转化,摇菌,提质粒.

一、感受态细胞XL-1转化实验

（1）5ng DNA+100µl感受态细胞XL-1于1.5ml离心管中,混匀，冰浴30min。

（2）42o C, 45s。

（3）冰浴2min。

（4）涂布于固体LB平板上(含50mg/ml 氨苄青霉素, 37 o C预热)。

（5）放入37 o C恒温孵育箱，待液体吸收完全后，倒置孵育16-18h。（6）保鲜袋密封后，倒置放于4o C冰箱保存。

二、菌液的培养与质粒的提取

1.每个样本挑取5个细菌，进行摇菌，提取质粒。（一个细菌一支管）

在50ml离心管里加入5ml液体LB和5µl 50mg/ml氨苄青霉素，用200µl枪头挑取过夜培养LB平板上的单克隆，枪头打入离心管中，置于37o C摇床，250r/min培养16～18h，质粒提取。（老师，这里要先挑取一个细菌进行摇菌后再分成五支离心管重新摇菌，还是直接挑取5个菌落直接摇菌）

质粒提取(采用天根质粒小量多次提取试剂盒提取，步骤如下)：

（1）吸附柱中加入500µl平衡液BL，13000rpm离心1min。倒掉收集管中废液，吸附柱放回收集管，备用。

（2）收集5ml菌液，13000rpm/min, 离心10min，收集沉淀。

（3）加入500µl溶液P1(含RNase A), 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

（4）加入500µl溶液P2, 温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解。

（5）加入700µl溶液P3, 立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色沉淀。

（6）13000rpm/min离心10min，收集上清分次加入过滤柱中

(800µl/次)。

（7）13000rpm离心2min后将上一步得到的滤液分次加入吸附柱中(800µl)。

（8）13000rpm离心1min，弃掉滤液。

（9）加入500µl去蛋白液PD, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。（10）加入600µl漂洗液PW, 静置5min, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。

（11）重复步骤10。

（12）13000rpm/min离心2min，彻底去除柱子中残留废液。

（13）将DNA吸附柱放入新的离心管，悬空滴加100µl无菌双蒸水，静置5min。13000rpm/min离心1min，所得到的液体即为高纯度的DNA

溶液，置于-20o C保存。

七．定点突变的鉴定

质粒提取后用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.1.6亚克隆

对成功突变的突变体和质粒载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒步骤回收载体和目的片段，用T4连接酶进行目的片段和表达载体的连接，产物转化细菌感受态细胞，挑取阳性克隆，按照质粒试剂盒说明书提取质粒，用限制性内切酶进行酶切鉴定，送质粒进行测序鉴定。