铲把蜡块底部牢固的粘接在载蜡器上。
（八）切片
用切片机（如旋转切片机）将蜡块切成连续的蜡带。
切片时先把切片刀夹在刀架上，再把载蜡器夹在固定装置上（注意安装切刀的角度，刀口运行方向与材料切面平行），然后调整好所需厚度，一般可在7~14微米，视材料和所需观察对象而定，一般叶片、芽可厚些，胚囊和花粉粒可薄些，转动切片机切片。
（九）粘片
切下来的切片经过镜检（根据情况也可不检），将符合要求的切片粘在洁净的载玻片上。
粘片时先在载玻片上滴上一小滴粘片剂（可用蛋青和甘油各50ml，加1g水杨酸混合而成），加几滴蒸馏水，然后用镊子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用拨针将切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。
（十）脱蜡、染色、脱水透明和封片
粘片后要经过脱蜡、染色、再次脱水透明，然后封片永久保存。
下面以植物生物学中观察组织结构最常用的番红-固绿染色法说明脱蜡、染色、脱水透明和封片的过程：
二甲苯→二甲苯（每次均10~15min.）→1/3纯酒精+2/3二甲苯（1~2min.）→1/2纯酒精+1/2二甲苯（1~2min.）→2/3纯酒精+1/3二甲苯（1~2min.）→纯酒精两次（每次1~2min.）→95%、85%、70%、50%梯度酒精复水（每级1~2min.或更长）→用1%番红配50%酒精染色1小时→50%、70%、85%、95%梯度酒精脱水（每级1~2min.或更长）→用0.1%固绿配95%酒精复染2~5秒→95%酒精脱水1~2分钟→纯酒精两次（每次1~2min.）→2/3
纯酒精+1/3二甲苯透明（1~2min.）→1/2纯酒精+1/2二甲苯透明（1~2min.）→1/3纯酒精+2/3二甲苯透明
（1~2min.）→二甲苯→二甲苯（每次均10~15min.）→加拿大树胶封片→贴标签镜检及保存。
以上是石蜡制片的一般步骤；为了获得良好的制片效果，需要制片者的大量实践并在实践中不断摸索、积累经验方可。