几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定
（一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。

其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。

定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。

在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。

蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。

其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。

定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。

在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。

1微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）
1.1原理样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤
1.3特点准确度较高，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％；操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h，试剂消耗量大。

，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含量；适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。

2 双缩脲比色法
2.1原理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。

因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。

在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。

其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。

2.2操作方法标准蛋白溶液或样液直接加双缩脲试剂反应30min，即可测定。

先绘制标准曲线，再测定样品
2.3特点灵敏度低1～20mg ，20~30分钟操作简便、呈色稳定性好、试剂单一；测定结果与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关；灵敏度不高，约为1mg，双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

3 福林酚法（Lowry法）
3.1原理蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。

该化合物在750nm有最大吸收峰。

3.2操作方法测定依次加福林酚甲液、乙液后可见光度计750nm测定；先绘制标准曲线、再测定样品。

3.3特点试剂配制略麻烦，但试剂可长期保存；测定灵敏度高，约5mg ，测定时间约40～60分钟，操作简便；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化（测定结果受待测样品蛋白中肽键存在形式及含量的影响）。

4 紫外吸收法
4.1原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。

吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。

此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。

利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

4.2操作方法直接上紫外分光光度计测定，需绘制标准曲线
4.3特点灵敏度50～100mg ，5～10分钟完成，操作十分简便，但结果受样品蛋白品种影响大。

5 考马斯亮蓝法
5.1原理考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。

5.2操作方法直接加考马斯亮蓝试剂反应5min后即可测定；先绘制标准曲线，再测定样品。

5.3特点灵敏度高，约为1～5mg （比Lowry法灵敏4倍），测定时间5～15分钟，操作简便、迅速、干扰物质少、重线性好，但要求样品颜色为无色或浅色，灵敏度高。

（二）蛋白含量的测定方法及步骤
1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）
1.1 试剂
硫酸铜、硫酸钾、硫酸、2%硼酸溶液、混合指示液（1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合；或2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合）、40%氢氧化钠溶液、0.1mol/L盐酸标准溶液。

1.2 仪器
消化架、吸量管、量筒、微量滴定装置、锥形瓶、容量瓶、定氮蒸馏装置
1.3 分析步骤：
1.3.1 消化
精密称取固体样品0.2~2g，半固态2~5g，液体样品10~20mL（约相当于30~40mg氮）于干燥洁净的凯氏烧瓶，加入6g无水K2SO4，0.2g CuSO4，20mL H2SO4。

瓶口放一小漏斗，先小火加热待泡沫停止后加大火（330~400℃），直到溶液澄清透明，再继续加热0.5h~1h。

冷却后加水定容100mL（数次冲洗，使样品溶液全部移入容量瓶）
1.3.2 蒸馏
将2%硼酸溶液10mL放入100mL三角瓶中（接收瓶），加入甲基红混和指示剂2~3滴，此时为紫红色，将冷凝管尖端浸入液面下。

蒸馏装置中的水蒸气发生器装水2/3，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。

准确吸取2.0 mL ～10.0 mL 试样处理液由小玻杯注入反应室，以10 mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。

将10.0 mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯
以防漏气。

夹紧螺旋夹，开始蒸馏。

蒸馏10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1 min。

然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。

1.3.3 滴定
馏出液用标准HCl溶液滴定，直到蓝绿色变为淡紫色。

并将滴定结果用空白试验校正。

1.3.4计算：
蛋白质（%）=（V1-V2）×C×0.0140×F×100/m V3×100%
V1—样品滴定时消耗的标准HCl溶液体积（mL）
V2—空白滴定时消耗的标准HCl溶液体积（mL）
C—标准HCl溶液的摩尔浓度（mol/L）
0.0140—1mL 1mol/lL HCl相当于0.0140g氮
F—氮换算成蛋白质的系数，一般食物为6.25
m—试样的质量（g）
V3—测定时吸取消化液的体积（mL）
2双缩脲法
2.1 试剂
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/mL的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280nm为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。

牛血清清蛋白用H2O 或0.9% NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称取 1.50g硫酸铜（CuSO4.5H2O）和 6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6.4H2O），用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL 10% NaOH溶液，用水稀释到1L，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。

此试剂可长期保存。

若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2.2器材
可见光分光光度计、试管15支、旋涡混合器等。

2.3 操作方法
2.3.1 标准曲线的测定：取7支试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 的10mg/mL 标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。

充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm 处进行比色测定。

用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。

以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

双缩脲标准曲线
y = 0.0332x + 0.121R 2 = 0.9993
0.1
0.2
0.3
0.40.5
0246
81012
蛋白浓度mg/ml 吸光值
图1 双缩脲法测定蛋白质标准曲线
3 福林酚法（Lowry 法）
3.1 试剂
3.1.1试剂甲：50份A 与1份B 混合，即为试剂甲
A 液：10g Na 2CO 3，2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠 （KNaC 4H 4O 6.4H 2O ）。

溶解于500 mL 蒸馏水中。

B 液：0.5g 硫酸铜（CuSO4•5H 2O ）溶解于100mL 蒸馏水中。

3.1.2 试剂乙：
在 2 L 磨口回流瓶中，加入100g 钨酸钠（Na 2WO 4•2H 2O ），25g 钼酸钠（Na 2MoO 4•2H 2O ）及700 mL 蒸馏水，再加50 mL85%磷酸，100 mL 浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150g 硫酸锂（Li 2SO 4），50 mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。

冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。

稀释至1L ，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。

使用时用标准NaOH 滴定，酚酞作指
示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L 左右。

3.1.3 标准蛋白质溶液（250 µg/mL ）：精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水再定容。

3.2 仪器
可见光分光光度计、旋涡混合器、秒表、试管
3.3 分析步骤
3.3.1 标准曲线的测定：取7支大试管，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250µg/mL ）。

用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5 mL 试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。

再逐管加入0.5 mL 试剂乙，同样立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。

然后在室温下放置10分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于750nm 处测定各管中溶液的吸光度值。

以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。

福林酚法测牛血清蛋白含量标准曲线y = 0.0019x R 2 = 0.98890
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
050100150200250300浓度（μg/mL）A 750n m
图2 福林酚法测定蛋白质标准曲线
4 紫外吸收法
4.1 分析步骤
4.1.1绘制标准曲线
取八只试管分别加入0 ml 、0.5 ml 、1.0 ml 、1.5 ml 、2.0 ml 、2.5 ml 、3.0 ml 、4mL 的1mg/mL 牛血清蛋白标准溶液，加水至4 mL ，在280nm 条件下测定其吸光值
紫外法
y = 1.1611x - 0.1694R 2 = 0.9787
-0.20
0.2
0.4
0.6
0.81
1.2
00.20.40.6
0.81 1.2
蛋白浓度（mg）吸光值
图3 紫外法测定蛋白质标准曲线
5 考马斯亮蓝法
5.1 试剂
5.1.1 1mg/mL 牛血清蛋白标准储备液：精密称取0.1g 牛血清蛋白标准品用蒸馏水定容于100mL 容量瓶。

5.1.2 100μg/m L 牛血清蛋白标准工作液液：取10mL 牛血清蛋白标准储备液加水定容至100mL
5.1.3 考马斯亮蓝试剂：取0.1g 考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 质量浓度为0.85 g/mL 的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到1000mL 。

5.2 仪器和设备
试管、移液管、移液枪、可见分光光度计
5.3 分析步骤
5.3.1 标准曲线的绘制
取六只试管分别加入0 mL 、0.1 mL 、0.2 mL 、0.4 mL 、0.6 mL 、0.8 mL 的浓度为100 µg/ mL 牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0 mL 。

然后每只试管加入5.0 mL 考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min ，在紫外-可见分光光度计595nm 处测定吸光值。

以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的浓度（μg/mL ）为横坐标绘制标准曲线。

考马斯亮蓝法
y = 0.0052x + 0.0143R 2 = 0.99580
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
020406080
100120
蛋白浓度（µg/ml）吸光值
图4 考马斯亮蓝法测定蛋白质标准曲线。