电化学免疫传感器研究及应用进展

免疫传感器的应用
免疫传感器已广泛地用于医学临床诊断、环境 监测和食品工业等领域, 获得了良好的可检测性。 在国外，免疫传感器已被用于多种物质的测定, 如除草剂、苯酚、人尿中的刺激性药物、IgG、 IgM、V III 因子相关抗原、血清载脂蛋白、牛血 蛋白(如牛血红蛋白、牛血清白蛋白)、人细胞 (如红细胞、粒细胞和T 淋巴胞)、病毒(如人类 疱疹病毒和肝炎病毒)、血清H IV 特异性抗体和 血管内皮生长因子等。
免疫传感器的发展趋势
(1)标记物的种类层出不穷,从酶和荧光发展成胶乳颗 粒、 胶体金、磁性颗粒和金属离子等; (2)向微型化、商品化方向发展, 廉价的一次性传感表面大 有潜力可挖; (3)酶免疫传感器、压电免疫传感器和光学免疫传感器发展 最为迅速, 尤其是光学免疫传感器品种繁多, 目前已有几 种达到了商品化, 它们代表了免疫传感器向固态电子器 件发展的趋势; (4)与计算机等联用, 向智能型、操作自动化方向发展; (5)应用范围日渐扩大, 已深入到环境监测、食品卫生等工 业和临床诊断等领域, 以后者尤为突出; (6)继续提高其灵敏度、稳定性和再生性, 使其更简便、快 速和准确。
免疫分析之 ------ 免疫传感器
第11组
主要内容
免疫传感器原理
免疫传感器的分类
免疫传感器的制作
免疫传感器的应用
免疫传感器的发展趋势
免疫传感器原理

1990年 Henry 等提出了免疫传感器的概念。免 疫传感器是将高灵敏度的传感技术与特异性免疫 反应结合起来, 用以监测抗原- 抗体反应的生物 传感器。免疫传感器的工作原理和传统的免疫测 试法相似, 属于固相免疫测试法, 即把抗原或抗 体固定在固相支持物表面, 来检测样品中的抗体 或抗原。 由于免疫传感器技术具有分析灵敏度高、特异性 强、使用简便及成本低等优点, 目前它的应用已 涉及到临床医学与生物检测技术、食品工业、环 境监测与等领域。

光学免疫传感器
光学免疫传感器可分为间接式(有标记) 和直接 式(无标记) 两种。 间接式光学传感器: 酶可用来作标记物催化生成 一系列产物, 这些产物能吸收光线, 发出荧光或 磷光, 其中磷光具有特别高的灵敏度; 荧光团也 可作标记物, 它在被消失波等激励后可直接发出 荧光而被监测。因此, 这类光学传感器不需光源, 大大简化了设计, 但因为受检测的光水平很低, 所以需要复杂的检测仪器。

电流型免疫传感器


该类传感器的原理主要有竞争法和夹心法2种。前者是 用酶标抗原与样品中的抗原竞争结合氧电极上的抗体, 催化氧化还原反应, 产生电活性物质, 从而引起电流变化, 测量此变化值便可得出样品中抗原浓度。后者则是样品 中的抗原与氧电极上的抗体结合后, 再加酶标抗体与样 品中的抗原结合, 形成夹心结构, 从而催化氧化还原反应 产生电流值变化。 电流免疫传感器一般都靠标记, 且标记物都是酶类, 包括 乳糖酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶等。近些年, 一 些新的具有电化学活性的化合物(如对氨基酚及其衍生 物、聚苯胺)和金属离子也在电流免疫传感器中被用作 标记物。

免疫传感器的优点


免疫传感器相对于一般免疫检测方法的主要优势:它不 但能弥补目前常规免疫检测方法不能进行定量测定的缺 点, 而且还能实时监测抗原抗体反应, 不需分离步骤, 即 在抗原抗体反应的同时就把反应信号动态而连续地记录 下来,有利于抗原抗体反应的动力学分析; 免疫传感器相对于其他传感器的优势则是: 由于抗原与 抗体的结合具有很高的特异性, 从而减少了非特异性干 扰, 提高了检测的准确性, 且检测范围也很大。总之, 集 生物学、物理学、化学及医学为一体的免疫传感技术其 发展潜力巨大, 它不但能推动传统免疫测试法的发展, 而 且将影响临床和环境监测等领域里的实用性研究。
免疫传感器的再生


由于抗原抗体结合性强, 反应后不易分开, 要使 免疫传感器能重复使用, 就要用一些试剂将抗原抗 体复合物解离或从传感器表面全部清除下来, 这些 试剂还须不损害固相抗原或抗体的活性。用于解离 的试剂有柠檬酸盐缓冲液、乙醇胺、磷酸盐- 柠檬 酸缓冲液、强酸强碱加超声清洗、甘氨酸- 盐酸缓 冲液、二乙胺、丙酸、乙二醇、尿素和盐酸胍缓冲 液和四氢呋喃 。 为防止器件表面固相生物膜再生时可能导致的膜中 蛋白活性降低, 也为节省包被时间, 80年代Badley 研究发展了可置换型、一次性使用的传感器件, 推 动了免疫传感器向简便、快速和自动化方向发展。

免疫传感器的制作
免疫传感器的固定 免疫传感器的再生

免疫传感器的固定


免疫传感器制作过程中重要的步骤是将抗体或抗原 固定在传感器表面, 这样才能检测相应的抗原或抗 体。然而传感器表面构造不一, 有金属、碳、玻璃、 石英等, 它们与抗原或抗体的结合特性都是不同的, 因此需要不同的固定方法, 以至于不让吸附好了的 抗原或抗体在反应中脱落。 固定方法可分为直接法和间接法。前者是用含抗体 或抗原的溶液涂覆或浸泡电极或光极, 通过物理或 化学吸附作用使其表面生成具有识别功能的生物膜。 该法简单、快速, 但易阻碍特异性反应的发生, 导致 非特异性吸附和脱落。后者则采用中间连接层来连 接传感表面和抗体或抗原，提高了固定效率、固定 化层的适应性和反应灵敏度。

电位免疫传感器
1975年Janata首次描述了用来监测免疫化学反应 的电位测量式免疫传感器。 这种免疫测试法的原理是先通过聚氯乙烯膜把 抗体固定在金属电极上, 然后用相应的抗原与之 特异性结合,抗体膜中的离子迁移率随之发生变 化, 从而使电极上的膜电位也相应发生改变。膜 电位的变化值与待测物浓度之间存在对数关系, 因此根据电位变化来自百度文库进行换算, 即可求出待测物 浓度。
热量检测免疫传感器
该类传感器的原理是: 将抗原或抗体固定 在包埋了热敏换能器(热敏电阻) 的柱上, 样品中的抗体或抗原与之发生反应后引起 酶促反应, 可产生20～100 kJ/mol的热量, 然后通过热敏电阻等元件检测出来。 1991 年,Urban用小型薄膜热敏电阻固定 抗体来检测抗原, 制成了微型热量检测免 疫传感器, 预示着有可能生产出大小适宜 且简单的装置。

直接光学传感: 直接光学传感即利用光学技术直 接监测传感器表面的光线吸收、荧光、光线散 射或折射率(R I)的微小变化, 在免疫传感器技术 中是一项有前景的领域。 直接光学传感器相对于间接技术有一优点, 即光 线检测所需的测试仪器更为简单, 但遇到的问题 是小分子的非特异性结合和低灵敏度。因此在 一些情况中, 人们把两种技术的最佳特性结合起 来提高灵敏度, 如使用荧光标记的SPR 和使用 胶乳颗粒的SPR。
参考文献
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由于待测样品的离子强度与缓冲液电容的 变化会对这类传感器造成影响, 加之溶液 的电阻是由全部离子移动决定的, 使得它 们还存在非特异性问题,因此导电率测量 式免疫传感器发展比较缓慢。
压电免疫传感器

压电免疫传感器是最常见的一种质量测量式免 疫传感器, 它的原理是石英晶片在振荡电路中振 荡时有个基础频率, 当样品中的抗原或抗体与包 被在晶片上的抗体或抗原结合时, 由于负载的增 加, 晶片的振荡频率会相应减少, 其减少值与吸 附上去的质量有相关性。这种相关性可用 Sauerbrey 方程表示, 即△F = -KF2△M/A , 式中 △F为晶体吸附外来物质后振动频率的变化(Hz) , K 为常数, 等于2126×10-6。△M 为晶片的质量 变化值(g) ,A 为有效压电面积(cm2) , F 为晶片 的基础频率(Hz)
标记免疫传感器是一种具有化学放大作用的传 感器， 通常以酶为标记物，此外还有荧光试剂、 化学发光试剂、核素或金属标记物。

电化学免疫传感器

电化学免疫传感器是基于抗原-抗体反应的, 可进行特异性的定量或半定量分析的自给 式的集成器件,其中抗原/ 抗体是分子识别 元件,且与电化学传感元件直接接触 ,并通 过传感元件把某种或者某类化学物质浓度 信号转变为相应的电信号。 电化学免疫传感器是免疫传感器中研究最 早，种类最多，也较为成熟的一个分枝。 根据它测量方式的不同又可分为电位测量 式、电流测量式、导电测量式。
蛋白A法（SPA法）
SPA法固定抗体的方法为定向固定，SPA 具有 与抗体的Fc 片段结合的特性, 而抗原与抗体的 结合点位于抗体的Fab 片段, 故SPA 与抗体结 合后不影响抗体与抗原的结合, 且SPA 与金的 亲和力很强,形成的膜较稳定． SPA 无毒无刺激性气味, 比起其它一些化学固 定试剂更易让操作者接受。不过, 虽然SPA 被 公认为是最好的一种固定方法, 但是它只能用来 固定抗体, 而不能固定抗原。


开始阶段该类传感器大多只限于气相测定, 即晶片在样 品缓冲液中与待测物反应后, 还需取出干燥后才能测定 频率变化, 这样可使晶片起振较容易, 避免非特异性吸附 对结果的影响, 取得较好的线性关系。但这增加了操作 时间, 且干燥过程对蛋白质的活性有损害, 会缩短传感器 的寿命。为了避免干燥过程带来的不利影响, 最好的解 决办法就是在液相中直接检测晶体表面的质量变化。这 样不但克服了上述缺点, 还使实时监测抗原抗体反应成 为可能。 1991年Nomura通过电解质溶液施加交变电场, 使无极 晶片在液相中振荡成功, 从而开辟了其在液相环境研究 中的新领域, 实现了石英晶体微天平技术的重大突破, 并 成为其发展方向的主流。

硅烷化法

硅烷化法:一般是先用γ氨丙基三乙氧基硅 烷(A PTE) 等硅烷化试剂, 使电极或光极 形成含氨基或羟基的活性表面, 再直接进 行抗原或抗体的固定或使用双功能交联剂 (如戊二醛等) 连接.
聚合物膜连接法

聚合物膜连接法:电极表面的聚合物膜可采用聚 合物涂覆法和单体在电极表面的现场聚合法来 生成。在涂覆中应用的聚合物有羧甲基纤维素、 聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、甲基丙 烯酸甲脂和甲基丙烯酸乙脂、聚乙二醇(PEG)、 海藻酸钠、醋酸纤维素、聚乙烯醇等。可先用 2%～4% 的聚乙烯亚胺（PEI ）甲醇溶液处理 电极得到PEI 修饰层, 再用戊二醛交联, 然后与 要固定的抗原或抗体反应便可完成固定过程。

免疫传感器的分类

根据标记与否可分为非标记型免疫传感器 和标记型免疫传感器 根据换能器种类的不同, 又可分为电化学 免疫传感器、压电免疫传感器、热量测量 式免疫传感器和光学免疫传感器等。

非标记与标记免疫传感器

非标记免疫传感器的工作原理是将抗体或抗原 固定于膜或电极表面， 当发生免疫反应后， 抗 体与抗原形成的结合物改变了膜或电极表面的 物理性质(如表面电荷密度、离子在膜内的传输 速度等)，从而引起膜电位或电极电位的变化。

1991年Ghindilis提出另一种电位免疫传感器， 是用一种具有电催化活性的生物催化剂(如乳糖 酶) 来标记抗胰岛素抗体, 与固定在电极上的胰 岛素特异性结合,乳糖酶催化电极上氧的电还原 反应, 从而使电极上电位增加, 其增加值与溶液 中游离抗原(胰岛素) 浓度有比例关系。 电位免疫传感器的问题是信噪比低,因为大多数 生物分子上的电荷密度相对于背景干扰(如离子) 来说较低; 另外, 信号反应对pH 值和离子强度等 条件有明显依赖性, 被测电位与离子活性有关。
电导型免疫传感器
导电率测量法可大量用于化学系统中, 因 为许多化学反应都产生或消耗多种离子体, 从而改变溶液的总导电率。通常是将一种 酶固定在某种贵重金属电极上(如金、银、 铜、镍、铬) ,在电场作用下测量待测物溶 液中导电率的变化。 1992 Sandberg描述了一种以聚合物为基 础的导电率测量式免疫传感器, 它与常规的 酶联免疫吸附试验原理基本相同, 只是后者 的结果是通过颜色来显示, 而它则是将结果 转换成电信号。