中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解

国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
菌种的要求： 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的 冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
无菌检查验证用菌株：
金黄色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003]
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **拟修订为大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63 501]
Hale Waihona Puke Baidu
对国内新药的注册检验，也应请企业提供方法验 证资料，如果企业提供不出方法学验证资料，根 据药品注册管理办法，应在审核意见中明确指出 “方法学未经验证，无法检验”，并建议企业重新 建立“微生物限度检查”或“无菌检查”方法。监督 抽验药品，由于2005年版以前历版《中国药典》 未强调进行方法学验证，故各药检所目前在进行 具体品种检验时难度较大，故也应请企业提供方 法验证资料并进行审核，未经过方法学验证的 “微生物限度检查”或“无菌检查”结果，决不能给 出“符合2005年版《中国药典》的规定”的结论。
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验，即只有通过方法验证，才 能确定供试品的检验条件和方法，保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中 成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬，需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
验证的类型
●前验证: 建立药品的微生物限度检查法和无菌 检查法时（当建立药品的无菌或微生物限度检查 法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法 适合于该药品的无菌检查）。
● 再验证: 修订的检验方法;供试品的组分或原 检验条件发生改变可能影响检验结果时 ;定期的 方法验证（若药品的组分或原检验条件发生改变 时，检查方法应重新验证） 。
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
中国药典无菌、微生物限度和细菌内 毒素检查方法学验证内容详解
主要内容
1、无菌检查方法学验证关键点及常见问题 2、微生物限度检查方法学验证关键点及常见问
题 3、细菌内毒素检查方法学验证关键点及常见问
题
无菌检查的方法学验证 相关规定 无菌检查验证的关键点 验证中常见的问题
一、相关规定
药品无菌和微生物限度检查方法验证作为中国药 典2005年版增订的一项重要内容对促进我国药品 微生物检验的标准化是十分重要和必要的，执行 近一年以来的情况表明，方法验证是促使我国药 品无菌和微生物限度检查方法更加合理、科学和 严谨的重要途径。（2006年6月全国会议纪要）
3．目前各药检所涉及的检验工作可分为三类： 注册检验（包括进口注册和新药注册）、监督 抽验和进口检验。考虑到各检验性质的差异， 各口岸所在进行进口复核及进口检验时，应请 企业提供方法验证材料或详细的SOP资料进行审 核；各口岸所完成复核时应在修订的进口注册 标准中明确“微生物限度检查”或“无菌检查”的关 键操作点（如供试品的处理方法等）及试验方 法（如平皿法、薄膜过滤法、直接接种法等）， 并在复核说明中概述验证实验结果，以方便以 后的进口检验。
各药品检验所：
根据国食监注[2005]234号“关于颁布和执 行《中国药典》2005年版有关事宜的通知”规 定，《中国药典》7月1日起开始执行，各药 品检验所在执行“微生物限度检查法”和“无菌 检查法”过程中遇到了一些问题，为保证《中 国药典》2005年版的顺利实施，现就有关问 题说明如下：
1．“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安全性 检查的重要项目。虽然近几版《中国药典》均收载 有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”，但在如何 保证检验方法的科学性和检验结果的准确性方面与 国外药典相比仍具有一定差距，其关键是《中国药 典》未强调对检验方法进行必要的方法验证。为此， 药典会设立专项科研课题，对2005年版《中国药典》 的“微生物限度检查法”和“无菌检查法”增加验证试 验的必要性进行研讨。根据研究结果，2005年版 《中国药典》规定当进行药品的“微生物限度检查” 或“无菌检查”时应进行方法验证。
加菌量:＜100cfu。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列 要求进行操作。对每—试验菌应逐一进行验证。
验证方法： 直接接种法 薄膜过滤法
薄膜过滤法
将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗， 在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验 菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培 养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤 筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入 等量试验菌，作为对照。按规定温度培养3～5 天。各试验菌同法操作。