原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告第一篇：一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
细胞培养技术员工作总结
细胞培养技术员工作总结总结一细胞培养一.基本理论概论原代培养：也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。
传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。
细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。
（如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。
）细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。
培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。
细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起）二.培养过程及要点（切记无菌操作）（一）工作环境的处理1.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作抬面。
操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2.实验用品以70%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45?角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
吸管口切勿碰到容器瓶口4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Classll）。
(完整版)细胞培养技术练习题.doc
细胞培养技术练习题选择题 1.接种工具灭菌常采用（A） A. 灼烧 B. 高压 C.过滤 D.熏蒸2.具有促进愈伤组织生产的物质是（ B ） A. 维生素 PP B. 维生素 B1 C.维生素 B6 D. 甘氨酸3.微量元素母液的配制浓度（ B ） A.10 倍 B.100 倍 C.1mg/ml D.10mg/ml4.配制 10 倍大量元素母液，所需硝酸铵（ C ） mg A.9000 B.3700 C.16500 D.44005.配制 100 倍有机物母液时，所需维生素B1 ( B )mg A.0.4 B.10 C.100 D.0.16.下列哪种不是组织培养常用的维生素（ A ） A. 维生素 B 2 B. 维生素 B 1 C.维生素 B6 D.维生素 C7.下列哪种激素不属于生长素类（ C ） A.IAA B.IBA C.6-BA D.NAA8.下面哪种是MS 培养基大量元素所用药剂（A） A.硫酸镁 B.硫酸亚铁 C. 硫酸锌 D.硫酸铜填空： 1、组织块的分离方法有机械分散法、剪切分离法、消化分离法。
2、目前，较常用的消化试剂有胰蛋白酶、胶原酶、EDTA 消化液。
3、接种培养瓶的细胞数量一般为5× 105-1× 106/ml。
4、培养细胞的污染一般包括微生物污染、细胞交叉污染、化学物质的污染。
5、细胞冻存时DMSO 常用的浓度为10%的浓度。
1. 体外培养的动物细胞其生长方式主要贴壁生长和悬浮生长两种，分别称为贴壁型细胞和悬浮型细胞。
体外培养的动物细胞其生长方式以贴附生长为主。
2. 贴壁生长的体外培养动物细胞，按形态来分，大体分为成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形细胞型四种类型，最常见的为前两种。
3. 细胞在体外生长时具有一些特点，其中主要是贴附生长、接触抑制和密度依赖性。
4. 培养细胞生命期可分为原代培养期、传代培养期、衰退期三个阶段。
名词解释1、原代培养：原代培养也叫初代培养，是从供体进行细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。
细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。
第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。
一、取材的基本要求.1．取材要注意新鲜和保鲜.2．应严格无菌.3．防止机械损伤.4．去除无用组织和避免干燥.5．应注意组织类型、分化程度、年龄等.6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材.主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。
内脏和实体瘤的取材.内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。
血液细胞的取材.血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。
骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材.严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
动物组织取材.1、鼠胚组织取材.首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
.2、幼鼠胚肾（或肺）取材.幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。
组织细胞培养
组织细胞培养概述组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。
其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。
细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。
器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。
组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。
细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。
（一）体外培养方式的分类体外培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。
传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。
原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。
如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。
由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。
（二）体外培养细胞的分型根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。
1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。
细胞培养技术_第一讲
消化液
(1) 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落
并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。
(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶
克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距 离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。
群体培养（左）和克隆培养（右）
原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集 落形成，细胞围绕中心漩涡状排列﹙×100﹚
原代培养第7天，多个集落形成并融合﹙×100﹚
细胞系：500元/每株
菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送 二次（周一，周五）。
二、细胞的生长条件 细胞的营养
碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素
细胞培养常用液体
水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 抗生素溶液 培养基
近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术， 各国建立细胞库
我国组织培养的发展
20世纪30年代传入我国。
20世纪50年代起步。
20世纪70年代，成为医学和生物学研究 中普遍应用的手段。
细胞培养的优点
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、 生命活动。
2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素） 利用方法：研究技术、记录方法
常用培养器皿及清洗消毒
玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤
细胞培养-原代培养-传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
换液：
全量换液和半量换液
换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态
细胞换液
细胞传代
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
红色表示中性pH 黄色代表酸性pH 紫色表示碱性pH
在一些特殊培养液中不含酚红
酚红
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml
01
细胞原代培养
02
细胞换液与传代
03
细胞冻存与复苏
三、细胞培养基本技术
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
01
碳酸氢钠 2.0 g
02
03
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
04
调节pH值至7.2
现代生物技术概论复习题
现代生物技术概论复习题一、名词解释1、生物技术：也称生物工程，是人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理，按照预先的设计，改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的一门新兴的、综合性的学科。
2、基因组DNA文库：将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为基因组DNA文库。
3、选择标记基因：是指该基因的表达产物对选择剂产生抗性，致使转化细胞不受选择剂影响，能正常生长、发育、分化，从而把转化体选择出来的一类基因。
4、基因和基因组 DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因（gene）。
一个生物体的全部DNA序列称为基因组（genome）5、载体：把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖或表达的工具称为载体。
6、cDNA文库：即由mRNA经过反转录成cDNA,然后来构建文库，构建的文库不包含内含子。
7、转化:外源DNA导入宿主细胞的过程称之为转化。
8、重叠基因：一个基因序列中，含有另一基因的部分或全部序列。
9、基因组文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。
10、细胞工程：以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状,生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。
11、外植体：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。
12、愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。
13、体细胞杂交：（原生质体融合）指在人工控制条件下不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。
14、悬浮培养：是将植物游离细胞或细小的细胞团，在液体培养基中进行培养的方法。
15、原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。
原代细胞培养
大，而且细胞分散效果差。
（二）消化分离法
• 组织消化法是把组织剪切成小块，应用酶的生 化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥 连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状， 再结合机械法（用吸管吹打分散或电磁搅拌） 使细胞团块得以较充分的分散，制成细胞悬液。
1、酶消化分离法
• 常采用胰蛋白酶和胶原酶 （1）胰蛋白酶 • 胰酶是一种胰脏制品，使细胞间质中的蛋白质水解而
使细胞分散。 • 影响胰酶消化细胞能力的因素： • ①细胞类型 • 适于消化细胞间质较少的软组织（肝、肾、胚胎组织、
上皮组织）。 • 对含结缔组织较丰富的组织单用无效（如 乳腺、滑
膜、子宫、肿瘤组织），需与胶原酶合用。 • ②酶的活力：新鲜配制，低温保存
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC) 即外周血中具有单个核的细胞， 包括淋巴细胞和单核细胞
TA）于37℃中作用适当时间 • （4）弃去消化液 倾斜自然沉降或低速离心法 • （5）漂洗 将含有血清、钙、镁的培养基沿瓶
壁缓缓加入，中止消化反应，漂洗2-3次后， 加入完全培养基。 • （6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细 胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
注意事项
• （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、 镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
二、实体组织材料的分离方法
• 实体组织细胞间结合紧密，为了使组织中的细 胞充分分散，形成细胞悬液，可采用：
• （一）机械分散法 • （二）消化分离法
（一）机械分散法
• 适用组织：纤维成分少的软组织。如脑组织，部 分胚胎组织
安立国第二版动物细胞工程思考题参考答案
哺乳动物的克隆方法：胚胎干细胞核移植、胚胎细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植。
第一章绪论课后习题答案1. 动物细胞工程主要有哪些内容？这些技术有何用途？答：1. 组织和细胞培养技术2. 细胞融合与单克隆抗体技术3. 细胞核移植技术4. 胚胎工程技术5. 干细胞技术6. 转基因技术7. 染色体工程细胞工程的应用有：A. 单克隆抗体的应用：疾病诊断与治疗、微量大分子物资的检测、贵重生物活性物的分离与提纯、特殊疾病治疗、与药物交联治疗疾病；B. 转基因技术的应用：建立疾病的动物模型、品种改良和抗病育种、“乳腺生物发应器”、基因代替治疗、异种器官移植、基因功能研究；C. 细胞与组织替代治疗；D. 治疗人类不孕症；E. 优良品种繁育；F. 生产转基因家畜；G. 保护濒危动物。
2.追踪动物细胞工程研究与应用的最新进展，并预测其发展趋势。
第二章细胞培养1、体外培养细胞有哪些类型？其生长特点有什么区别？答：体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。
离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。
有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。
动物细胞培养中，大多数细胞必须贴附在固相表面才能生长，当细胞布满表面后即停止生长。
从生长表面脱落进入液体得细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞称为单层附壁细胞。
贴壁生长的细胞在活体体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有的特征。
按照培养细胞的形态，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞；少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞等，这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察使细胞呈圆形。
由于悬浮生长于培养液中，因此其生存空间大，具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点，易于大规模生产，便于过程的控制。
细胞培养复习题含答案)
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?⑴按生长方式分为二型：粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。
（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。
）⑵可分四型：(1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。
此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。
处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。
细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。
②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。
一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。
③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。
以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。
此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。
底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。
细胞株潜伏期一般为6～24小时。
④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度限制3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.⑴细胞的营养需要：①基本营养物质：氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子。
细胞生物学重点
名词解释：1、原位杂交：在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术，称为原位杂交2、原代培养：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。
因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
3、传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
4、细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。
5、细胞系（Cell Line）：原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。
6、细胞融合（cell fusion）又称细胞杂交（cell hybridization）是指在自然条件下或人工方法（物理，化学，生物等方法）将不同种生物或同种生物不同类型两个或多个真核细胞合并成一个双核或多核细胞的生物学现象和过程。
7、膜骨架：指细胞膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网架结构(meshwork)，它参与维持质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。
它的特点是粘质性高，有较强的抗拉能力。
8、单克隆抗体：来自单个细胞克隆所分泌的抗体分子。
9、电子载体：在电子传递过程中与释放的电子结合并将电子传递下去的物质称为电子载体。
10、内膜系统：细胞内膜系统是在结构、功能、乃至发生上相关的，由膜围绕的细胞器或细胞结构。
主要包括内质网、高尔基体、溶酶体、胞内体和分泌泡等。
11、微粒体：细胞匀浆等人工过程，破碎的内质网形成的近似球形的囊泡12、信号识别颗粒：由六条不同多肽和一个小RNA分子构成的RNP颗粒。
识别并结合从核糖体中合成出来的内质网信号序列，指导新生多肽及核糖体和mRNA附着到内质网膜上。
13、共转移：在细胞质中起始合成后转移到粗面内质网上合成的蛋白质，肽链在粗面内质网膜上边合成边转移到内质网腔中称为共转移。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
药物代谢研究中代谢途径与代谢产物的研究
药物代谢研究中代谢途径与代谢产物的研究药物代谢是指药物在体内的代谢转化过程，代谢途径和代谢产物的研究对于药物的安全性、有效性以及药代动力学分析具有重要的意义。
药物代谢途径和代谢产物的研究可用于药物研发、药效评价以及毒理学研究等领域。
一、药物代谢途径的研究药物代谢通常包括两种途径：氧化代谢和非氧化代谢。
其中，氧化代谢是最主要的代谢途径，由位于内质网上的细胞色素P450酶家族和细胞质中的一些单氧酶等酶催化进行。
非氧化代谢则包括水解、还原、甲基化和酯化等。
药物代谢途径的研究需要通过体外实验以及体内实验进行。
体外实验主要包括原代细胞培养、细胞系培养以及使用微粒体等细胞外系统的分子生物学研究方法。
原代细胞培养是指将从人体中取得的组织或细胞培养到实验室中，原代细胞培养通过体外培养可以模拟体内代谢环境，获得真实的代谢产物，并可以研究代谢途径受到的影响因素。
细胞系培养则是使用培养的细胞系，通过添加化学药物、试剂以及基因干预等方法，模拟药物在细胞内的代谢情况。
微粒体是体外培养的代谢酶体系，其成分主要包括细胞质和内质网，通过原代细胞和细胞系培养来制备，在体外可以进行药物代谢研究。
而体内实验则是基于动物模型或人体志愿者实施的实验，通过血浆或尿液中的代谢产物，分析药物代谢途径状况。
体内实验是药物代谢研究最真实可靠的方法之一，但需要考虑动物模型与人体的差异，同时需要符合伦理学要求。
二、药物代谢产物的研究药物代谢产物是药物在体内代谢转化的结果，其物化性质、产生机制、代谢轨迹和药效评价等方面的研究，对于药物安全性和有效性评价具有重要作用。
药物代谢产物研究主要包括代谢产物的检测和定性、代谢产物的组分分析与结构鉴定以及代谢产物的毒理学评价等。
药物代谢产物的检测与定性可通过质谱分析、核磁共振等技术进行，此外，也可以通过微量质谱分析等技术对代谢产物进行定量分析。
代谢产物的组分分析与结构鉴定则是药物代谢研究中较为重要的一环，常用的技术包括高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）、气相色谱-质谱法（GC-MS）以及核磁共振法（NMR）等。
细胞生物学题库第3章(含答案)
《细胞生物学》题库第三章细胞生物学研究方法一、名词解释1．Resolution2. fluorescence3. Fluorescence microscope4. Phase contrast microscope5. autoradiography6. scanning electron microscopy，SEM7. scanning transmission electron microscopy，STEM8. high-voltage electron microscopy，HVEM9. negative stainning10. shadow casting11. scanning tunneling microscope，STM12.enzyme cytochemistry13. immunofluorescence14. immunoelectron microscopy15. chromosome sorting16. microspectrophotometry17. microfluorometry18. nuclear magnetic resonance，NMR19. cell engineering20. primary culture21. callus，culli22. cell fusion23. monoclonal antibody technique24. micromanipulation25. differential centrifugation26. isodensity centrifugation27. chromatography28. gel filtration chromatography29. affinity chromatography30. gene engineering31. gene cloning32. gene knockout33.karyoplast34.cytoplast35.cell culture36.贴壁生长37.contact inhibition38.mass culture39.clonal culture40. primary culture41.subculture42.单层细胞培养：43.转鼓培养44.primary cell45.subculture cell46.cell strain47.cell line49.clone50.explant二、填空题1. 物质经过紫外线照射后发出荧光的现象可分为两种情况，第一种是，如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光；第二种是，即物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
2实验方法一：材料小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
二：方法（1）原代培养：1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。
5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。
面做好标志，注明细胞、组别及日期。
细胞生物学名词解释集合
1、细胞：是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体；是高度有序的，具有自装配和自组织能力的体系(第一章)2、细胞培养技术(cell culture)即是选用各种最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术3、原代细胞（primary culture cell）：是指从机体取出后立即培养的细胞。
有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。
4、细胞系（cell line）：原代培养物在首次传代成功后所繁殖的细胞群体。
也指可长期连续传代的培养细胞。
5、细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain），也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
6、RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象（第三章）7、细胞质膜(plasma membrane),又称细胞膜(cell membrane)，是指围绕在细胞最外层，由脂质和蛋白质组成的生物膜。
细胞膜：在稳定内环境；物质、能量交换；信息传递中起着很重要的作用。
8、膜骨架:指细胞质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网架结构,它参与维持细胞质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能（第四章）9、信号肽（signal peptide）：是引导新合成肽链转移到内质网上的一段多肽，一般位于新合成肽链的N端，一般16~30个氨基酸残基。
10、信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）：属于一种核糖核蛋白，位于细胞质基质中。
SRP与信号序列结合，导致蛋白质合成暂停。
11、SRP受体（SPR receptor, DP）：是膜的整合蛋白，存在于内质网上，可与SRP特异结合12、移位子（translocon）：由3-4个Sec61蛋白复合体构成的一个类似于油炸圈的结构，每个Sec61蛋白由三条肽链组成。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
原代细胞培养之--培养技术
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。
原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。
原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。
1、组织块培养法
组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。
其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。
其培养方法如下：
(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。
(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。
开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
原代细胞培养－2
2.消化培养法
该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。
某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。
3.悬浮细胞培养法
对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。
4.器官培养
器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。
并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。
器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的
生物调节作用。
体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。
器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。
1. 器官培养的特殊的要求
(1)需要特殊的培养条件因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm。
(2)器官内部细胞需要有足够的氧气渗入常采用以下两种方法：
①将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。
提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5% CO2，以维持pH。
2. 器官培养的方法
(1)将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。
(2)将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。
(3)将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2，如为肝、肾不能大于1mm2。
(4)将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%，培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。
(5)上述器官培养1~3周（每隔2~3天换液一次）后可用于实验和检测。
原代细胞的培养与维持
(一)原代细胞培养
1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)
凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%，有条件的应在37℃ 5% CO2的培养箱中培养，在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果（如空斑）更加明显、准确，待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，即倒去旧液，换入新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。
若用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，可有少量的肌样纤维间质细胞或基质细胞开始贴壁生长，为了利于该贴壁细胞充分贴壁和生长，此时换液应将细胞悬液经低速离心后，按半量换液方式弃去旧液加入新液，然后再将细胞悬液放入原瓶中继续培养，经反复几次换液后，贴壁肌样细胞逐渐形成网状，此时换液可将原悬浮细胞和培养基移入另一新瓶，然后分别补加新鲜培养基(也按半量换液方式分别对半加入新液)继续培养，原瓶的贴壁细胞逐渐长成单层，而新瓶中又会出现二次贴壁细胞，经几次换液也会逐渐长成单层，在此类细胞培养时，培养基中往往需加入少量的维生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（浓度要在20%以上），以利细胞贴壁生长。
2、悬浮细胞的培养
凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。
若作用于试验的短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行培养，细胞浓度可在5～8×109/L范围内，然后进行分瓶试验。
若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢
失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
但千万不能急于传代，一定要待细胞密度较高时才能进行，以防传代失败。
(二)原代细胞的维持
1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。
2、悬浮细胞
凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。
白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。
换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。
半量换液的方法如下：
将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。
若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min 10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。