第八章 核移植技术与动物克隆

治疗性 克隆胚



开展异种动物克隆，拯救濒危动物 培育优良畜种，扩大良种种群 研究生物学基本理论问题
濒危物种 的克隆
CC!
克隆有什么风险？


失败率高 发育过程中的问题 异常的基因表达 端粒的差异
失败率高 • 去核卵细胞与转移的细胞核达不到同步 • 转移进新细胞核的卵细胞可能不分裂或错 误分裂，产生畸形胚胎 • 将胚胎移植到代孕母体子宫中的过程可能 失败 • 怀孕过程可能失败

与干细胞技术结合，开展治疗性克隆
治疗性克隆：指通过核移植技术，构建来源于病人 体细胞的胚胎，待胚胎发育至囊胚阶段后取出内 细胞团，在体外培养胚胎干细胞，然后定向诱导 胚胎干细胞分化成病人所需要的细胞类型，然后 再移植回病人身上。 或通过组织工程构建病人所需要的组织或器 官，移植给病人，来替代或补充病变或受到损伤 的细胞、组织和器官，从而实现对疾病的治疗。 例如治疗帕金森氏病和糖尿病等。

这些成果表明我国在动物体细胞克隆的各项技术 指标已达到国际先进水平，在一些技术方面居国 际领先水平。 在异种克隆方面，我国也有一些领先于国际水平 的方面，例如中科院动物所和西北农林科技大学 都获得大熊猫异质克隆囊胚。将大熊猫的体细胞 核植入去核后的兔卵细胞中，成功地培育出了大 熊猫的早期胚胎。

保护濒危物种
细胞核
去核卵母细胞
核移植重构胚

异种克隆研究面临着许多问题：


如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早 期胚泡发育？ 异种核质能否相容？ 异种重构胚能否着床并进行全程发育等问题。

核移植技术存在的问题

成功率低，1％～5％，畸胎、死胎等问题。 理论研究与技术研究比较，相对滞后。 体细胞克隆后代可能出现老化现象。 核移植技术环节还需完善。
提取细胞核
胚胎移植
母绵羊C
“多莉”
核移植技术的一般操作程序



核受体的处理和制备 核供体的处理和制备 核移植 重组胚的培养 胚胎移植

核受体的准备
核受体：去核卵母细胞 超排卵处理，获得体内成熟的卵母细 胞卵母细胞 来源 收集卵巢，吸取卵丘－卵母细胞复合 体，体外培养成熟



卵母细胞去核


细胞核移植

细胞质内注射法：
用注核针吸取供体核，直接注射进卵母细胞 胞质内。

透明带下注射法：
将供体核注射到透明带与卵母细胞之间的卵 周隙中，用电刺激进行融合。
卵母细胞的激活



受体卵母细胞胞质的激活, 是影响克隆胚胎发育 的关键因素之一。 原理：通过电刺激、钙离子载体等方法，解除卵 母细胞MⅡ期的抑制，转入到继续发育状态。 移核操作后, 电诱导融合的同时, 也可激活卵母 细胞, 但激活率不高。





2000年6月，西北农林科技大学成功获得成年体细 胞克隆山羊，标志着我国动物体细胞克隆技术的 崛起。 2001－2004年，山东莱阳农学院、中科院动 物所、中国农业大学等相继获得几十头体细胞克 隆牛出生。 2003年9月中科院动物所与法国科学家合作，发明 了能够精确控制大鼠卵细胞自发活化的专利技 术，在国际上率先成功克隆出大鼠。
重组细胞
重组胚胎
新个体
核移植技术
克隆羊培育过程
黑面绵羊去 核卵细胞 白面绵羊乳 腺细胞核
细胞核移植
重组细胞 电脉冲刺激 早期胚胎 胚胎移植
另一头绵羊的子宫
妊娠、出生
克隆羊多利
绵羊“多莉” 整个克隆过程如下：
母绵羊A 母绵羊B
乳腺细胞 （体细胞）
未受精的 卵细胞
细胞融合
去核卵细胞 新的卵细胞发育成胚胎
核移植技术的应用

制备转基因克隆动物，进行生物药物生产
克隆技术与基因疗法的结合，使得遗传疾病 治疗成为可能。 例如，为治疗遗传缺陷，可将修改后的基因 导入早期胚胎细胞，使其具备正确的基因，然后 将此正常细胞核移入去核卵母细胞中，再将胚胎 移入母体，即可发育成正常的胎儿。

利用克隆技术可以产生人体所需的内脏器官，用 于器官移植或替换体内衰老及发生病变的器官。
核供体的准备


条件：
核供体细胞具备完整二倍体。 供体核在受体细胞质的作用下，产生细胞分化的 逆转，重新回到发育过程的原点，恢复全能性。 胚胎卵裂球 分类 胚胎干细胞 体细胞


卵裂球分离
获取较大数量的同源性供体核, 是提高细胞 核移植，克隆胚胎效率的重要途径之一。


胚胎发生致密化后, 胚胎细胞间发生紧密连接, 形成桥粒, 使卵裂球分离的技术难度增加, 常导 致其死亡。 致密期前的胚胎比致密期后的胚胎更容易提供供 体核。


体细胞核移植：
体细胞又分为胎儿体细胞和成年体细胞，如胎儿 成纤维细胞、卵丘细胞、颗粒细胞、乳腺上皮细 胞、皮肤成纤维细胞等。 胚胎细胞克隆的应用最普遍，体细胞克隆的意义 最大。 将核供体细胞移入去核卵母细胞；卵母细胞激活 及非侵害性膜融合技术；重组胚的培养及移植技 术。从技术上讲，难度较大的仍属卵母细胞的去 核和核供体细胞移入去核卵母细胞这两个过程
是否完全除去卵母细胞中期染色体，会影响克隆 胚胎的发育能力, 如果去除不完全, 可导致克隆 胚胎染色体的非整倍性, 造成卵裂异常、发育受 阻和胚胎早期死亡等。 常用去核方法有: ①盲吸法: 用微细玻璃管在第一极体下盲吸, 将 第一极体、部分胞质(含中期染色体) 除去。

②半卵法: 在透明带上做一切口, 用微细玻璃管吸 去一半细胞质至另一空透明带内, 即将卵母细胞 分为两半, 然后用Hoechst33342 染色确定不含 染色体的一半为胞质受体。 ③功能性去核法: 使Hoechst3342与卵母细胞DNA 结合后, 用紫外线照射, 使核丧失功能。

细胞克隆：
细胞水平上的克隆。如杂交瘤细胞克隆。 个体克隆：动物（植物）克隆 动物克隆：通过无性繁殖的手段，获得的遗传背 景一致的动物群体。 细胞核移植技术 —— 核心技术 卵裂球培养技术 胚胎分割技术

目前哺乳动物的克隆方法主要有以下几种：
胚胎分割
胚胎细胞核移植
动物克 隆的关 键技术： 核移植
例如正在进行的利用克隆猪提供人类器官的 研究，即是先把引起人类对猪器官免疫排斥反应 的基因敲除后,将人类基因整合到猪细胞的基因组 中，克隆出可供人类器官移植用的带有人类基因 的猪器官。
异种器官移植
可移植器官短缺 猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近 急性免疫排斥反应
基因敲除半乳糖基转移酶
核移植 基因敲除克隆猪 器官移植

采用蛋白酶 K 或链酶蛋白酶一次消化兔16～32细 胞胚的粘蛋白层及透明带, 在无Ca2+-PBS中轻轻 吹打分离卵裂球, 可获得较理想的效果。

卵裂球的分离方法常常导致实验的不稳定性, 影 响细胞核移植克隆胚胎的效率。

胚胎干细胞核移植： 将胚胎原始生殖细胞经过抑制分化培 养，得到具有全能性的细胞系，进行核移 植，得到克隆后代。成功率较高。
核移植技术的分类
供体细胞核的来源
核移植目的
供受体种间关系
胚 胎 干 细 胞 核 移 植
胚 胎 细 胞 核 移 植
体 细 胞 核 移 植
生 殖 性 克 隆
治 疗 性 克 隆
同 种 核 移 植
异 种 核 移 植

胚胎细胞核移植
将一个多细胞胚胎的细胞核, 通过显微手术和细 胞融合的方法, 移植到一个去核卵母细胞中, 构 成新胚胎(克隆胚胎) , 然后移植给受体, 获得与 核供体胚胎基因型相同的后代(克隆动物) 的生物 技术。 具有全能性，以其作为核供体进行核移植较容易 成功。是克隆哺乳动物供核细胞最佳来源。 成功的获得了克隆鼠、克隆羊、克隆猴等。
1 切开卵母细胞透明带
1
2
2 挤出卵母细胞细胞核
3 注入供体细胞核 4 电融合仪融合 5 培养
3
4
5
胚胎移植


受体母畜选择：颜色与供体品种不同，繁殖能力 强、体格稍大的当地品种。 移植部位：输卵管、子宫角 牛克隆胚胎发育至囊胚阶段移植给受体, 妊娠率 可达53.3%. 家兔细胞核移植克隆胚胎的移植妊娠率低(4%～ 10% )
第八章

核移植与动物克隆

克隆 核移植 正确看待克隆 关于克隆人

克隆：用无性方式产生后代群体。是指遗传上完 全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体 的无性繁殖群体 技术水平： 分子克隆(molecular clone)：即DNA克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）

DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物 质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子， 继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基 因的转化子细胞，再进行扩增,提取获得大量同一 DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)。 重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才有意义。 纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克隆. 基因的纯化繁殖就称为基因克隆。



体细胞核移植


是指成体动物细胞核经显微手术和细胞融合的方 法，移植到去核的卵母细胞内，或将体细胞核直 接注入到去核卵母细胞质中, 重新组成胚胎并使 之发育乃至产生子代。 诱导已分化的细胞进入G0期，恢复其全能性。 “血清饥饿法”恢复体细胞核全能性。
供体细 卵母细 胞核 胞去核
两电 细刺 胞激 融使 合
发育过程中的问题
法国国家农业研究院的研究人员在 1999 年就透露， 克隆牛可能出现体态巨大或畸形，迄今，他们只 培育成功了14头牛，另外有150头克隆牛在胚胎孕 育阶段即告流产或在出生后马上死亡。