08 核移植技术与动物克隆

直至此时,核移植所用的供体细胞均为囊 胚阶段以前的胚胎细胞。当时人们普遍认 为，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后 则随着分化而逐渐丧失其全能性。
极体
原核
极体 卵周腔
受精卵
透明带 1. 雌原核与雄原核形成 2. 雌原核与雄原核融合 3. 卵裂开始
卵裂球 4. 2细胞期
内细胞群
5. 4细胞期
6. 8细胞期
人类体细胞核移植技术
历史回顾
2001年，美、意科学家联手展开克隆人的工作。
2001 年 11 月美科学家宣布首次克隆成功了处于早
期阶段的人类胚胎，称其目的是为病人“定制” 2004 年 2 月 11 日，美国 《科学》 杂志宣布， 汉
城国立大学研究小组成功克隆出人类早期胚胎，
出不会诱发排异反应的人体组织器官，用于移植。
（三）周期性孤雌生殖 (cyclical parthenogenesis)：周期性孤雌生殖也称循环性孤雌 生殖。昆虫通常在进行1次或多次孤雌生殖后，再进 行1次两性生殖。这种以两性生殖与孤雌生殖交替的 方式繁殖后代的现象，又称为异态交替(heterogeny) 或世代交替(alternation of generations) 。如棉蚜 从春季到秋末，行孤雌生殖10一20余代，到秋末冬初 则出现雌、雄两性个体，并交配产卵越冬。
蜥蜴
蚜虫
问
题
在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分 化，但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新 恢复到发育的起始状态，再重新发育成其它类型 细胞组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能 性呢？细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？
HANS SPEMANN
1935 Nobel Laureate in Medicine for his discovery of the organizer effect in embryonic development.
•
获得克隆动物的方法
1.胚胎分割 2.孤雌生殖 3.细胞核移植
1.胚胎分割
胚胎分割（embryo splitting）是指采用机 械方法用特制的纤维刀片或玻璃微针将早期 胚胎分割成2等分、4等分或多等分，再移植 给受体母畜，从而获得同卵多仔的一项胚胎 工程技术。
胚胎分割—— 一卵双生
MII
期 卵 母 细 胞
去 核过程
5.装核
将准备好的体细胞放入去核卵母细胞的过程。
将体细胞放入带下
A
B
C
D
E
F
A 显微注射针刺入卵母细胞前 B开始吸取第一极体 C 极体已被吸入注射针 D 去除极体 后的卵母细胞 E 注射供体细胞 F 供体细胞已被注入透明带下
直接注射法
6.细胞融合
细胞融合的方法有： 病毒介导融合 化学融合 电融合
利用电穿孔的原理来使细胞融合。为 使供 / 受体细胞的接触面与电场方向垂直 , 更有利于融合 , 可在待融的供 / 受体复合物 移入两微电极丝所组成的融合小槽内后用 一次交流脉冲或手工排步的方式来达到这 一目的。
卵母细胞与体细胞电融合过程
7.重构卵激活
正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细 胞质中会出现一系列的反应 , 如游离 Ca2+ 浓度增 高、母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降 等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过 这些变化 , 胚胎就不能正常发育。 核移植过程中 的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。
1869-1941 Residence: Germany Affiliation: University of Freiburg im Breisgau
德国胚胎学家Spemann提出通过核移植可以验证不同发育阶段 和不同分化程度的细胞核是否具有全能性。
3.细胞核移植
细胞核移植（nuclear transfer）是指将 早期胚胎细胞、胎儿细胞或成体动物的细胞
目前，激活的方式有电激活、化学激活和注射精子 因子激活三种。 化学激活常用药品有：钙离子载体（A23187 ）、 7% 乙醇、离子霉素、6-DMAPSrCl2
8.重构胚的培养
重构胚移入受体之前的培养方法有体外培养和体 内培养两种方法。 体外培养法相对要简单、方便的多。
目前为大部分核移植所采用。
重构胚体外发育图
3 、通过核移植获得克隆动物，但开始仅限于胚 胎细胞和胎儿细胞的克隆。 4 、 1997 年，克隆羊多莉的诞生，标志着体细胞 克隆的成功。
5 、现有多种体细胞克隆动物诞生，如牛、猪、
老鼠、猫、羊、兔、猫、狗等。
•1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学 • •
家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、 羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究 结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多 种动物的成熟细胞核相结合。 1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物 盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大 熊猫的早期胚胎， 在异种克隆研究领域，目前国际上仅有印度野 牛和欧洲盘羊取得成功。到目前为止应用异种 核移植技术获得的活体后代都来自于亚种间核 移植。 中国首例异体克隆动物———濒危动物北山羊 在新疆乌鲁木齐县六十户乡降生
胚胎分割—— 一卵双生
2.孤雌生殖
孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵子不经
受精，直接发育为个体的繁殖方式。 如：蚜虫、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类
（一）偶发性孤雌生殖 (sporadic parthenogenesis)：偶发性孤 雌生殖是指某些昆虫在正常情况下行两性生殖，但雌成虫偶尔产 出的未受精卵也能发育成新个体的现象。常见的如家蚕、一些毒 蛾和枯叶蛾等。 （二）经常性孤雌生殖 (constant parthenogenesis)：经常性孤 雌生殖也称永久性孤雌生殖。这种生殖方式在某些昆虫中经常出 现，而被视为正常的生殖现象。可分为两种情况 ： 1、在膜翅目的蜜蜂和小蜂总科的-些种类中，雌成虫产下的卵 有受精卵和未受精卵两种，前者发育成雌虫，后者发育成雄虫。 2、有的昆虫在自然情况下，雄虫极少，甚至尚未发现雄虫， 几乎或完全行孤雌生殖，如一些竹节虫、粉虱、蚧、蓟马等。
提出的设想：利用已分化的蛙囊胚细胞核移植
到去核的蛙卵母细胞中，得到了重新发育的结
果，从而证明了不同时期的胚胎细胞核在相同
的卵质中具有重新发育的能力，在特定条件下， 可以恢复其发育的全能性。
1981年，瑞士日内瓦大学的伊尔门泽、美国杰克 逊实验室，首次对小鼠胚胎细胞进行核移植获 得成功。 此后，胚胎细胞的核移植在多种动物上获得了克 隆后代，如绵羊(Willadsen等,1986),牛 (Prather等,1987),兔(Stice等,1988),猪 (Prather等,1989),山羊(张勇等,1991)等。 直到1997年才由 Meng et al成功地克隆出两只 猴,这是灵长类动物的首次被克隆。
显微操作仪（micromanipulator）
胚胎细胞核移植
胚胎细胞核移植 (embryo cell unclear transplantation)是指，将一个早期胚胎 的细胞核移植到去核的卵母细胞中，构建 新合子的生物技术。
胚胎细胞核移植流程图
历史回顾
1938年Spemann提出设想：分化了的细胞核移植 能否指导胚胎发育？ 1952年Briggs和King在两栖动物证实了Spemann
克隆在分子、细胞、个体三个水平上
动物克隆
动物克隆是指通过无性繁殖的手段，从一 个动物细胞获得遗传背景相同的个体群的 过程。 获 得 的 个 体 群 称 为 克 隆 动 物 （ cloned animal）
动物克隆的研究历史
1、最初用胚胎分割的方法获得克隆动物。
2、同卵双生或孤雌生殖的方式获得克隆动物。
至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤 维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上 皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆 后代成功诞生。
多莉的诞生过程
体细胞核移植程序
受体卵母细胞的准备 核供体细胞的准备
去核卵母细胞
细胞周期调控后的体细胞
装核
重构胚的激活 重构胚的培养
移植给代孕动物
目前为止，有三类用于核移植产生了后代
第一类是去除原核的受精卵
第二类是早期胚胎；
第三类即是MⅡ期的卵母细胞。
常用的是MⅡ期的卵母细胞，一般通过超数排卵
和体外源自文库熟培养获得
4.去核的方法
1.盲吸法
2.半卵法
3.荧光引导核法
4.微分干涉显微镜去核法
5.功能性去核法 6.离心去核法 7.末期去核法
盲吸去核法一般将脱去颗粒细胞的卵母细胞用 含7.5ug/ml CB的培养液中清洗3-4遍后移入100ul左 右的上述溶液的液滴中，同时将供体细胞加入液滴 中。石蜡油覆盖后于显微操作仪上用固定针吸住卵 母细胞，用去核针拨动之，使第一极体位于1点位置； 去核针从3点处进针，针尖斜面部分刺入卵泡内，吸 出第一极体及其下方的1/4-1/3胞质（包括细胞核）； 然后从操作液中吸取形态圆，边缘略粗糙的核供体 细胞，从原针吸口处注入透明带下并轻压透明带。
第八章 克隆动物
克隆羊多利（Dolly）的诞生 1997 年 2 月，英国 Roslin 研究所宣布克隆羊多利 （ Dolly ）的诞生揭示一个全新概念：由成年机 体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同 的新生命个体。 是克隆技术的里程碑。 克隆一词变得家喻户晓
克隆来源于英语“ clone” 或“ cloning” 的音 译，起源于希腊文“ Klone”，原意是用“插 条”繁殖。曾译为无性生殖或无性繁殖.
减数分裂分裂期： 减数分裂期Ⅰ：前期Ⅰ、前中期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末
期Ⅰ和胞质分裂期Ⅰ等6个阶段。
减数分裂期Ⅱ：前期Ⅱ、前中期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ、末
期Ⅱ和胞质分裂期Ⅱ等6个阶段。
前期Ⅰ ： 细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期5个阶段。
核移植的机理
•供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，
在卵母细胞相关因子的作用下，发生 了重编程回复到发育的起点状态。
7. 桑椹胚
胚泡腔
滋养层 8. 囊胚
体细胞核移植技术
-------动物克隆技术的里程碑
体细胞核移植
体细胞核移植技术 (somatic cell unclear transplantation) 是指，将分化程度较高的 体细胞移植入去核的卵母细胞中构建新合子 的生物技术。
历史回顾
1996 年，世界第一例从成年动物细胞克隆出 的哺乳动物绵羊多莉诞生。这个秘密直到 1997年2月才向世人公布。
核移植到去核的卵母细胞中，重新组成重构
胚（reconstructed embryo）或克隆胚
（cloned embryo）并使之发育成成体动物
的过程。
提供细胞核的细胞称为----核供体（donor）
接受细胞核的细胞称为----核受体（recipient）
核供体：胚胎细胞、胎儿细胞、体细胞 （somatic cell） 核受体：早期胚胎细胞、受精卵、MII期卵 母细胞
融合后形成重构胚
1.核供体细胞的准备
常用的体细胞有：
•卵丘细胞 •颗粒细胞 •皮肤成纤维细胞
细胞在体外一般在体外传代8-16次
A 组织块培养的人皮肤成纤维细胞
B 消化培养的人皮肤成纤维细胞
2.细胞周期的调控
1.血清饥饿法
2.Aphidicolin（阿菲迪霉素）法
3.激活卵母细胞法
3.受体细胞准备
1997年7月，苏格兰科学家在实验室内将一个 人类基因导入绵羊体细胞，克隆了带有人 类基因的绵羊“波莉”。
1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由 小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由 克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后 的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。
此后，体细胞核移植技术在牛、山羊、猪等多种动 物获得成功。
•核重编程的过程就是使在体细胞中被
关闭,而在正常胚胎发育中表达的基因 重新被激活的过程.
重编程有三种可能的结果
（1）供核基因组完全没有进行重编程 重构胚很快死亡；
（2）部分重编程,重构胚在不同的发育 阶段死亡 ；
（3）完全重编程,产生正常的克隆动物。
细胞核移植分类
根据核供体细胞来源的不同 1.胚胎细胞核移植 2.胎儿细胞核移植 3.体细胞核移植（SCNT） 根据供体细胞与受体细胞是否来源于同一种动 物又可将其分为 1.同种核移植 2.异种核移植
并从中提取出胚胎干细胞。
由于法律的限制，人的克隆仅限于治疗性克隆。
治疗性克隆
技术途径包括以下几个步骤： 受体卵母细胞； 胞；