三种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的比较
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实验室诊断方法
ＤＯＩ ： １ ０ ． １ １ ６ ５ ５ ／ ｚ ｇ ｙ ｗｙ ｌ ｅ ２ ０１ ５ 个菌落溶入 ５ ０ １ 蒸馏水 ， ９ ９℃干浴 １ ０
ｍｉ ｎ ， ３ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ｍｉ ｎ ， ２ Ｉ ｘ ｌ 上 清液 用 于 ２ ５ ｌ 的Ｐ Ｃ Ｒ反
ＡＴ Ｃ Ｃ２ ９ ２ １ ３ 。
注： 头孢西丁结果可以预测苯唑西林敏感 或者耐药
２ ． １ Ｄ Ｎ Ａ提 取 ： 取冻存实验菌株在 ５ ％的哥 伦 比亚 羊 血 平 板
１ ． ２ 微量 肉汤稀释法 ： 微量肉汤稀释法培养基用阳离子校正
ＭＨ肉汤 （ Ｃ Ａ ＭＨ Ｂ ） ，检测苯唑西林的 ＭＩ Ｃ值需要添加 ２ ％
Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ４ ３ ３ ０ ０ ． ｍ ｅ ｃ Ａ 阳性 （ 抑 菌 圈直 径 ≤２ １ ｍｍ） 。
表 １ 金黄色葡萄球菌对苯唑西林的折点
Ｓ Ｃ Ｃ ｍｅ ｃ 基 因型别 ： 一般来说 ． 甲氧西林耐药 的金黄色葡 萄球菌 都携 带有 ｍ ｅ ｃ Ａ基 因 ，但其 耐药 程度 却不 尽一 致 ， Ｍｅ ｃ Ａ基因位于一个可移动 的元件上 ，被称为金黄色葡萄球
郝 崇华 万艳红 裴世静 张燕军 王淑峰 戎建荣
三种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的比较
用检 测 ｍ ｃ ｅ Ａ基 因的 Ｐ Ｒ扩 增法 、 Ｃ 苯唑 西林 纸片扩散 法 、 头孢 西丁纸 片扩散 法对临床分 离的 ８ ４株金黄 色葡萄球 菌进行 检测并作 比较 。结果 ： 苯唑 西林纸 片扩散 法的敏 感性 、 特异 性分别 为 ９ ，％、５３ ｍ ｃ ７６ ９ ，％， ｅＡ基 因的 Ｐ Ｒ扩增 Ｃ
ｓ ｅ ｉ ｃｔ ｆＰ ｍｐ ｉ ａｉｎ ｏ ｍｅ Ａ ｇ ｎ ｎ ｆ ｘｔ ｉｋ ｄ ｆ ｓｏ ｔ ｏ ｅ ｅ ａ ｌ１ ０ ０ ． Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｐ ｐ ｃｆ ｉ ｏ ＣＲ ａ ｌ ｔ ｔ ｃ ｅ ｅ ａ ｄ Ｃｅ ｉ ｎ ｄ ｓ ｉ ｕ ｉ ｎ ｍｅｈ ｄ ｗ ｒ ｌ ０ ．％ ｉ ｙ ｃ ｏ ’ ｏ ｉ ｆ ｎ ｌ ｓｏ ｓ ＣＲ ａ ｌ ａ ｉｎ ｏ ｃ ｅ ｅ ｉ ｈ ｒ ｃ ｅ ｓｉ ｆ ａ ｔ ｅ ｓｔ ｅ ａ ｄ ｓ ｅ ｉ １ Ｄｉｋ ｄ ｆ ｓｏ ｔｏ ｓ ｓ ｌ ｎ ｎ ｘ ｅ ｓｖ ， ｍｐ ｉ ｔ ｆｍｅ Ａ ｇ ｎ ｓｃ ａ ａ ｔ ｒ ｔ ｏ ｓ ，ｓ ｎ ｉ ｖ ｎ ｐ ｃ ａ ． ｓ ｉ ｕ ｉ ｎ ｍｅ ｈ ｄ ｉ ｉ ｅ ａ ｄ ｉ ｅ ｐ ｎ ｉｅ ｃ ｏ ｉ ｃ ｆ ｉ ｆ ｍｐ Ｃ ｆ ｘｔ ｉｋ ｄ ｆ ｓ ｎ ｍｅ ｈ ｄ ｉ ｍｏ ｅ ｓ ｎ ｉ ｖ ｎ ｐ ｃ ａ ｈ ｎ Ｏｘ ｃｌ ｎ ｄ ｓ ｉ ｕ ｉ ｎ ｔ ｏ ｅ ｉ ｎ ｄ ｓ ｉ ｕ ｉ ｔ ｏ ｓ ｏ ｉ ｏ ｒ ｅ ｓｔ ｅａ ｄ ｓ ｅ ｉ ｌ ａ ａ ｉ ｉ ｉｋ ｄｆ ｓｏ ｓ ｍｅｈ ｄ， ｗｈ ｃ ｓｓ ｉ ｂ ｅｆ ｒ ｉ ｔ ｌ ｆ ｉｈ ｉ ｕｔ ｌ ａ ｏ ｗ ｄ ｐ ｌ ａｉｎ ｉ ｅ ｃｉ ｉａ ａ ｏ ａｏ ｅ ． ｉ ｅａ ｐ ｉ ｔ ｎ ｔ ｌ ｃ ｌｂ ｒ ｔｒ ｓ ｃ ｏ ｈ ｎ ｌ ｉ
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌五种表型检测法的评价
１１ 主要 仪器 与试剂 Ｖ Ｔ Ｋ ３ 全 自动细菌 鉴 ．２ ． Ｅ Ｉ－２
便、 快速 的优势 ， 因此 在临床 上得 到广泛应 用 。为 比
较 和评 价各 种 ＭＲ Ａ 的表 型检测 方法 ， Ｓ 以利 于 临床
定 仪 系 生 物 梅里 埃 公 司 产 品 ：ｉ ｔ ｃ ｒ 光 Ｐ Ｒ Ｌｇ ｃ ｌ 荧 ｈ ｙｅ Ｃ
球 菌 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 质 控 菌 株 Ａ Ｃ ４ ３０ Ｔ Ｃ ３０ 、
Ａ Ｃ ２ ９ ３ Ａ Ｃ ２ ２ ３购 自于 国家 药 品生 物 制 品 Ｔ Ｃ５２、Ｔ Ｃ ９１
检定 所 。 ．
其感染的关键［ 目前 ， Ｒ Ａ的主要检澳方法有表 ２ １ 。 Ｍ Ｓ
型 检 测法 和基 因检 测 法 表 型检 测 法 由 于具 有 简
扩 散 法 （ １ ％ ）Ｖ Ｔ Ｋ仪 器法 （ １ ％）苯 唑 西林 琼 脂 筛 选法 （３ ％ ）苯 唑西 林 纸 片 扩 散 法 （３Ｏ ）特 ９ ． 、 ＩＥ ９ ９． 、 ９ ７． 、 Ｏ ７． ； ％
异 性 以 头 孢 西 丁 纸 片 扩 散 法 、 唑 两林 纸 片扩 散 法 、 苯 苯唑 西 林 琼 脂 筛 选 法 为 最 高 （ 为 １０ ， 均 ０ ￣） 随后 依 次
为 ＶＴ Ｋ仪 器 法 （３ ％ ）头 孢 西 ｒ 脂 筛 选 法ｆ３１ ； ＩＥ ９． 、 ４ 琼 ９ ％）五种 表 型 法 Ｒ Ｃ 曲线 下 面积 按 大 小 依 移 为 ： Ｏ （ 头 孢 西 丁 纸 片 扩 散 法 ０ ５ 、 孢 西 丁 琼 脂 筛 选法 ０ ５ 、 Ｉ ． ９头 ９ ． ２Ｖ ｑ 仪 器 法 ０ ２ 、 唑 西 林 琼 脂 筛 选 法 Ｏ８ ５ ９ ￣Ｋ ， ５苯 ９ ． 、 ６
一种快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的评价
３ ８株 ＭｓＥ 进 行 检 测 并 作 比较 。 结 果 ｓ） 胶体金法检测阴性。结论 胶 体 金 法 可 作 为 ＭＲ Ａ简 便 而 准确 的检 测 方 法 ， 时 也 可 分 析 Ｍ Ｃ Ｓ Ｓ 同 Ｒ Ｎ。 文 献 标 识 码 ： Ａ ｎ ｏｇｅ ｏ ｉ ｌ＆ ｇＴｎｒ Ｈｓ ｔ ， ｎ ｐａ １０３ ， ｈ ａ） ０７０ Ｃ ｉ ｎ
Ｍｅ ｏｓ Ｐ Ｒ ａ ｐｉ ａｏ ｆｈ ｅＡｇｎ ，ｏｏ ａ ｇｌ ｍ ｔｏ ｎ ｉ ｆ ｓｎｍ ｔ ｄ ｉ ｆ ｉ ｅ ｅｏｍ ｄｔ ａａ ｔ ｄ Ｃ ｍ ｌ ｃｔｎｏｔ ｘ ｃ ｅｅ ｃｌｉ （ ｅ ｄａｄｄ ｋｄ ｕｉ ｅ ｏ ｔ ｃ ｏ ｔ ｗ ｒ ｐｒｒ ｅ — ｈ ｉ ｆ ｉ ｅｎ ｌｄ ） ｌ ｄ ｈ ｓｉ ｏ ｈ ｗ ｈ ｅ ｘｉ ｎ ｅ ｆ ｏｎ ｌ ｅ１０ｃｎ ａ ｉ ｌｅ ｏ ．ｕｅｓ（０ Ｓ ｎ Ｓ ）６ ｌｉ ｏ ｔ ．ｈａ ｏ ｉ ｓ（８ＭＲ Ｈ ａ ０Ｍ Ｓ ） ｙ ５ ｌｉ ｌｓ ａ ｓ ｆ ａｒｕ，１０ＭＲ Ａａｄ ０ＭＳＡ ，８ｃｎ ａ ｉ ｌｅ ｏ Ｓ ．ｅｍ ｌ ｃ ５ Ｓ １ ＳＨ ｚ ｉｃ ｏ ｔ Ｓ ５ ｉｃ ｓ ａ ｓ ｌ ｆ ￣ ｕ ｄ ｎ
～
ｌ２ 一 ９８
Ｃｈｎ ＪＬ ｂ Ｄｉｇ Ｄ ｃ ｍｂ ｒ ２ ０ Ｖ ｌ１ Ｎｏ １ ｉ ａ ａ ｎ， ｅ ｅ ｅ ， ０１ ， ｏ ４， ． ２
文 章 编 号 ： ０ — ２ ７２ １）２ ９８ ３ １ ７ ４ ８ （００ １ —１２ —０ ０
三种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的评估
文 章编 号 １０ — ０ ３２０ ）５ ０ ５ — ２ ０ ８ ０ ２ （０ ７０ — ４ １０
【 要 】目的 评 价 Ｐ Ｐ ａ乳 胶 凝 集 法 、 孢 西 丁 纸 片 扩 散 法 和 苯 唑 西 林 纸 片扩 散 法 对 检 测 耐 甲氧 西 摘 Ｂ２ 头
林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ Ｒ Ａ） Ｉ 应用 价值 。 方 法 以 Ｐ Ｒ 法扩 增 ＩｅＡ基 因 为金 标 准 ， 三 种 方 法 对 Ｍ Ｓ 的 临床 Ｃ ｎｃ 用
９ ．％ 结 论 ８ ８
头 孢 两 丁 纸 片扩 散 法 与 Ｐ Ｐ ａ 胶 凝 集 法 一 样 比苯 唑 西 林 纸 片 扩 散 法 能 更 准 确 检 测 Ｂ２ 乳
ＭＲ Ａ． 得 推 广 应 用 Ｓ 值
【 键 词 】耐 甲 氧西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ； 胶 凝 集 法 ； 关 乳 头孢 两 丁 纸 片 扩 散 ； 唑 西 林 纸 片 扩 散 法 苯
Ｓｉｅ ． ＭＲ Ａ ｅ ｃｉ 试 剂 盒 为 法 国 ｌ ｘ ｄ Ｓ Ｄ ｔ ｔ ｎ ｅ ｏ
ｂｏ ６ｉ ｘ公 司产 品 。 ｉＭ ｒ ｕ ｅ 头孢 西 丁 （０ ｇ 、 唑西 林纸 ３ ）苯
片 （ ｔ ） 药敏 试验 所 用培 养 基 Ｍｕ ｌ — ｎｏ （ １ｇ和 ｘ ｅｌ Ｈｉｔ Ｍ— ｅ ｎ Ｈ）琼脂 为 英 国 Ｏ Ｏ Ｄ公 司商 品 Ｐ Ｒ相关 试 剂 Ｘ Ｉ Ｃ 均购 自上 海生物 工程 公 司
Ｉ 分 离 的 １ ５株 金黄 色葡 萄 球 菌 进 行 检 测 并 作 比较 结 果 临床 ０ １ ５株 细 菌 中有 ８ ０ ２株 ｉ ｃ ｎ Ａ基 因 阳性 ． ｅ 头 孢 西 丁 纸 片 扩 散 法 、乳 胶 凝 集 法 与 Ｐ Ｒ 法 结 果 一 致 ．苯 唑 西 林 纸 片扩 散 法 与 Ｐ Ｒ 法 结 果 相 符 合 均 为 Ｃ Ｃ
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 检测(荧光PCR法)
汇报人：XX
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荧光PCR法是一种 基于DN聚合酶链 反应的检测方法
荧光PCR法通过荧 强弱来定 量分析DN序列
荧光PCR法具有高 灵敏度、高特异性 、快速、简便等优 点
灵敏度高：能够检测到极低浓度的MRS 特异性强：能够准确区分MRS和其他细菌 快速简便：操作简便，检测时间短 结果准确：检测结果准确可靠，重复性好
护公众健康
灵敏度高：荧光PCR法具有 较高的灵敏度，能够检测到 极低浓度的MRS
特异性强：荧光PCR法具有 较高的特异性，能够准确区 分MRS和其他细菌
快速高效：荧光PCR法具 有快速高效的特点，能够在 短时间内完成MRS的检测
自动化程度高：荧光PCR法 可以实现自动化操作，提高 检测效率和准确性
荧光PCR法在MRS检测中的前景展望：提高灵敏度和特异性，提高检测准确性和 可靠性，降低检测成本，提高检测效率，推动MRS检测技术的发展。
汇报人：XX
临床诊断：用于检 测MRS感染，快速 准确
科研研究：用于研 究MRS的传播、变 异和耐药性
公共卫生：用于监 测MRS的流行病学 和防控策略
食品检测：用于检 测食品中的MRS污 染，保障食品安全
样本类型：血液、 尿液、痰液等
采集方法：无菌操 作，避免污染
保存条件：低温、 干燥、避光
处理方法：离心、 过滤、稀释等
样品采集：采集患者样本，如血液、痰液等
核酸提取：使用核酸提取试剂盒提取样本中的DN或RN
荧光PCR反应：将提取的核酸与荧光PCR反应试剂混合，进行 PCR反应
荧光PCR检测：使用荧光PCR检测仪检测反应产物，判断样本 中是否存在MRS
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三种筛查方法比较
性 ９ ％． 异性 １ ０ 快速 胶乳检 测法 检测 ＭＲ Ａ 阳性 ４ ８ 特 ０ ％。 Ｓ ９株 ， 阴性 ３ ７株 ， 感性 ９ ．％， 敏 ８ ０ 特异 性 ９ ．％。 ７４ 结论 ： 头孢 西 丁纸 片法 、 快速 胶乳 检测 法与 Ｐ Ｒ法这 个金 标 准有很 高 的一致 性 。 Ｃ 【 关键词１耐 甲氧西林 金黄 色葡萄球 菌 （ ， Ａ） 头孢 西 丁纸 片法 ； 速乳胶 检 测法 ； 唑西 林纸 片法 ； ＭＰＳ ； ． 快 苯 筛查 【 中图分类 号１ ４ ６ ４ Ｒ 【 文献标 识码】 Ｂ 【 文章 编号】 １ ７ — ２ ０（ ０ ８）７ ｂ 一 ０ — ２ ６ ３ ７ １ ２ ０ ０ （ ） １８ ０ １ Ｉ 唑西林 纸 片 法检测 此方 法 为临床 检 验科 常用 方法 。 ． ４苯 ２ 苯 唑西 林含 量为 １ 片， 平皿 中 Ｍ— 琼脂 厚 度 为 ４ｍ 菌 Ｈ ｍ，
２结 果 ２１Ｐ Ｒ 法 ｍｅＡ 基 因检 测 结 果 ． Ｃ ｃ
Hale Waihona Puke １１ ．． １菌株 来 源 实 验菌株 为 ２ ０ ０ ３年 ５月 来本 院微 生 物实 验 室 从临 床标本 分离 出的金 黄 色葡 萄球 菌 ８ ８株 ，标 准 参考 菌 株 Ａ Ｃ ５ ２ Ｔ Ｃ ２ ９ ３来 自军 事 医学科 学 院微 生 物流行 病研 究所 。 １１ ．． ２材料和 试剂 ＭＲ Ａ快 速胶乳 检测 试剂 由英 国 Ｏ ｏｄ公 Ｓ ｘｉ
胶乳 凝 聚法检 测 出 ３ ７株 ， 异 性 为 ９ ．％ 。头 孢 西 丁 纸 片 法 特 ７４ 检测 出敏 感株 ３ ８株 ． 异 性 为 １０ 。 苯 唑 西 林 纸 片 法 检 测 特 ０％
京天坛 药物 生物技 术公 司 。 水解 酪 蛋 白（ Ｈ） Ｍ— 琼脂 为杭 州天 和微 生物试 剂有 限公 司产 品。革 兰 阳性球 菌鉴 定 板条 ， 由温
五种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的比较
摘要 ： 目的 评价 快速 、 准确检测耐 甲氧西林 金黄色 葡萄球 菌 （ ＭＲ Ｓ Ａ） 的方法 。方法 收集上 海市第七 人
民医院临床分离的金黄色葡萄球菌 １ ５ ８株 、 表 皮葡萄球菌 １ ２株 、 溶血葡萄球菌 １ ０株 、 人 葡萄球菌 １ 株， 用 ＭＲ Ｓ Ａ Ｉ Ｄ产 色培养基法 、 苯 唑西林最 低抑菌浓度 （ ＭＩ Ｃ） 法、 头孢 西丁纸片扩散法 、 青霉 素结合 蛋 白（ Ｐ Ｂ Ｐ ２ ａ ） 乳胶凝集 法 ４种方法检测 ＭＲ Ｓ Ａ， 并与荧光 聚合 酶链 反应（ Ｐ Ｃ Ｒ ） 检测 ｍ ｅ ｃ Ａ基 因进行 比较。结果 ＭＲ Ｓ Ａ Ｉ Ｄ产色培养基法检 出 ＭＲ Ｓ Ａ １ ２ ４株 ， 敏感 性和特异性分别为 １ ０ ０ ． ０ ％、 ９ １ ． ９ ％， 头孢西 丁纸片扩 散法检 出 Ｍ Ｒ Ｓ Ａ １ １ ９株 ， 敏感性 和特
较好 的一 致性 。结论 头孢西丁纸片 扩散法 检 出 ＭＲ Ｓ Ａ的敏感性 和特 异性 最高 ， Ｉ Ｄ产 色培养 基法 检测 ＭＲ Ｓ Ａ
比常规方 法报告时间缩短 ２ ４ ｈ ， 是一种快速 、 简便 、 特异性好且 便于临床实验室检测 ＭＲ Ｓ Ａ的方 法。 关键 词 ： 耐 甲氧西林金 黄色 葡萄球菌 ； ｍ ｅ ｃ Ａ基 因 ； 头孢 西丁 ； 产色培养基
Ｓ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｈ Ｐ ｅ ｏ ｐ ｌ ｅ ｓ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ Ｚ ， ａ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ ２ ０ ０ １ ３ ７， ｉ ｎ ａ）
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：０ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｖ ａ ｌ ｕ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ａ ｎ ｄ ａ ｃ ｃ ｕ ｒ ａ ｔ ｅ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｍ ｅ ｔ ｈ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｎ ． ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测及其耐药性研究
１ １ ２ 抗 生 素 纸 片及 抗 生 素 头 孢 西 丁 （ ０ ｇ ． ． ３ ／
片 ） 苯 唑 西 林 纸 片 （ ｇ 片 ） 美 国 Ｂ 公 司 ） 及 １ ／ （ Ｄ 。
拉宁 、 万古 霉素以外 ， 其余抗生 素的耐药率 ， Ｓ ＭＲ Ａ组 均 明显
高 于 ＭＳ Ａ组 （ ＜ ． １ 。 结 论 头 孢 西 丁 纸 片 法 是 筛 选 Ｓ Ｐ ０Ｏ） 和 确 认 ＭＲ Ａ 菌 株 的 一 种 可 靠 、 便 的 方 法 ； Ｓ 为 多 重 Ｓ 简 ＭＲ Ａ 耐药菌株 ， 临床 应加 强 检 测 。 主 题 词 甲氧 西 林 抗 药 性 ； 萄球 菌 ， 黄色 ／ 离 和 提 纯 葡 金 分
维普资讯
安 徽 医科 大 学 学报
Ａ ｔ Ｕ ｉ ｒｔｔ ｅｉ ｎｌ ｎ ｕ ２０ ｃ；１ ５ ｃ ｎ ｅ ｉ ｉ Ｍ ｄｃ ａｉＡ ｈ ｉ ０ ６Ｏ ｔ （ ） ０ ｖ ｓａ ｓ ｉ ｓ ４
‘ ７ ・ ５９
耐 甲氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 测 及 其 耐 药 性 研 究
１ １ １ 菌株 来源 收 集 安 徽 医 科 大学 第 一 附属 医 ． ． 院、 安徽 中医学 院 附属 医 院 、 陵市 人 民医 院 、 北 铜 淮 市人 民医 院及 固镇县 人 民医 院等 １ 医 院 ２ ０ ２家 ０ ５年 临床分 离 的金黄 色 葡萄球 菌 １ ３株 。质 控菌 株 为金 ３
曹鸿 霞 熊 自忠 王 中新 徐 元宏 李 ， 一， ， ，
摘 要 目的 分析耐 甲氧 西林 的金黄 色葡 萄球 菌 （ Ｓ ＭＲ Ａ） 采 用 头 孢 西 丁 、 唑 西 林 纸 片 苯
旭
球菌 ， 与 以往苯 唑西林 纸 片 法 以及 Ｐ Ｒ法 进 行 了 并 Ｃ 比较 ， 同时对 金黄 色 葡萄球 菌 耐药性 进 行检 测 。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型方法的比较
有优缺点 。结论 ： Ｓ ＭＲ Ａ菌株 Ｓ Ｃ ｅ Ｃ ｍ ｃ的地 区性 差异仅通过 一种 方法不能很好地鉴 别 ，Ｃ ｍ ｃ分型研 究应结 ＳＣ ｅ
合 实 际选 择 合 适 的 分 型 方 法 。
关键词 甲氧 西林抗 药性 ； 葡萄球 菌 ， 黄 色； Ｓ Ｃ ｃ 分型 方法 金 Ｃ ｍｅ ；
４Ｃ 止 。 ｃ停 １７ 电 泳 取 Ｐ Ｒ产 物 ７ ． Ｃ
１１ 菌 株 从 临床收集 ３ ． ０株 ＭＲ Ａ作 为分 型方 Ｓ 法 比较 实验 用 菌 株 。 临床 分 离 的金 黄 色 葡 萄球 菌 按 常规方法进行鉴定。根据参考文献 使用双基 因扩 增 法 验 证 ＭＲ Ａ． ｍＢ 和 ｍ ｃ 基 因 双 阳 性 为 Ｓ ｆ ｅ ｅＡ
Ｓ Ｃ ｅ 型 选择 合 适 的 方 法 方 法 ： 别 用 ２ ０ Ｃ ｍ Ｃ分 分 ０ ２年 Ｏｉｅ ａ的 多 重 Ｐ Ｒ 方 法 和 ２ ０ ｌ ｉ ｖｒ Ｃ ０ ５年 Ｚ ａ ｇ的 多重 Ｐ Ｒ ｈｎ Ｃ 方法对 ３ ０株 ＭＲ Ａ 菌株 进 行 Ｓ Ｃ ｃ分 型 。 果 ： 种 分 型 方 法 分 型 效 率 经 统 计 学检 验 差 异 无 显 著 性 ， 各 Ｓ Ｃ ｍｅ 结 两 但
实 用医学 杂志 ２ １ ０ ０年第 ２ ６卷第 ９期
１ ３ ６３
・
检 验 与 临 床 ・
耐 甲氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 Ｓ Ｃ ｃ分 型方 法 的 比较 Ｃ ｍｅ
邵冬华 徐 国 宾
摘要 目的： 比较 两种耐 甲氧 西林 金 黄 色葡萄球 菌（ Ｓ Ｓ Ｃ ｅ ＭＲ Ａ）Ｃ ｍ ｃ分型方 法的分 型效 果 ， ＭＲ Ａ的 为 Ｓ
１ 材料 与 方 法
ＳａｈＰｕ 乳 胶 凝 集 试 剂 购 于 梅 里 埃 公 司 ；Ｃ ｔｐ ｌｓ Ｐ Ｒ扩
耐甲氧西林金葡菌
5 浓度梯度(Etest)法
是1988年AB Biodisk公司推出, 在含20 g/L NaCl的MH琼 脂平板上, 贴上苯唑西林的试条, 菌液调至0.5～1麦氏 浊度, 35°C孵育24 h, 直接读取MIC值。MIC＜2 μg/ml 为敏感, ＞4 μg/ml为耐药。Etest法结合了纸片扩散法 和肉汤稀释法的优点, 长塑料条含有连续的呈指数梯度 变化的苯唑西林(0.016～256 μg/ml), 故在检测低水平 或中等程度耐药的MRSA时结果更为准确。Novak［11］等 报道, 用Alamar法和Etest法对127株MRSA的检测比较, 两者结果相关较高, 用Etest法检测127株MRSA, 其中93 株MIC＞256 μg/ml, 28株在6～256 μg/ml, 检出率达 96%, Etest法具有精确、可靠、稳定性好的特点, 但缺 点是价格昂贵。
2 获得性耐药
是质粒介导的耐药。某些菌株通过耐药因子产生大量β内酰胺酶, 使耐酶青霉素缓慢失活, 表现出耐药性［7］, 多为临界耐药。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的分型 MRSA分型对追踪传染源，研究型别与感染种类，耐药性的关 系有重要作用。国外开展较早的噬菌体分型，将待测菌于肉 汤中，35°C孵育6 h，涂于分型琼脂平板上，待干后将23种 噬菌体注入琼脂平板中的小方格内，再置35°C孵育6 h后移 至室温过夜观察结果。用4组23种噬菌体，将MRSA分为4群， 一般以Ⅰ群为最多［8］，也有报告以Ⅲ群为多。噬菌体分型 结果常不满意，日本小粟 子证实有29.3%菌株不能分型，且 重复性差，不宜用于流行病学调查。质粒图谱分型较为可靠， 可分为18个型，能准确地分析菌株之间的相关性，将流行菌 株与非流行菌株加以区别。国内MRSA广泛存在分子量为1.6 Md、1.8 Md及2.67 Md的质粒，不同地区和不同医院会有特殊 质粒带。免疫印迹分型法将MRSA分为9个型，以B.C型为最常 见，各型含有特征性的分子带，该法比较稳定。染色体限制 性内切酶分析可识别病原体DNA链上特异位点及核苷酸序列， 能从基因水平显示病原体特征，MRSA还可用血清学、凝固酶、 耐药谱等方法分型。现在Southern印迹法也逐渐运用于MRSA 的分型。
三种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的比较
三种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的比较目的评价3种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特异性。
方法临床分离的110株葡萄球菌，经过革兰染色，显色培养基显色培养，触酶试验，VITEK32鉴定后，用试管法、玻片法、商品乳胶血凝法（slidex staph-kit），鉴定葡萄球菌和评价凝固酶试验方法。
3种方法结果不一致的菌株进行重复试验。
用兔血浆试管法作为标准，比较其它凝固酶方法的敏感性、特异性。
结果兔血浆试管法检测到65株阳性菌株，以此为标准，兔血浆玻片法有3株假阳性，人血浆玻片法和乳胶血凝法的假阳性分别为8株和2株。
人血浆试管法的鉴定符合率为100%，其余各种方法的敏感性均为100%，而特异性（兔血浆和人血浆玻片法，乳胶凝集试验）分别为95.6%，88%，和98.5%。
结论人血浆凝固酶试管法敏感性特异性均较高，是鉴定葡萄球菌凝固酶试验的好方法，适合于各基层临床实验室对葡萄球菌的鉴定。
标签：金黄色葡萄球菌；血浆凝固酶；乳胶试剂耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是医院内感染的重要病原菌，然而临床标本中金黄色葡萄球菌鉴定中往往困扰者广大检验工作者，血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要方法之一。
鉴定的准确性直接关系到进一步上机鉴定及药敏试验判断及MRS纸片法筛选判断。
凝固酶分为两种：游离性凝固酶，结合型凝固酶，游离型凝固酶常用试管法鉴定，结合型凝固酶常用玻片法鉴定。
随着现代微生物技术的不断发展，许多医院开始选用法国梅里埃公司生产的葡萄球菌乳胶凝集试剂作为检出金黄色葡萄球菌的常规筛选试验试剂，虽然乳胶试剂盒简便，快速，但是易出现假阳性且价格昂贵。
为寻找一种适合广大基层医院实验室对葡萄球菌鉴定经济，简便的鉴定方法。
本文以兔血浆试管法为标准[1]，对110株临床分离的葡萄球菌凝固酶分别进行兔血浆，人血浆凝固酶试验和乳胶凝集试验。
评价其敏感性，特异性。
1 材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源110株葡萄球菌均来自于我院2011年12月～2013年9月临床分离菌株，保存于-20℃低温冰箱，实验前接种于5%羊血基础平板，取对数生长期菌落进行试验。
三种检测甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌方法的比较
待 测 菌 配成 ０５麦 氏单 位 菌 液 ， 棉 签蘸 取 菌 液后 在 ． 用 管 壁 内轻 压 ， 后 在 含 ６ Ｉ ／ 然 ｇ ｍＬ苯 唑西 林 及 ４ ｘ ％氯 化 钠 的 Ｍ． 琼 脂 平 板 上 接 种 ，接 种 面 积 为 直 径 约 １ Ｈ ５ ｍｍ 的圆形 区域 ， 平 板 ３ ￣空气 培 养 ２ 对 光检 将 ５Ｃ ４ｈ后 查 平板 。 平板 接 种处 出现 一个 以上 的菌落 或细 菌 呈 若 薄 膜 样生 长 ， 为 待测 菌 对 苯唑 西 林耐 药 。标 准 菌 株 视 金 黄 色 葡 萄球 菌 Ａ Ｃ ２２ ３作 为 阴性 质控 ，金 黄 色 Ｔ Ｃ９ １ 葡 萄球 菌 Ｂ ５ 为 阳性 质控 。 １８作 １． Ｌ ． ３ Ａ法 检测 金 黄 色 葡 萄球 菌 Ｐ Ｐ 按 试 剂盒 ３ Ｂ２ 操 作 说 明 进行 ， 对结 果 观 察 时 间 略加 修 改 。 ４滴 但 将 １ 提 取液 加 入 一支 ５ ０ Ｉ 号 ０ Ｌ微 量 离心 管 内 ，用 ５ Ｌ ｘ 接种环挑取 ５ ％羊 血平 板 上 ３ ￣ 过 夜培 养 的待 测 菌 ， ５Ｃ 在 离 心 管 内研 磨 成 浓 菌液 ，在 Ｖ ｒ ｘ 拌 器 上 混匀 ｏｔ 搅 ｅ １ 。将 离 心管 ９ ￣ 热 ３ｍ ｎ 取 出离 心 管 冷却 至 ０Ｓ ５Ｃ加 ｉ， 室 温 ， 入 １ ２号 提 取液 并 于 Ｖ ｒ ｘ搅 拌器 上 混匀 加 滴 ｏｅ ｔ
Ｐ Ｐ Ｂ ２ ，是鉴 定 ＭＲ Ａ最 准确 的方 法 。Ｐ Ｒ技 术对 临 Ｓ Ｃ 床 实验 室技 术 人员 要 求较 高 且 实验 条 件严 格 ， 适 于 不 临床 实 验室 常规 开 展 ，Ａ法 实 验 条件 要 求不 高 ， 作 Ｌ 操 简单 ， 直接 快速 检测 ＭＲ Ａ。 可 Ｓ 本 研究 比较 了苯唑 西林 纸 片 扩散 法 、 Ｓ Ｓ和 Ｌ ＯＡ Ａ 法 检 测 本 院分离 的 ＭＲ Ａ和 甲氧 西 林 敏 感 金 黄 色 葡 Ｓ 萄球 菌 （ Ｓ Ａ） Ｍ Ｓ 的一致 性 ， 报告 如 下 。 现
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三种筛查方法比较
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三种筛查方法比较目的: 以PCR检测的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的mecA基因为金标准，比较耐甲氧西林金葡菌快速胶乳凝聚检测法、头孢西丁纸片法、苯唑西林纸片法三种检验方法在MRSA筛查中的特异性和敏感性。
方法：采用NCCLS 推荐的30 μg头孢西丁纸片法和苯唑西林纸片法，以及快速乳胶法检测。
结果：苯唑西林纸片法检测MRSA阳性47株，阴性36株，敏感性94%，特异性94.7%。
头孢西丁纸片法检测MRSA阳性49株，阴性38株，敏感性98%，特异性100%。
快速胶乳检测法检测MRSA阳性49株，阴性37株，敏感性98.0%，特异性97.4%。
结论：头孢西丁纸片法、快速胶乳检测法与PCR法这个金标准有很高的一致性。
标签：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）；头孢西丁纸片法；快速乳胶检测法；苯唑西林纸片法；筛查耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 的临床院感率不断上升，在世界各地医院都有感染流行，甚至发生暴发流行，几乎在所有使用抗生素的地方都有MRSA 存在，已引起全球范围内的广泛关注[1]。
PCR法检测MRSA特异的青霉素结合蛋白2α（PBP2α）的mecA 基因，是国际公认的金标准，但因为设备、试剂费用高，实验要求严格等因素临床实验室难以常规开展。
本实验通过检测已经经过PCR法检测过的菌株88例，探讨苯唑西林纸片法、头孢西丁纸片法、快速乳胶检测法三种方法的敏感性、特异性和临床实用性。
现报道如下：1 材料与方法1.1 实验材料和试剂1.1.1 菌株来源实验菌株为2003年5月来本院微生物实验室从临床标本分离出的金黄色葡萄球菌88株，标准参考菌株ATCC 25923来自军事医学科学院微生物流行病研究所。
1.1.2 材料和试剂MRSA快速胶乳检测试剂由英国Oxoid公司生产。
头孢西丁纸片（30 μg）、苯唑西林纸片（1 μg）购自北京天坛药物生物技术公司。
水解酪蛋白（M-H）琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司产品。
mrsa定义及判断标准
mrsa定义及判断标准
MRSA（Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus），即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是一种对甲氧西林和其他类似药物具有耐药性的金黄色葡萄球菌菌株。
判断MRSA的标准包括以下几个方面：
1. 临床症状：与常规的金黄色葡萄球菌感染相似，可能包括红肿、疼痛、渗出液等。
但MRSA感染较常规金黄色葡萄球菌感染更难治疗。
2. 细菌培养：从感染部位的样本中进行培养，并鉴定是否为金黄色葡萄球菌。
通过抗生素敏感性试验判断细菌是否耐甲氧西林。
3. 分子生物学检测：通过PCR等分子生物学技术检测细菌的基因，确认是否为MRSA。
4. 抗生素敏感性检测：对细菌进行抗生素敏感性测试，确定其对常用抗生素的耐药性情况。
5. 判断耐药基因：通过检测细菌的耐药基因，确定其是否携带了与甲氧西林耐药相关的基因。
需要注意的是，MRSA的判断需要进行细菌培养和特殊检测方法，不能只依靠临床症状诊断。
ICU耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测结果分析
ｌ℃ ， ２ 。 角 ，电 泳 时 间 ２ ｈ ４ １０ 夹 ０ ，脉 冲 参 数 ：５—
４ｓ ５ ，线 性 条 件 。电泳 结 束 后 ，用 ０５￣ ｍ ． ｐ ／ Ｌ的 ｇ
５ 脉 冲场凝胶 电泳 （Ｆ Ｅ） 菌株 纯 化培 养 后 ， ＰＧ 用 ＣＢ （ Ｓ 细胞 悬 浮液 ） 制备 成 一定 浓度 的菌 悬 液 ，
５ ℃水浴 ，与等体 积 １ ｏ ｇｒ ｅ ０ ％Ｇ ｌ Ａ ａ ｓ 混匀灌 模制 ｄ ｏ
成胶 块 。投 入 细胞破 壁缓 冲溶 液 中 ，经溶 葡萄球 菌 素 Ｌｓｓ ｐｉ （． ｐ ／ Ｌ ７ ｙｏｔ ｈｎ ０５￣ ｍ ）３ ％作用 ２ ａ ｇ ｈ破 除细 胞 壁 ；再 经 Ｃ Ｂ （ 胞 裂 解 液 ） 中 ，蛋 白 酶 Ｋ Ｌ 细 （．ｍｇｍ ）５ ￣ 消 化 过 夜 ；处 理 后 的 胶 块 经 纯 ０ ２ ／ Ｌ ４（ ２ 水 、Ｔｒ—Ｅ Ｔ ｉ ｓ Ｄ Ａ洗 涤后 获得 细 菌 Ｄ Ａ凝 胶 。细 菌 Ｎ 基 因组 Ｄ Ａ利 用 限 制性 内切 酶 Ｓ ａ 酶 于 ３ ℃ 酶 Ｎ ｎ ｉｉ Ｏ 切 过夜 后 ，在 ０５× Ｂ ． Ｔ Ｅ缓 冲液 中 ，脉 冲场 凝 胶 电
Ｇ ｌｖ ｗ染 色． 用 Ｖ ｒａ ｏ 胶 成 像 系 统 读 胶 分 ｏｄｉ ｅ ｅｓＤ ｃ凝 析。
６ ＰＧ Ｆ Ｅ分 型 标 准 按 照 美 国疾 病 控制 和 预 防 中
心 （ Ｄ ）Ｔｎｖｒ Ｃ Ｃ ｅｏｅ 等人 推 荐 方 法 判 读 Ｊ ：酶 切后 图谱完 全一致 定位 同一 型 ，差 异 ３个条 带 以上 者 为
文献标 识码：Ｂ 文章编号 ：１０ ０ ３ ２ １ ）０ ０ ９ ０ ７— ９ １（０ ０ ５— ０ ４—０ ３
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显著的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
耐甲氧西林葡萄球菌临床检测方法评价
辽宁大学学报自然科学版第40卷第3期2013年J oU R N A L oF uA oN I N G U N r vE R sl T YN at u r al Sci enc es Edi t i onV ol_40N o．32013。
耐甲氧西林葡萄球菌临床检测方法评价陈烨+，王蕊，卢红，邓晶晶，刘晶，王洋，刘举(辽宁大学药学院辽宁省新药研发重点实验室，辽宁沈阳110036)摘要：目的评价三种方法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R SA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(M R C N S)的可靠性和临床实用性．方法根据N C C I_s的判定标准，采用m ecA基因PC R扩增法检测临床分离的85株金黄色葡萄球菌和80株凝固酶阴性葡萄球菌，并与苯唑西林琼脂稀释法和头孢西丁纸片扩散法进行比较．结果苯唑西林琼脂稀释法筛选M R SA(M R C N S)的检出率分别93．75％(95．35％)、95．24％(54．05％)；头孢西丁纸片扩散法筛选M R SA(M R C N S)的检出率分别为98．43％(95．35％、)、90．48％(64．86％)．结论对于M R S A的检测，选用PC R扩增法，该法具有快速、灵敏和特异性强的特点，且纸片法与PC R扩增法检测结果符合率很高；对于M R C N S的检测，通过表型法筛选后，最好能得到m eeA基因的确证．关键词：M R SA；琼脂稀释法；纸片扩散法；m e cA基因；PCR中图分类号：R378．1文献标志码：A文章编号：1000-5846(2013)03-0278-06E val uat i on of C l i ni cal Tes t i ng M et hod f or D et eet i on ofM et hi ci H i n-r esi s t ant St aphyl ococcusC H E N Y e+，W A N G R ui，L U H ong，DE N G Ji ng-j i ng，LI U Ji ng，W A N G Y ang，L I U J u(School of Pha r m a c y，L i a oni ng U ni ve r s i t y，N ew D r ug R&D K ey Labor a t or y ofL i a oni ng Pr ovi nc e，S henya ng110036，C hi na)A bs t ract：O bj ect i ve：T o eva l ua t e t he cl i ni cal r el i abi l i t y and appl i cat i on of t he t hr ee m et hodsf or det ect i on of m et hi ci l l i n r es i s t ant st aph)7l oc occus a ur eus(I V l R S A)a nd m et hi ci l l i n r es i s t antc oa gul a se negat i ve s t aphyl ococci(M R C N S)．M et hods：A ccor di ng t o t he st andard of N C C LS，at ot a l of85s t r ai ns of SA U and80s t r ai ns of C N S w hi ch w e r e i s ol at ed f r om cl i ni cal s peci m ens w erede ce t e d by m ecA PC R as say，and com p ar i ng w i t h oxaci l l i n aga r di l u t i on m et hod and cef oxi f i ndi sks di f f usi o n m et hod．R es ul t s：The s ens i t i vi t y and s peci fi ci ty of oxaci l l i n agar di l u t i on m et hodf or det ect i ng M R SA(M R C N S)w er e93．75％(95．35％)and95．24％(54．05％)respect i vel y．收稿日期：2013—03—29基金项目：国家“十二五”规划“重大新药创制”重大科技专项资助项目(2011Z X09102一007—02)；辽宁大学“211工程”三期建设重点资助项目+作者简介：陈烨(1965一)，男，汉族，沈阳人，副研究员，硕士生导师，主要从事抗肿瘤药物、抗微生物病原菌药物的研制，Tcl：139********E—m ai l：．s y-che nye@163．t om ．第3期陈烨，等：耐甲氧西林葡萄球菌临床检测方法评价279T he s ens i t i vi t y and s peci f i ci t y of cef oxi t i n di sk di f f usi o n f or det ect i ng M R S A(M R C N S)w er e 98．43％(95．35％、)and90．48％(64．86％)respect i vel y．Concl us i on：Sel ect ed PC R m et hod f or det ect i on of M R SA，beca us e i t s f as t，s ens i t i vi t y and speci f i cit y，and hi曲l oadi ng r at e of t he di s k di f f usi o n m et hod．D et ect i on of M R C N S，af t er phe not ypi c s cr eeni ng，i t i s bes t t O be concl usi vee vi de nce Of t he m ecA ge ne．K ey w or ds：M R SA；agar di l u t i on m et hod；di sk di f f usi o n m et hod；m ecA gene；PC R自从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R SA)于1961年首次被发现后，其在医院感染患者中所占的比例逐年攀升，目前已被列为临床三大感染源之一…．在美国，临床分离的金葡菌中M R SA的比例从1975年的2．4％上升到2003年的59．5％【2'31；目前美国分离率约50％～70％[4J；而我国，2001年M R SA的分离率为37．4％，2008年达到62．3％”J．同时，由耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(M RC N S)引起的导管相关感染以及与置人人工假体引起的相关感染的发病率逐年上升．因此，快速准确的检测M R SA和M R C N S对于医院预防和治疗由这两种耐药菌引起的感染具有现实意义．本实验采用苯唑西林琼脂稀释法、头孢西丁药敏纸片法和PC R扩增法对临床分离的85株金黄色葡萄球菌和80株凝固酶阴性葡萄球菌进行测定，并对实验结果进行了评价．1仪器与材料1．1仪器设备PCR扩增仪(德国ana l yt i k l er a com pany)；琼脂糖凝胶电泳(北京君意东方电泳设备有限公司，JY一600C)；凝胶成像分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司，J Y04S一3C)；T G L一20M高速台式冷冻离心机(湘潭湘仪仪器有限公司)．1．2菌株及来源85株金黄色葡萄球菌和80株凝固酶阴性葡萄球菌，来自中国人民解放军沈阳军区总医院临床分离的菌株；标准菌株金葡菌(A T C C29213)和金葡菌(A TC C25923)作为阴性对照，M R SA(A TC C 43300)作为阳性对照，均购自卫生部临床检验中心．1．3主要试剂头孢西丁(30pg／片)和M H培养基购自北京天坛生物制品公司；苯唑西林购自中国药品生物制品检定所；PC R试剂：Taq酶、10X buf f er、dN TPs为T aK aR a公司产品；D N A M a r ke r为北京天根生化科技有限公司产品；溶菌酶、蛋白酶K、％s(pH=8．0)、ED TA、SD S、酚混合液购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司．1．4寡核苷酸引物m ec A基因扩增引物：上游引物pl：5'-TG G C T AT C GT G T C A C恕盯C G一3’，下游引物p2：5’一C T GG A AC T T G，丌G A G C A G A G-3’由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成．2实验方法2．1菌悬液制备挑取单个菌落于M H培养基中，于37℃恒温孵育16—18h，用生理盐水稀释菌悬液至终浓度为280辽宁大学学报自然科学版2013正0．5麦氏比浊度(1．5×108cf u／m L)．2．2琼脂稀释法将苯唑西林倍比稀释成12个浓度，浓度范围在1280—0．6仙g／m L．将稀释好的不同浓度的苯唑西林分别再与灭菌的M H琼脂液以1：9的比例混匀．用多头接种器将菌液(约107c f u／m L)接种在培养基上，每接种点细菌量为104cf u／m L，置35℃恒温箱中孵育16～24h后菌落生长被完全抑制的最低浓度为苯唑西林对此菌的M I C根据N C C LS的M I C常规标准的规定，对于金黄色葡萄球菌，苯唑西林M I C≤2斗g／m L为耐药，M I C≥4斗g／m L为敏感；对于凝固酶阴性葡萄球，苯唑西林M I C≤0．251乩g／m L为耐药，M IC，>0．5“g／m L为敏感．2．3纸片扩散法用无菌棉签蘸取菌悬液，挤出多余水分后均匀涂布于含4％N a C l的琼脂表面，然后将含30斗g 头孢西丁的药敏纸片贴于其上，每株菌涂两个琼脂平板，置35℃恒温箱中孵育24h后记录抑菌圈直径．根据N C C LS判定标准N o：对于金黄色葡萄球菌，头孢西丁抑菌圈直径妒≤19m／n为耐药，妒≥20m m为敏感；对于凝固酶阴性葡萄球菌，头孢西丁抑菌圈直径t p，<24m l T l为耐药，q够>25t oni为敏感．2．4PC R扩增法2．4．1D N A模板的制备取0．5麦氏浊度的菌悬液1m L置于E P管中，以2500r／m i n的转速离心15m i n，弃去上清液，加入20斗g／m L溶菌酶100I xL，振荡，在37℃水浴中放置30m i n；于15000r／m i n(4℃)离心10m i l l；弃上清，加入1m g／m L蛋白酶K40止、T E一10％SD S100止，在55℃水浴中放置1h，煮沸5m i n；加入生理盐水300止、N aCl溶液(5m oV L)5止和400w E酚的混合液(酚一氯仿一异戊醇，体积比=25：24：1)，均匀混合，于15000r／m i n离心10m i n．取400止水相，加l m L冷无水乙醇，再于15000r／m i n离心10m i n，弃去上清液，加75％酒精400止，洗涤沉淀1次，10000r／m i n离心5m i n．干燥后加入50止TE缓冲溶液，即制得细菌的D N A模板【6]．2．4．2PC R扩增扩增反应的总体积为25止：10×buf f e r(20m M M92+)2．5止、dN TPs(10m m oV L)2止、引物1和引物2(10斗m ol／L)各1止、T aq酶(2U／止)1．5斗L、模板2曲、无菌双蒸水15止．扩增参数：94℃预变性5m i n，94℃变性30S，52．5℃退火30S，72oC退火100s，30个循环后，72℃再延伸5m i n，14oC终止反应．2．4．3扩增产物的鉴定取扩增产物10“L，加入5止l oadi ng buf fer染色，经1．5％琼脂糖进行电泳，100V电压下电泳1h，溴化乙锭染色后于紫外凝胶成像仪上观察结果．3结果3．1三种方法的阳性检出率采用苯唑西林琼脂稀释法、头孢西丁纸片扩散法、PC R扩增法检测了85株金黄色葡菌球菌和80株凝固酶阴性葡萄球菌中的M R SA和M R C N S，其阳性检测结果见表1．结果显示，三种方法检出M R S A的阳性率并无差别；而P C R扩增法检出M R C N S的阳性率低于其他两种方法，两种表型法检测M RC N S的阳性率无差别，但阳性率明显低于PC R扩增法．第3期陈烨，等：耐甲氧西林葡萄球菌临床检测方法评价281表1M R SA和M R C N S的阳性检出率苯唑西林琼脂稀释法与PC R扩增法相比，检测M RSA的检出率分别为93．．75％、95．24％、94．12％；检测M R C N S的检出率分别为95．35％、54．05％、77．25％．实验结果见表2．此种方法检测M R SA的灵敏性和特异性较高；检测M R CN S的敏感性较高，但特异性较低．3．2琼脂稀释法与PC R扩增法比较M R SA和M R C N S的m ec A基因扩增产物一致，即在分子量为310bp处出现D N A条带，如图1．’I■。
金黄色葡萄球菌根据其对甲氧西林的耐药性可分为MRSA
金黄色葡萄球菌根据其对甲氧西林的耐药性可分为MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和MSSA(甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌)。
自从19世纪60年代发现第一株MRSA以来，MRSA在全球的分离率逐年升高。
菌株分型是医院获得性感染的流行病学研究的重要方法之一，在过去的五年里，细菌分型的方法有了突飞猛进的发展，我们就目前常用于MRSA分子分型的技术进行比较。
1 SCCmec分型1.1 SCCmec的定义和结构SCCmec是一个可移动的复合体结构，大小从21~67 kb不等，可以整个地从染色体中自发剔除，也可从一个菌细胞转移整合到另一个菌细胞染色体中。
根据目前的研究结果推测：SCC是一个基因交换的载体，SCCmec只是SCC家族中携带有mecA 基因的一个特例，?MRSA的产生，是对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin-suseeptible staphylococcus aureus MSSA)通过SCC从其他菌株中获得mecA 的结果，它同样可以使其他抗生素耐药基因在葡萄球菌间传递，这可能是MRSA容易获得多重耐药的根本原因。
SCCmec的结构复杂，因外来基因整合数量不同其大小也不同。
总体来说，它由两部分组成：第1部分是特征性结构，存在于所有的MRSA中，包括：保守的末端正序重复序列(direct repeat sequence，DR)和(或)反序重复序列(inverted repeat sequence，IR)、mec操纵子、在mecA基因左右存在的保守的基因结构以及负责SCCmec移动的ccr基因;第2部分是功能未明确或无功能区。
1.2 以下是近几年来发展的几种SCCmec分型的PCR方案：1)Boye等人[1]应用四对引物的多重PCR可以进行MRSA菌株Ⅰ型到Ⅴ型的简单快速分型，但不能区分亚型，适于实验室快速初筛。
2)Zhang等人[2]多重PCR方法可同时检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、Ⅴ8个主要的型和亚型，还扩增mecA基因作为阳性内参。
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三种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的比较赵自云牟晓峰江秀爱(山东省青岛市中心医院，青岛266042)【摘要l目的比较苯唑西林纸片扩散法、微量琼脂稀释法(M I C)和聚合酶链反应(t K I R)法检测甲氧西林耐药金黄色葡萄球茵(M磁滤)的差异。
方法用上述3种方法同时检测86株临床分离的金黄色葡萄球茼。
结果3种方法同时辁测出53株M R SA和33株甲氧西林敏感金黄色葡萄球茵，一致性为100％。
结论三种方法都适于临床实验室准确检测M R SA，尤其是纸片扩散法和M I C法可作为不同级别临床常规实验室确证M R SA检测方法。
【关键词】金黄色葡萄球茵；甲氧西林；苯唑西林纸片扩散法；微量琼脂稀释法；聚合酶链反应C om par e t hr ee m e t hods t o de t ect l V l R SA Z b．a o zi yun，M u X m of ezl g，扭l ng xi t塘i(Q iD gc ho cen t r al h盎pi t al，Q m gdao，266042)【A b st m et】O bj ec啦ve T o co m p ar e t he di f fer ences of t he ox aci ll i n dis k dif fus ion m e t hod，m i cr o—agar di l ut i on(m c)and r m l ym er ase chai n r ea ct i on(P CR)t o det ect i on t he m ethi ei l li n—res i s t ant St aphyr l ococcm aul-el l8(M R SA)。
M e t hods t hr ee m e t h ods w eFe per f or m ed t o1y ze86c l i ni cal i sol a t es of St aphyl o coccus al al℃1．t S．Ih爆咄s53M R SAa nd33m et hi ci U i n—s ens i t i veSt aphyl ococcusaun吣w e陀det ect ed by t het hr ee m et hod s，s peci fi ci t y w a d00％，s em d t i v i t y w as l oo％。
C ondus i on T h esem ethods勰s ui tabl e f or c li nic al l abor ator ies t o a ee tt r at el y det ect M RSA．es peci al l y t he dis k dif f usi on m et hod a nd M I C coul d be us ed f or di ff e rent l eve ls0【f m u l i n e c l i ni cal l ab or at o r y con f i r m ed M1t SAdet ec t ion．【K ey words]St aphyl赫'ns aureus；M et hiei l li n；T he ox aci ll i n di sk dif fus ion4m et h od；M i er e—agar di l u t i on；P ol ym eras e chai n r eact ion金葡菌是临床最常见的病原菌之一，在临床分离菌中分离率位居前列，其中以m et hi ei l l i n—r esi st ant St a phyl ococc us aur eus(M R SA)临床意义尤为重要。
由于其多重耐药性和易造成医院感染的暴发流行，已成为临床抗感染治疗的一大难题Ll。
2J。
M R SA对抗生素的耐药性日趋严重且对多种抗生素耐药，因此M R SA引起的医院感染一旦发生，常难以控制。
为了解我院医院感染的M R SA耐药表型与基因型之间的关系，进一步加强对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速、及时检出，有效控制M R S A造成的感染，指导临床用药，限制其传播，本文对我院目前常用的检测方法进行了比较。
I材料与方法1．1菌株来源黄色葡萄球菌标准株(A TC C25923)、金黄色葡萄球菌A T C C43300、大肠埃希菌标准株(A T C C25922)为本室保存；m ecA基因阳性标准M R SA菌株(SA0129)由美国Pf i zer公司研究所提供。
临床标本由青岛大学医学院第二附属医院检验科提供，共86株，包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(M SSA)和株M R S A。
标本主要来源于创面分离物、引流液、痰、血、中段尿等送检标本。
1．2试剂和仪器基因组D N A提取试剂盒购自美国Pr om ega公司；PC R试剂(Taq D N A聚合酶、4X dN TPs、10×buff er等)购自加拿大M B I公司；D N A M ar ker购自大连T akar a公司；利用D N A S t ar软件设计的引物由上海生工公司合成。
苯唑西林为英国O xoi d公司产品。
4800型D N A扩增仪为美国PE R K IN公司产品；M i cr os can半自动细菌鉴定仪为美国D at e B蛐公司生产。
1．2实验方法1．2．1纸片扩散法1．2．1．1将待测细菌用0．45％N aC I溶液制成0．5麦氏单位(1．5×10C FU／m1)的菌悬液。
用接种环将茵悬液划种在和M ul l er—H i nt on平板，然后贴苯唑西林纸片，将种好的平板放入37℃培养箱孵育24小时。
金黄色葡萄球菌A TC C25923作为苯唑西林阴性质控菌株、金黄色葡萄球菌A TC C43300作为苯唑西林阳性质控菌株。
1．2．1．2结果判断标准：苯唑西林纸片扩散试验抑菌圈直径≤11m m为耐药；抑菌圈≥12r am为敏感。
1．2．2微量琼脂稀释法：用M i er os ea n细菌鉴定仪测定苯唑西林M I C，判断标准遵循临床实验室标准一化委员会(C Ls I)制定的法规：M I C>4u∥I nl为M R．SA。
1．2．3聚合酶链反应法检测m ec A基因：1．2．3．1引物的设计在G eneB ank中收集m eeA基因的序列，用P r i m er Pr i m i e z5．0软件设计m e cA、基因扩增引物。
耐甲氧西林葡萄球菌m ecA基因的引物如下P1：5—1A G-I-r C TA G T I G T C G G G T一3，P2：5一TA TC G G A C G Tr cA G TC A T一3，扩增产物为165bp片断；1．2．3．2细菌D N A的提取按美国P r om ega公司生产的基因组D N A提取试剂盒(W i za r d G enom i c D N A Pur i f i cat i on K i t)操作说明书操作。
1．2．3．3目的基因的PC R扩增，取上述提取的M SS A、M R SA及大肠埃希氏菌标准株(A TC C25922)对照菌株的D N A各1肛l作为扩增的模板，加入PC R反应体系，引物、M gC L2、dN T P终浓度分别为2弘M、250pt M、250nM，1×PCR buf f er，0．6u以L T aq酶，反应总体积25出。
PC R反应参数94c|C预变性6m i n，(94℃60s，500C30s，72℃45s)×35个循环，72℃延伸10rai n。
1．2．3．4扩增完毕后每管各取3／dPC R产物，D N A M ar ker2．5t d，经1．2％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察结果。
2结果2．1纸片扩散法法结果苯唑西林抑菌圈直径≥12m m的敏感菌33株，抑菌圈<1l m m的耐药菌株53株。
2．2微量琼脂稀释法法结果苯唑西林M I C≤4ug／m l的敏感菌33株，苯唑西林M I C>4ug／r nl的耐药菌53株。
2．3PC R法检测m ecA未出现165bpm e cA条带的敏感菌33株，出现165bpm ecA条带的耐药菌56株。
2．4三种检测方法结果比较3种方法检测金黄色葡萄球菌的结果敏感株333333耐药株535353三种方法经x!检验X2=0．P=1．检测结果差异无显著性。
以m ecA基因检测呈阳性为“金标准”，共检出53株M R SA，阳性率为61．6％。
苯唑西林纸片扩散法法敏感性100％，特异性100％；苯唑西林微量稀释法敏感性100％，特异性100％。
图1m ee A基因PE R扩增扩增产韧琼脂糖凝胶电泳结果l为黄色葡萄球菌标准株(A TC C25923)．2为大肠埃希菌标准株(A TC C25922)．3为·m ec A基因阳性标准M R SA菌株(S A0129)．4为标本M R S A．M为M ar ker3讨论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R SA)是医院感染的重要病原菌之一，自1961年在英国首次被报道以来，其感染率不断上升，目前医院正面临着M I L SA 感染日益严重和多重耐药的挑战。
M R SA对包括甲氧西林在内的多种抗菌药物耐药，由它所致的感染易呈流行或暴发流行，治疗困难且病死率高，成为临床治疗的一大难题。
因此，快速、尤其是准确的的检测M R S A已成为各医院临床微生物室的重要任务。
M R S A检测方法常采用的有临床实验室标准化委员会(C L SI)推荐的苯唑西林纸片扩散法和头孢西丁纸片扩散法，还有应用自动细菌鉴定仪测定最低抑菌浓度(M IC)筛选方法，以及分子生物学方法检测m ecA基因等方法。
本文利用苯唑西林纸片扩散法，最低抑菌浓度(M I C)筛选方法，以及检测m ecA 基因三种方法同时进行检测，对各方法之间结果进行比较，以便不同医院根据自己的实际情况选择合适的方法进行M R SA的筛选。
m eeD N A是耐甲氧西林葡萄球菌特有的D N A序列，长约30．45kb，位于细菌染色体上，通常在pur—nov—hi s基因族附近，m ee基因由m ea A、m ec I、m ec m 及20—40kb的m ec相关D N A组成。
m ecA为结构基因，主要编码PB P2a蛋白，决定菌株是否对甲氧西林耐药。
现已经明确，由m eeA基因编码的PB P2a是葡萄球菌对甲氧西林耐药的主要原因，因此m ecA 基因被作为耐甲氧西林葡萄球菌(m et hi ei l l i n r es i s t an t s t aphyl ococci，M R s)的分子标志，(下转34页)胞之间的窦周间隙，胞浆内含有脂滴为其特征，可贮存，脂肪与维生素A，能产生多种胶原与非胶原基质成分，在肝纤维化过程中，贮脂细胞在多种因子作用下增生活化，并转化为肌纤维母细胞及合成纤维细胞，产生大量胶原及基质，对肝纤维化的发生具有重要作用E9]。