中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解

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中国药典第二部分细菌内毒素检验方法

中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分对细菌内毒素的检验方法主要包括以下几个方面：
1. 细菌内毒素的生物学活性测定：采用小鼠、兔等动物模型，通过观察动物的反应和生存情况来评价细菌内毒素的生物学活性。

2. 免疫学方法：利用抗体与内毒素结合反应，通过免疫沉淀、凝胶免疫扩散、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析等方法来定量或定性检测细菌内毒素。

3. 生理检验：通过动物模型中的生理变化来判断细菌内毒素的存在与活性。

比如利用皮肤红斑反应、大鼠血压升高、家兔体温升高等指标。

4. 生化检验：采用染色反应、化学方法、酶活测定等手段来检测细菌内毒素的存在与活性。

比如利用抗原-抗体反应进行凝集、沉淀、免疫层析等实验。

以上这些方法都是中国药典第二部分中针对细菌内毒素的常用检验方法。

不同的方法适用于不同的细菌内毒素类型和浓度范围，综合运用可以提高检测的灵敏度和准确性。

无菌、内毒素检查法验证讲义1

无菌、内毒素检查法验证讲义1凝胶法和终点法采用单一的时间点采集结果数据，决定反应在规定的时间内是否达到预定的水平。

而动态法则是在适当的检测波长下监测整个反应过程的数据。

内毒素的浓度决定了蛋白凝胶形成的速率，因此，通过测量达到设定光密度的时间，确定光密度随时间的改变情况，以建立光密度变化的速率与参照内毒素之间的线性关系。

终点法中人为的加入反应终止剂，并且在此时间点读取和记录样品和标准曲线点的光密度，其缺点是：必须人为的终止反应，标准曲线的范围有限，仅为一个Log。

而在动态法中光度检测仪连续的读取光密度的变化，动态监测光密度的变化，记录达到设定的光密度所需要的时间。

动态法以将已知的标准内毒素浓度的对数与最终反应时间的对数作图，因此，测定范围可跨越4-5个Log（一般为0.005-50EU/ml），克服了终点法的缺点。

动态比浊法：凝胶的浊度形成是凝胶形成的前提，因此，在这个意义上浊度法其实是凝胶法的延伸。

进行浊度法的鲎试剂含有凝固蛋白原的量足以在凝固酶的作用下形成浊度，但不足以形成凝胶。

浊度法克服了凝胶法只能检测某一个限值水平的缺点，可以定量一定范围内的内毒素含量。

现在细菌内毒素定量法的使用率在国外已超过凝胶法，大约占65%～70%，并且还在逐年上升。

细菌内毒素检查方法的建立方法标准物质限值的确定干扰试验检验一、方法细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法凝胶法为限量测定方法，光度测定法为定量测定方法凝胶法分为限量试验和半定量试验；光度测定法包括动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法两种方法可任选一种进行内毒素的检测当测定结果有争议时，除有特殊规定外，以凝胶法结果为准二、标准物质除另有规定外，细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作对照品应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品三、限值的确定 1、计算公式L=K/M 药品人用最大剂量参考《国家药品标准化学药品说明书内容汇编》。

中国人均体重按60kg计算；人均体表面积按1.55m2计算。

中国药典细菌内毒素检验方法

中国药典细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法中，按以下步骤进行实验。

首先，制备试样溶液。

将待测样品溶解在合适的溶剂中，并通过过滤将溶液过滤至少两次以去除杂质。

然后，制备标准溶液。

将内毒素标准品按照指定浓度配制成溶液。

接下来，准备试管。

将标准溶液和试样溶液分别装入两个试管中，并加入适量的无菌生理盐水作为空白对照。

然后，进行混合。

轻轻旋转试管混合样品，确保溶液均匀混合。

接着，培养细菌。

将特定的细菌株接种在培养基中，分别加入试管中的样品溶液，并在适当条件下进行培养。

培养结束后，观察结果。

通过观察培养基的变化，比较试管中的样品溶液和空白对照的差异，判断样品中是否存在细菌内毒素。

最后，记录结果。

根据观察结果，记录样品的检验结果，并进行数据分析。

无菌微生物限度检查及方法验证

甘油冷冻管保藏法
• 将待保藏菌接种至平板或琼脂斜面，培养 • 用无菌接种环轻轻刮取菌台，用接种环使细菌充分扩散到预先装于
试管中的无菌蒸馏水中 • 调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管 • 向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到
10%甘油菌悬液。 • 轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装于无菌小试管。 • 制好的甘油冷冻管最好在-30℃条件下贮存。
•建立无菌室使用登记册
•使用日期，时间，使用人，设备运转状况，温、湿度，洁净度状况（沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数），报修原因，报修结果，清洁工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手），消毒液名称等
微生物实验室的质量管理
实验室使用管理
1. 每天工作前用消毒液消毒工作台，开紫外灯（最少半小时）进行空气消毒，每月定期做彻底清洁工作，适当时用消毒剂进行熏蒸。
• 将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为“一代”。
冷冻真空干燥保藏法
主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因冻结可使晶型细致，不致损伤活菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内的冰晶液体升华，水气迅速被真空抽走，冰晶型的菌液很快变成疏松的干燥固体物，最后在真空状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在很长时间内菌种仍可维持活力不变。
•应定期更换消毒剂品种，按标准准确配制。
微生物实验室的质量管理
一、菌种的保存与管理
菌种名称：金黄色葡萄球菌
1. 菌种—特殊的标准品应保持基生长特性和减少污染，是微生物实验结果一致性的重要保证。
2. 制定菌种保藏管理制度
菌种系列号：[CMCC(B)26003]

无菌、微生物限度检查及方法验证

01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上，观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收集滤膜上的微生物，再进行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物中的微生物，再进行培养。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验证实验的设计、实验步骤、数据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基，以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其可靠性。
0义与目的

中国药典2020无菌检查法

中国药典2020无菌检查法【原创版】目录1.概述2.检查法内容3.实施方法4.注意事项5.结论正文1.概述《中国药典 2020》是我国药品行业的权威标准，对药品的研发、生产、质量控制以及药品的审批上市等环节具有重要的指导意义。

其中，无菌检查法是药品质量控制中至关重要的一环，它关乎到药品的安全性和有效性。

本文将对《中国药典 2020》中的无菌检查法进行详细解读。

2.检查法内容无菌检查法主要包括以下内容：（1）检查原理：通过检测样品中微生物的数量，判断样品是否符合无菌要求。

（2）检查方法：包括直接涂片法、薄膜过滤法等。

（3）检查标准：根据药品的类型和用途，规定了不同的无菌标准。

例如，注射剂要求无菌，而口服制剂则要求微生物限度符合标准。

3.实施方法在实施无菌检查时，需要遵循以下步骤：（1）样品的采集和处理：采集样品，进行适当的处理，如灭菌、稀释等，以保证检查结果的准确性。

（2）检查操作：根据选定的检查方法，进行无菌检查。

例如，直接涂片法是将样品涂抹在培养基上，观察培养基上是否有微生物生长；薄膜过滤法是将样品通过薄膜过滤器，然后将滤膜在培养基上进行培养，观察培养基上是否有微生物生长。

（3）结果判定：根据检查结果，判断样品是否符合无菌要求。

4.注意事项在进行无菌检查时，需要注意以下几点：（1）采样：采样应具有代表性，以保证检查结果的准确性。

（2）器具：检查过程中使用的器具应严格灭菌，防止外源性微生物的污染。

（3）环境：检查环境应符合无菌要求，避免环境中的微生物对检查结果的影响。

（4）结果判定：结果判定应严格按照标准进行，避免主观判断导致的误差。

5.结论无菌检查法是药品质量控制中至关重要的一环，对保证药品的安全性和有效性具有重要意义。

《中国药典 2020》对无菌检查法进行了详细的规定，为药品企业和研究机构提供了明确的指导。

新版《中国药典》中关于无菌检查法的要点

一、概述新版《我国药典》是我国药品质量标准的权威参考书，对药品的生产、质量控制和使用起着重要的指导作用。

其中，无菌检查法作为一项关乎药品安全的重要检验方法，在新版《我国药典》中有着详细的规定和要求。

本文将针对新版《我国药典》中关于无菌检查法的要点进行分析和总结，以帮助广大药品生产企业和相关从业人员更好地遵循新版《我国药典》的要求，确保药品的质量和安全。

二、无菌检查法的定义和原理1. 无菌检查法是指通过一系列的操作和文化方法，检验药品制剂和原料是否受到微生物污染的方法。

其原理在于通过适当的培养基和环境条件，培养并鉴定出可能存在的微生物，从而判断药品的无菌性。

三、新版《我国药典》对无菌检查法的要求1. 无菌检查法的适用范围：新版《我国药典》详细规定了无菌检查法在药品制剂和原料中的适用范围，包括但不限于针剂、眼用制剂、无菌粉针剂等。

2. 无菌检查的方法和步骤：新版《我国药典》对无菌检查的方法和步骤做了具体的规定，包括样品处理、接种培养和培养条件等。

其中，对于各类制剂和原料的不同，还有相应的特殊处理和要求。

3. 无菌检查的检测指标：新版《我国药典》列出了无菌检查的检测指标，包括菌落总数、大肠杆菌、假单胞菌等。

对于不同的药品制剂和原料，还有相应的特殊微生物指标。

4. 无菌检查的结果判定：新版《我国药典》对无菌检查的结果判定做了明确的规定，包括阴性对照、阳性对照、样品处理和培养条件等。

针对不同情况下的结果判定，需要做出相应的处理和记录。

四、新版《我国药典》无菌检查法的实施和注意事项1. 实施要求：新版《我国药典》对无菌检查法的实施做了明确的要求，包括测试环境、培养基的选择、试验设备的保养和校准等。

对从业人员的要求也有相应的规定，包括岗前培训、操作规程和个人卫生等。

2. 质量控制：新版《我国药典》要求药品生产企业建立健全的质量控制体系，对无菌检查法的实施进行全程跟踪和记录。

并对不符合要求的样品做出相应的处理和报告。

中国药典2005版无菌检查和微生物限度检查 PPT课件

1、样品：红霉素软膏批号309315 生产厂家某药业有限公司，地新康糊批号129 某医院
2、薄膜过滤法：取供试品10g，加至20ml十四烷酸异丙酯（必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量），充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取后，静置使油水明显分层，取其水层为1：10的供试液
中国药典2005版无菌检查和微生物限度检查方法的验证试验
中检所特玉香
验证试验
一、目的：确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性二、内容：细菌、霉菌及酵母菌数测定（即：对7株阳性对
照实验菌株的回收率逐一进行验证）三、菌种：枯草杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、金
黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]、大肠杆菌（Escherichia coli）[CMCC(F) 44102]、白色念珠菌 (Candida a lbicans )[CMCC(F ) 98001]、黑曲霉菌 (Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(F) 10104]、生孢梭菌 Clostridum sporogens[CMCC(F) 6494]）四、方法：中国药典2005版微生物限度检查法方法验证实验五、方法验证：细菌、霉菌酵母菌数测定，至少应进行3次独立的平行实验，每次平行实验回收率逐均应在70%以上
阳性对照菌计数结果表
药品微生物限度检查方法验证试验记录
谢谢！
3、取供试液1ml（相当于样品1g，1ml）注入开放式滤器，用冲洗液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，消除抗菌作用后，取出滤膜贴于规定的琼脂平板，置规定温度培养24-72小时，逐日观察结果

微生物限度与无菌-内毒素区别

；’.微生物限度-无菌-内毒素区别与联系微生物检测基本就这3项了。

微生物限度：用营养琼脂、玫瑰红钠培养。

洁净度中等操作台内进行（B级)无菌：硫乙醇酸盐、改良马丁在无菌套筒里操作并培养。

洁净度要求较高(A级）内毒素：鲎试剂稀释不同浓度来判定。

洁净度要求不高，D级情况下即可。

我的理解微生物泛指细菌和霉菌酵母菌等等、应该是包罗万象，各种杂菌都有无菌则也是各种杂菌与微生物限度检测的微生物有什么区别？内毒素是一种热源，服用没什么关系，在注射后容易导致人体发热。

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。

脂多糖对宿主是有毒性的。

内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。

耐高温比如说注射液产品用气接触产品，他应该用滤器过滤其他吧。

用膜直径改用0.45（过滤）的好还是0.22（除菌）的好？滤膜泡点肯定要做的，高风险产品应该要最少2层滤膜吧。

用了这滤膜可以不用检这3项还是要检其中项目？而且有的企业只是一年验证一下，不对气体日常可行吗？求大神详解3者的联系与区别，各什么时候需要检这3项及为什么。

答：微生物限度针对非无菌产品无菌和内毒素针对无菌产品。

微生物限度，无菌检验，内毒素检验均为供试品安全性检测。

主要区别是微生物限度，无菌检验是检验活的微生物方法，内毒素检验可以检验死去的微生物中内毒素含量。

什么时候选用不同的检验方法，主要参见药典要求，例如口服制剂选择微生物限度，注射剂和眼用制剂选择无菌检验，注射剂也需要做内毒素检验。

选择不同实验方法主要依据是供试品生物风险级别和供试品用途。

例如纯化水检验中不需做内毒素实验，注射用水检验中不需做无菌实验。

依据是纯化水主要用途为清洗，注射用水用途是配液，所以注射用水的微生物风险更高，需要做内毒素实验，控制风险。

微生物限度和无菌实验用具要求无菌，内毒素实验用具要求去除内毒素。

检验环境要求现行药典微生物限度和无菌实验均是C级下局部A级，微生物限度在超净工作台，无菌实验在生物安全柜内操作。

热源、无菌、细菌内毒素、微生物限度检查

热源、无菌、细菌内毒素、微生物限度检查的关系前面看到过关于无菌和内毒素区别的帖子。

那么请问各位，热源、无菌、细菌内毒素和微生物限度检查究竟有什么区别，又有什么联系呢？本人我在微生物方面比较白，只是觉得这四项都和细菌有关，都需要培养基，都要在无菌台里做…… 汗~~ 其他的实在不知了。

头都大了，希望各位指点迷津，谢谢。

[楼主] | Posted:08-09-09 10:22|珊瑚礁级别: ★会员发帖: 292威望: 6财富: 95注册时间:2008-03-06最后登陆:2010-11-25无菌，最终灭菌产品和百级生产非灭菌产品需要检测的项目，一般采用薄膜过滤法；如，粉针剂、大输液产品。

微生物限度，允许结果有菌落，但有限度，是一定范围，一般采用半封闭薄膜过滤法和平皿法。

指非灭菌产品，如口服制剂和食品、外用药。

热源，目前很多品种采用细菌内毒素检测方法代替，简单，成本低。

但必须按照国家标准。

内毒素和热源一般是大输液产品的检测项目。

想了解很多，应该多看看专业书籍啊[1 楼] | Posted:08-09-09 12:21|洲际捣蛋级别: 论坛版主发帖: 2500威望: 315财富: 42注册时间:2008-03-15最后登陆:2010-11-08热原---不需要培养基兔法看药典就知道是怎么回事了细菌内毒素----不需要培养基一般工作环境也可以做无菌----需要培养基薄膜过滤法直接接种法也可以参照药典微生物限度检查----需要培养基薄膜过滤法梯度稀释图布平板法区别：热原和细菌内毒素检验方法的不同但检验的东西在本质上其实是一样的另外细菌内毒素检查法要比热原检查法灵敏10倍，根据各种药物的特性，规定检查热原还是细菌内毒素。

注册时间:2008-03-10最后登陆:2010-10-11zyb3421060级别: ★会员发帖: 65威望: 3财富: 1注册时间:2008-03-10最后登陆:2010-11-12还不是很明白[5 楼] | Posted:08-12-25 08:26|shabb007级别: ★★会员发帖: 649威望: 20财富: 20注册时间:2007-12-14最后登陆:2010-12-03这么说吧。

中国药典细菌内毒素检测方法

中国药典细菌内毒素检测方法中国药典是我国制定的药品标准，用于规范药品生产和检验。

其中细菌内毒素检测方法是药品检验的重要部分。

细菌内毒素是由细菌合成并分泌的一种生物活性毒素，能够引起多种疾病和副作用。

在药品生产中，内毒素污染是常见的问题，如不及时检测和去除，会对药品质量和使用安全产生不良影响。

中国药典规定了细菌内毒素检测的方法，包括传统的生物学检测和生物化学检测。

生物学检测方法以大肠杆菌为指示菌株，采用荷尔蒙室试验（Limulus amoebocyte lysate test，LAL）或兔脉球凝集试验（Rabbit Pyrogen Test，RPT）进行内毒素检测。

1. 荷尔蒙室试验荷尔蒙室试验基于荷尔蒙蟹（Limulus polyphemus）的血细胞溶解液（LAL）对内毒素的敏感性。

此方法针对内毒素结构中特异的内酰胺基团，其与LAL结合后可引起凝集反应，从而可以测定荷尔蒙蟹血中补体激活产生的凝胶体数量。

荷尔蒙室试验灵敏度高、重复性好、操作简便，被广泛应用于药品、医疗器械等领域中的内毒素检测。

2. 兔脉球凝集试验兔脉球凝集试验使用兔血清进行内毒素检测，通过检测内毒素引起的兔脉球凝集反应来定量测定药物样品中内毒素的含量。

该方法繁琐，操作复杂，需要大量的动物，且灵敏度相对较低，已被荷尔蒙室试验所代替。

生物化学检测方法主要采用比色法、酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等。

比色法根据化学试剂对内毒素的反应特性，利用其变化特征进行检测。

ELISA方法则是基于免疫学原理进行的定量分析方法，可快速、准确地检测内毒素的含量。

中国药典二部无菌检查法

中国药典二部无菌检查法中国药典二部无菌检查法：保障药品质量与安全的关键环节药品作为关系人类健康和生命的特殊商品，其质量与安全至关重要。

为了确保药品的无菌状态，防止微生物污染，中国药典二部明确规定了无菌检查法。

本文将详细介绍中国药典二部无菌检查法的原理、应用及意义，以展现其在保障药品质量与安全领域的重要作用。

一、无菌检查法的原理无菌检查法是通过对药品进行微生物限度的检测，以确保药品在生产、储存、运输和使用过程中不受微生物污染。

这种方法主要依赖于对药品中可能存在的微生物进行培养、分离和鉴定，从而判断药品是否符合无菌要求。

中国药典二部规定的无菌检查法具有高度的敏感性和特异性，能够有效地检测出药品中的微生物，为药品质量与安全提供有力保障。

二、无菌检查法的应用1.药品生产过程监控：在药品生产过程中，无菌检查法被广泛应用于原料、半成品和成品的微生物检测。

通过对生产环境的监控，可以及时发现并消除微生物污染源，确保药品生产过程的无菌状态。

2.药品储存与运输：药品在储存和运输过程中，容易受到微生物的污染。

采用无菌检查法定期对储存和运输环境中的药品进行检测，可以确保药品在流通环节中的无菌状态，保障患者的用药安全。

3.药品质量控制：无菌检查法是药品质量控制的重要手段。

通过定期对药品进行无菌检测，可以及时发现并剔除受污染的药品，确保市场上流通的药品符合质量标准。

三、无菌检查法的意义1.保障患者安全：无菌检查法的有效实施，可以确保药品不受微生物污染，从而降低患者因使用受污染药品而引发感染的风险，保障患者的生命安全和健康。

2.提高药品质量：通过无菌检查法对药品进行严格的质量把控，有助于提高药品的整体质量水平。

这对于提升我国药品在国际市场的竞争力，推动医药产业的可持续发展具有重要意义。

3.推动行业技术进步：无菌检查法的不断发展和完善，推动了医药行业的技术进步。

企业为了满足无菌检查的要求，需要不断提升生产设备的洁净度、优化生产工艺，从而提高药品的生产效率和质量水平。

中国药典无菌检查法

中国药典无菌检查法在当今的医药行业中，无菌检查法是确保药品安全性和有效性的重要手段。

中国药典作为我国药品质量标准的权威法规，对于无菌检查法的规定和实践具有极其重要的指导意义。

本文将详细阐述中国药典中无菌检查法的相关内容，以期为药品生产和质量控制提供有益的参考。

一、中国药典无菌检查法概述中国药典无菌检查法是针对药品中微生物污染进行检查和评估的标准方法。

该方法通过对样品进行适当的处理、培养和观察，以确定样品中是否存在微生物。

无菌检查法对于保证药品质量和安全性具有至关重要的作用，因为微生物污染可能导致药品失效、不良反应甚至危害患者健康。

二、无菌检查法的实践操作1.样品采集与处理在进行无菌检查之前，必须对样品进行适当的采集和处理。

采集的样品应当具有代表性，能够反映药品的整体质量。

处理过程中应避免交叉污染和外界微生物的引入。

2.培养基的选择与制备无菌检查中使用的培养基必须符合中国药典的规定，具有良好的选择性、灵敏度和特异性。

培养基的制备过程需严格按照配方进行，确保质量和稳定性。

3.接种与培养将处理后的样品接种于适宜的培养基中，按照规定的温度和时间进行培养。

接种过程中要保证无菌操作，防止污染。

4.观察与结果判定在规定的培养期结束后，对培养基进行仔细观察，记录任何可见的微生物生长情况。

根据观察结果进行无菌检查的判定，确定药品是否符合无菌要求。

三、无菌检查法的质量控制为确保无菌检查法的准确性和可靠性，必须加强实验室的质量控制。

这包括对实验人员的培训、实验设备的维护与校准、实验环境的监控以及实验过程的规范化和标准化。

同时，应定期进行内部审核和外部质量评估，以确保无菌检查法的执行符合中国药典的要求。

四、结论与展望无菌检查法作为药品质量保证的重要环节，在医药行业中具有举足轻重的地位。

中国药典作为我国药品质量的法规性文件，对于无菌检查法的规定和实践提供了明确的指导。

通过深入理解和严格执行中国药典的相关要求，我们能够更好地保障药品的安全性和有效性，为公众健康事业做出积极贡献。

2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明

中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影响试验结果
20 05年版药典执行以来药品生产企业、科研单位等在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过滤时尽可能减少冲洗量, 冲洗不一定为每次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,

微生物限度和无菌检查法验证

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确定供试品是否有抑菌性、抑什么菌？通过文献资料或申报资料中的药效学资料，了解其对不同细菌的 MIC，参考已经验证过的品种、抗菌药物可根据抗菌谱确定敏感菌、中成药抗菌谱不清楚，至少需选择一株细菌和一株真菌来试验。也可以直接通过验证试验确定抑菌性。试验确定抑菌性的方法：在规定量的供试液中加入试验用微生物 10～100个，如微生物生长良好，说明供试品对该种微生物无抑菌活性。如已用药典规定的各试验菌进行了试验，结果均能生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验。如加入的微生物不生长或生长缓慢，说明供试品有抑菌性；如加入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢，这一种菌就是该样品的敏感菌。
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微生物限度检查中的控制菌检查属定性试验。验证试验应同时设置：（1）目标菌阳性对照管；（2）供试品＋目标菌管；（3）阴性对照管；（4）非目标菌对照管。验证试验和对验证结果的判断：（1）目标菌阳性对照管菌必须生长良好；（2）供试品＋目标菌管生长良好；（3）阴性对照管必须无菌生长；（4）阴性菌对照必须无菌生长。上述试验成立，则说明所用方法已消除或充分减低了供试品的抑菌性；可以按该方法进行该品种的控制菌检查。如出现（2）供试品＋目标菌管生长缓慢、或不生长，则说明供试品仍有抑菌性，应进一步考虑采取适宜的措施以消除其抑菌性，并进行重新验证，直至验证结果中（2）供试品＋目标菌管与（1）目标菌阳性对照管相同，证明已充分消除或有效降低供试品的抑菌性为止。如出现（3）阴性对照管有菌生长；（4）阴性菌对照管有菌生长；则说明试验不成立，所用方法不专属，应寻找原因并重新进行验证试验。
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试验操作方法中国药典2005年版无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，微生物限度检查法包括平皿法和薄膜过滤法。薄膜过滤法采用大取样量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作简单；全封闭的过滤系统，避免了操作过程中外源性细菌的污染，对试验结果可信性影响较小。故尽量采用全封闭的薄膜过滤法。 3、样品的前处理样品的前处理可采用溶解、乳化、破乳、稀释、离心等方法，也可几种方法联用，但需说明采用的处理方法的理由，并证明所用处理方法对各试验菌的生长无影响。对非水溶性的供试品，如果溶解冲洗不完全，会影响试验结果；故应注意使用加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂和稀释剂，或用十四烷酸异丙酯处理油类供试品等。

新版中国药典中关于无菌检查法的要点

新版《中国药典》中关于无菌检查法的要点7月2日，国家药品监督管理局、国家卫生健康委发布公告，正式颁布2020年版《中国药典》，新版药典将于今年12月30日起正式实施。

新版药典对环境监测、无菌检查方法、微生物检测、灭菌验证等都做出了相关要求。

本文结合了《医疗器械无菌试验检查要点指南》中的检查内容，对新版《中国药典》中关于无菌检查法的要点进行了整理，供大家参考。

1、无菌检查要求（1）无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

（2）单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

（3）日常检验需对试验环境进行监测。

注意：“受控环境”主要的关注指标应该是悬浮粒子、浮游菌和沉降菌受控，其他如压差、温湿度等的指标和监测频度也应满足《药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则》的要求。

2、培养基的制备及培养条件（1）培养基可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或商品化的预制培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

（2）制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25°C 、避光的环境下保存，并在经验证的保存期内使用。

注意：新版药典将“成品培养基”调整为“商品化的预制培养基”。

新版药典不再强调“非密闭-三周”、“密闭-一年”的规定，便于企业实践掌握；但企业应最好具备稳定的验证过程和结果，以支持封闭条件和保存周期。

3、培养基的适用性检查无菌性检查每批培养基一般随机取不少于 5 支（瓶），置各培养基规定的温度培养14 天，应无菌生长。

注意：应考虑实践中用于无菌性检查培养的试管装灭菌培养基与无菌检验用的三角瓶装培养基在灭菌方法验证时的两种包装的温度、F0等结果。