胰岛素提取分离工艺

目前工业生产中常用的组织捣碎是通过机 械破碎方法而实现的。例如通过刨削机、组 织破碎机等机械设备。
2、细胞破碎 有许多生物活性物质位于细胞内部，在细胞 培养（或发酵）过程中不能分泌到细胞外的培 养液（或发酵液）中。如青霉素酰化酶、碱性 磷脂酶等胞内酶，必须在固液分离之前先将细 胞破碎，使细胞内产物释放到液相中，然后再 进行固液分离。
干燥可获得普通胰岛素，含有2~5%的杂质，包 括胰岛素原、胰岛素二聚体、胰多肽等，层析时有 A、B、C三个峰，C峰才是胰岛素。
4）柱层析 将结晶胰岛素经过凝胶过滤层析，胰岛素纯度达 97%以上，此时在色谱图上仅占一个峰，故称单峰 胰岛素。 经过凝胶过滤层析可获得单峰纯胰岛素，若将 单峰胰岛素再用离子交换层析法进一步纯化，去 除胰岛素原等杂质，使其纯度提高到99%以上。 目前国内不能生产，尚依赖进口。其特点是：纯 度高，副作用极少，生物效价高。
二 固液分离方法—见1.2.3
5）锌沉淀 在收集液中加入4mol氨水调pH值至6.2~6.4， 加入3.6%（V/V）的醋酸锌溶液（此溶液浓度为 20%），在用4mol氨水调pH值至6.0，低温放置 过夜，离心得到沉淀。 6）第三次结晶 第三次等电点结晶，离心收集纯度高的胰岛素 锌盐。
7）干燥 获得白色粉状胰岛素 8）制剂 胰岛素口服液能受胃肠消化酶分解而失效， 因而必须制成注射液：有胰岛素注射液、蛋白 锌胰岛素注射液、精蛋白锌胰岛素注射液等。
五、减压浓缩 吸上层清液至真空蒸发器内，下层用帆布过滤， 沉淀物弃去，滤液并入上清液。清液在30℃以下减 压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04~1.06（约为 原来体积的1/9~1/10）为止。
在这步操作中，主要是用来缩小溶液的体积， 浓缩至一定的浓度，以便于下步的盐析操作。
六、去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅，5分钟内加热至50℃，立即 用冰盐水降温至5℃，静置3-4小时，分离出下层清 液（脂层可回收胰岛素）。调pH值至2.3~2.5，于 20~25℃在搅拌下加入27%（W/V）固体氯化钠，保 温静置数小时，析出之物即为胰岛素粗品。
三、提取
1）pH为2.5~3.0（胰岛素在酸性条件下稳定）
2）乙醇含量为70%左右。（在此浓度下，胰岛素溶 解度比较大，过高会使胰岛素变性） 3）温度为13~15℃（低温，保持胰岛素活性）
四、碱化、酸化
提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH值到 8.0~8.4（温度13~15℃ ）立即进行过滤，除去碱 性杂蛋白质，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至 pH值到3.6~3.8.降温至5℃ 静置4小时以上，使酸 性杂蛋白充分沉淀。 操作注意事项 去除杂碱性蛋白后应立即调溶液的pH值至酸性 （在碱性条件下，胰岛素会散失活性，综合考虑去 除杂蛋白的因素，故应立即调至酸性）
1.2 胰岛素提取分离工艺
1.2.1 胰脏低温保藏 1.2.2 组织捣碎及细胞破碎 1.2.3 提取 一 液固萃取分离法 二 固液分离方法 1.2.4 纯化与精制 一 沉淀法 二 柱层析法 三 浓缩 四 结晶 五 干燥
胰脏冷冻
胰脏刨碎成片
提取 碱化、酸化
精制
去脂、盐析
减压浓缩
一、胰脏冷冻 胰脏在冻结状态下粉碎，有利于细胞膜的破裂 使之提取完全，并可避免蛋白水解酶对胰岛素的破 坏。 二、胰脏刨碎成片 刨碎成片有利于与酸醇提取剂充分接触，增大 提取率。
1.2.3 提取
一 液固萃取分离法 二 固液分离方法
一 液固萃取分离法（浸取）---见1.2.3
胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织 中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性， 因而采用6.8%乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为 2.5~3.0，进行提取，这样就从三个方面抑制了糜蛋 白酶的水解活性：①6.8%的乙醇可以使糜蛋白酶暂 时失活；②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca2+；③ 选用pH2.5~3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上 条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，可以除去 一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。
1.2.1 胰脏低温保藏
1）冷却：使组织温度尽快降到0~4℃范围，而又 不呈冷结状态，这种方法储藏的组织叫冷却组织 2）冷冻：为了达到长期保藏的目的，将胰脏进行 深度冷冻，使组织中大部分水分冻结冰结晶，阻碍 了微生物的活动或生物反应，从而增加了胰脏的储 藏时间。这种方法保藏的胰脏叫冷冻胰脏。
1.2.2 组织捣碎及细胞破碎------1.2.2 1、组织捣碎
பைடு நூலகம்
脂肪加热溶解，密度小，浮在上层液，迅速冷却 将其去除
七、精制 1）第一次结晶 获得较纯的胰岛素，等电点结晶法，离心分离 2）第二次结晶 结晶、离心，同上 3）干燥
生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止 变质易于保存和运输，常需要干燥处理，最常用 的方法是真空干燥和冷冻干燥，某些无活性核酸、 微生物酶制剂和酪蛋白等产品则较多应用喷雾干 燥、气流干燥等直接干燥法。