EM(有效微生物)组成的分类鉴定实验

EM（有效微生物）组成的分类鉴定实验

研究思路：从 EM 原液中取出菌液，在适合不同菌种生长的固体培养基中分别培养分离，分离后的纯菌种接种到液体培养基中进行增殖培养，从而鉴定 EM有效微生物的组成。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种来源

菌种来源：商品用 EM 原露，江西省天意生物技术开发有限公司产品。

1.1.2 培养基

㈠微生物的营养物

微生物需要的营养物质有水、碳素营养源、氮素营养源、无机盐及生长因子。

⑴水是微生物的组分，又是微生物代谢过程中必不可少的溶剂。它有助于营养物质的溶解和吸收，保证细胞内、外各种生物化学反应在溶液中正常进行。

⑵碳源和能源：凡能供给微生物碳素营养的物质，称为碳源。碳源的主要作用是构成微生物细胞的含碳物质（碳架）和供给微生物生长、繁殖及运动所需要的能量。从简单的无机碳化合物到复杂的有机含碳化合物，都可作为碳源。例如，糖类、脂肪、氨基酸、蛋白质、脂肪酸、丙酮酸、柠檬酸、淀粉、纤维素、半纤维素、果胶、木质素、醇类、醛类、烷烃类、芳香族化合物、氰化物（如氰化钾、氰氢酸和丙烯脯）、各种低浓度的染料等。少数微生物还能以 CO2 或 CO3 中的碳素为唯一的或主要的碳源。可见自然界中蕴藏着丰富的碳源。微生物最好的碳源是糖类，尤其是葡萄糖、蔗糖，它们最易被微生物吸收和利用。许多碳源可同时作能源。

微生物细胞中的碳素含量相当高，占干物质质量的 50%左右。可见，微生物对碳素的需求量最大。根据微生物对各种碳素营养物的同化能力的不同，可把微生物分为无机营养微生物和有机营养微生物两种。凡是有光合色素的微生物，例如藻类、光合细菌及原生动物中的植物性鞭毛虫，均属于无机营养微生物。大部分细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、病毒等属于有机营养微生物。无机营养也称无机自养。这一类型的微生物具有完备的酶系统，合成有机物的能力强，CO2、CO 或 CO3 中的碳素为其唯一的碳源，能利用光能或化学能在细胞内合成复杂的有机物，以构成自身的细胞成分。而不需要外界供给现成的有机碳化合物。因此，这类微生物又称自养型微生物。根据能量来源的不同，自养型微生物又分为光能自养型微生物和化能自养型微生物。其中，光能自养微生物能利用阳光（或灯光）作为能源，依靠体内的光合色素，利用 CO2 和 H2O 或 H2S 合成有机物，构成自身细胞物质。而化能自养型微生物不具有光合色素，不能进行光合作用。合成有机物所需要的能量来自于它们氧化 S、H2S、H2、NH3、Fe 等时，通过氧化磷酸化产生的 ATP。CO2 是化能自养微生物的唯一碳源。化能自养微生物有亚硝化细菌、硝化细菌、好氧的硫细菌（硫化细菌和硫磺细菌）及铁细菌。自养微生物有严格自养微生物和兼性自养微生物两种。有机营养微生物也称为异养微生物。这类微生物具有的酶系统不如自养微生物完备，它们只能利用有机碳化合物作为碳素营养的能量来源。糖类、脂肪、蛋白质、有机酸、醇、醛、酮及碳氢化合物、芳香族化合物等都可作为异养微生物的碳素营养。异养微生物有腐生性和寄生性两种，前者占大多数。异养微生物又分光能异养微生物和化能异养微生物。光能异养微生物是以光为能源，以有机物为供氢体，还原 CO2，合成有机物的一类厌氧微生物，也称为有机光合细菌。化能异养微生物是一群依靠氧化有机物产生化学能而获得能量的微生物。它们包括大多数的细菌、放线菌及全部的真菌。混合营养微生物是既可以利用无机碳（CO2、CO 或 CO3 等）作为碳素营养，又可以利用有机碳化合物作为碳素营养，即为兼性自养微生物。例如，氢细菌属（Hydrogenmonas）、贝日阿托氏菌属（Beggiatoa）、发硫菌属（Thiothrix）、亮发菌属（ Leucothrix ）、新型硫杆菌（ Thiobacillius ）、反硝化硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）、上述细菌既可以 S、H2S 为能源，也能以低浓度的乙酸钠、琥珀酸及葡萄糖为能源和碳源。据报导，硝化细菌的某些株能以乙酸为碳源。

⑶氮源：凡是能够供给微生物氮素营养的物质称为氮源。氮源有 N2、NH3、尿素、硫酸铵，硝酸铵、硝酸钠、氨基酸和蛋白质等。氮源的作用是提供微生物合成蛋白质的原料。根据对氮源要求的不同，将微生物分为 4 类。固氮微生物：这类微生物能利用空气中的氮分子（N2）合成自身的氨基酸和蛋白质。如固氮菌、根瘤菌和固氮蓝藻。利用无机氮作为氮源的微生物：能利用氨（NH3）、铵盐（NH4 ）、亚硝酸盐（NO2 ）、硝酸盐（NO3 ）的微生物有亚硝化细菌、硝化细菌、大肠杆菌、产气杆菌、枯草杆菌、铜绿色假单胞菌、放线菌、霉菌、酵母菌及藻类等。需要某种氨基酸作为氮源的微生物：这类微生物叫氨基酸异养微生物。如乳酸细菌、丙酸细菌等。它们不能利用简单的无机氮化合物合成蛋白质，而必须供给某些现成的氨基酸才

能生长繁殖。从分解蛋白质中取得铵盐或氨基酸的微生物：这类微生物如氨化细菌、霉菌、酵母菌及一些腐败细菌，它们都有分解蛋白质的能力，产生 NH3、氨基酸和肽，进而合成细胞蛋白质。

⑷无机盐：无机盐的生理功能包括①构成细胞组分；②构成酶的组分和维持酶的活性；③调节渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等；④供给自养微生物能源。微生物需要的无机盐有磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、碳酸氢盐。这类无机盐中含有钾、钠、钙、镁、铁等元素。其中，微生物对磷和硫的需求量最大。此外，微生物还需要锌、锰、钴、钼、铜、硼、钒、镍等微量元素。微量元素是微生物维持正常生长发育所必需的，包括锌、锰、钴、钼、铜、硼、钒、镍等。它们极微量就可刺激微生物的生命活动。许多微量元素是酶的组分，或是酶的激活剂。微生物对微量元素的需求量极小，一般培养基中微量元素的质量浓度达到 0.1mg/L 就够了。天然有机物一般都含上述微量元素，当用它们配培养基时，不需再添加另外的微量元素。过量的微量元素会引起微生物中毒。单独一种微量元素过量，其毒性更大。

⑸生长因子：微生物在具有上述各种营养物质后仍生长不好，则需供给生长因子。微生物需要的生长因子有 B 族维生素、维生素 C、氨基酸、嘌呤、嘧啶、生物素及烟酸等。氨基酸被吸收后参与合成蛋白质。嘌呤和嘧啶进入细胞后，先转变为核苷和核苷酸，进而参与合成核酸和辅酶。多数异养微生物及自养微生物有合成生长因子的能力。例如，酵母菌能合成核黄素，链霉菌和丙酸杆菌能合成维生素 B12。酵母浸出液、动物肝浸出液和麦芽浸出液含各种生长因子。

㈡微生物的培养基

根据各种微生物的营养要求，将水、碳源、氮源、无机盐及生长因子等物质按一定的比例配制而成的，用以培养微生物的基质，即培养基。按培养基组成物质的性质可以把培养基分为 3 类：

⑴用无机化合物配制而成的培养基叫合成培养基。合成培养基中的各成分是已知结构的纯化学物质（化学制剂）。

⑵用天然有机物配制而成的培养基叫天然培养基。天然培养基中各成分是动物、植物或微生物的提取物。例如麦芽汁来自大麦芽、肉膏来自牛肉、酵母膏来自胰胨（tryptone）和酪胨（Casitone）。蛋白胨是土壤浸出液、豆芽汁、玉米粉、麸皮、牛奶、血清等天然物均可为微生物提供有机的和无机的营养。马铃薯、胡萝卜是天然的固体培养基，用于培养异养微生物。

⑶用天然有机物和无机化合物配制而成的培养基叫复合培养基。硅胶可用于培养自养微生物。根据实验目的和用途的不同，培养基可分为 4 类：基础培养基；由牛肉膏、蛋白胨、氯化钠按一定比例配制而成。pH 碱性，大多数微生物均可在其上生长。选择培养基；利用微生物对化学物质敏感程度的差异，在培养基中加入染料、胆汁酸盐、金属盐类、酸、碱或抗生素等其中的一种，用以抑制非目的微生物的生长并使所要分离的微生物繁殖的培养基。例如，在培养基中加入胆汁酸盐，可以抑制革兰氏阳性菌，有利于革兰氏阴性菌的生长。麦康盖培养基为含胆汁酸盐的糖发酵培养基，用于大肠菌群（革兰氏阴性杆菌）的培养，可使肠道中革兰氏阳性的肠球菌和产气荚膜杆菌受抑制不能生长，从而，大肠杆菌被选择出来。乳糖发酵培养基也是适于大肠菌群生长的选择培养基。鉴别培养基；几种细菌由于对培养基中某一成分的分解能力不同，其菌落通过指示剂显示出不同的颜色而被区分开，这种起鉴别和区分不同细菌作用的培养基，叫鉴别培养基。例如，大肠菌群中的大肠埃希氏菌、枸橼酸盐杆菌、产气杆菌、副大肠杆菌等均能在远藤氏培养基上生长，但它们对乳糖的分解能力不同：前三者能分解乳糖，但分解能力有强有弱，大肠埃希氏菌分解能力最强，菌落呈紫红色或深红色；产气杆菌第三，菌落呈淡红色。副大肠杆菌不能分解乳糖，菌落无色透明。这样，这四种菌被鉴别区分开来。常用的鉴别培养基还有醋酸铅培养基、伊红-蓝美（EMB）培养基等。加富（富集）培养基；由于样品中细菌数量少，或是对营养要求比较苛刻不易培养出来，故用特别的物质或成分促使微生物快速生长。这种用特别物质或成分配制而成的培养基，称为富集培养基。所用的物质有植物（青草或干草）提取液、动物组织提取液、血和血清等。

任何一种培养基均可配制成液体、半固体（凝胶）、固体三种。某种培养基按配方配好后不加凝固剂（如琼脂、明胶、硅胶），即成液体培养基；如果每升培养基中加入 15-30g 琼脂，即成为固体培养基；如果每升培养基中加入 3-5g琼脂即成为半固体培养基。

㈢分离所用的固体培养基组成：

⑴肉膏蛋白胨培养基(培养细菌)牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，琼脂 15-20g，水 1000mL，pH7.0-7.2， 1.05kg/cm2、121.3℃灭菌 20 分钟。

⑵马铃薯葡萄糖培养基（培养酵母菌）马铃薯 40g，葡萄糖 4g，琼脂 3-4g，水 200mL，自然 pH，0.1MPa 灭菌 20分钟。

⑶豆芽汁葡萄糖培养基（培养酵母菌）黄豆芽 10g，葡萄糖 5g，琼脂 1.5-2g，水 100mL，自然 pH，0.1MPa 灭菌 20分钟。

⑷乳酸菌番茄汁培养基（培养乳酸菌）牛肉膏 1g，蛋白胨 1g，酵母膏 1g，葡萄糖 1g，番茄汁 20%，吐温 80 0.05%，碳酸钙 2g，溴甲酚绿 0.01%，琼脂 1.5g，蒸馏水 100mL，pH6.5, 121.3℃灭菌20 分钟。

⑸光合细菌基本培养基 (培养光合细菌）氯化铵 0.1%，碳酸氢钠 0.1%，醋酸钠 0.3%，磷酸二氢钾 0.03%，硫酸镁 0.01%，