双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法ppt课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
.
Frederick Sanger .
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
.
基本原理：
DNA复制 ddNTP的结构 聚丙烯酰胺凝胶
电泳
.
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
.
.
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
.
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加 热入 ，引 退物 ，
带引物的模板单链DNA
.
链延伸---终止反应
苷双 脱 氧 鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双 苷双 苷双 苷脱 脱 脱
氧 氧氧 胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
.
聚丙烯酰胺凝胶电 泳
95℃加热 变性
冰上冷却
点样 开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
.
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
.
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
底物：dNTP 模板：单链DNA
引物：需要
引物的作用：提供3’羟基 末端
.
ddNTP的特点
ddNTP 3’位不是OH，但5’磷酸基 团正常。
DNA聚合酶不 能够区分dNTP 和ddNTP。
ddNTP参入到寡 核苷酸链的3’末端 后，DNA链的延 长会被迫停止。度相当高！能 分离长度达300500个碱基，而 差别仅一个碱基 的同系单链核苷 酸序列。
.
.
Thank you!
.
测序的原理
主讲：氧气yun
.
Frederick Sanger .
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
.
基本原理：
DNA复制 ddNTP的结构 聚丙烯酰胺凝胶
电泳
.
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
.
.
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
.
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加 热入 ，引 退物 ，
带引物的模板单链DNA
.
链延伸---终止反应
苷双 脱 氧 鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双 苷双 苷双 苷脱 脱 脱
氧 氧氧 胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
.
聚丙烯酰胺凝胶电 泳
95℃加热 变性
冰上冷却
点样 开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
.
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
.
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
底物：dNTP 模板：单链DNA
引物：需要
引物的作用：提供3’羟基 末端
.
ddNTP的特点
ddNTP 3’位不是OH，但5’磷酸基 团正常。
DNA聚合酶不 能够区分dNTP 和ddNTP。
ddNTP参入到寡 核苷酸链的3’末端 后，DNA链的延 长会被迫停止。度相当高！能 分离长度达300500个碱基，而 差别仅一个碱基 的同系单链核苷 酸序列。
.
.
Thank you!
.