双光子激光共聚焦显微镜

LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数

设备名称双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜2.数量3.设备用途说明4.工作条件电源220V+10%, 50HZ室温：20'25 “C貝他：防尘，除湿，抗鳶动工作台：牢固•稳定，防夜5.规格、技术要求及参数5.1双光子飞秒激光器局部5JJ Ax 激光：458nui > 488nm. 514nm» 25mW5j ・ 2 HeNe 激光：543nm, ImW5j - 3 HeNe 激光：633nm, 5mW5j 4 405 激光：405nm, 30mW5. L5 •红外飞秒脉冲激光器，波长范围：680・1080nm,包含负色散补偿功能5J・6根据标木的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。

5丄7 去稳定的可见光A0TF,同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间V5微秒。

A0TF对激光强度的控制连续可调(0-100%)，步进0・1%) °5J・8毎支激光器通过独立的光纤连接到扫描器局部，光纤即插即用，无需校准。

5J -9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。

5J J 0具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。

5 • 2扫描器521 扫描器(含检测器〉与显微镜直接连接于显微镜端口(非光纤连接人一体化设ih 一体化像差及色差校正。

5・2・2壳整个光路的光学设计适用波长范围为360nm-1000nm全光谱范围。

523 每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。

525去光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。

526各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检527•共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和1 个透射光通道图像，10种荧光染料可同时别离成像，1个透射光通道〔明场DIC效果〉5・2・8协扫描器〔含检测器〕必须内置高灵敏度GaAsPspectial检测器，而且该仪器能够整合FCS技术，使影像品B 〔S/N ratio〕信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能・529 一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。

双光子共聚焦显微镜FV1200MPE使用说明

点击，选择合适的荧光滤镜，观察标本荧光
点击观察透射光（倒置显微镜） 2. 选择染料点击跳出荧光染料选择窗口，选择对应荧光 >> Apply 3. 扫描图像
Focus X2 以 2 倍速扫描图像，适合低扫描分辨率图像的快速聚焦（忽略 Kalman、慢速扫等功能） Focus X4 以 4 倍速扫描图像，适合高扫描分辨率图像的快速聚焦（忽略 Kalman、慢速扫等功能） XY Repeat 可以直接高质量扫描图像，但速度略慢（使用 Kalman、慢速扫等功能） XY 适合快速预扫描后直接高质量出图，可以执行高级 lamda/Z/Time 扫描（使用 Kalman、慢速扫等功能）六、关机步骤： 1. 物镜 Escape，无水乙醇擦净镜头。 2. 滤光转轮放至 DICT。 3. 软件上一定要关闭双光子激光器！ 4. 关闭软件。 5. 拧闭总控器（1 把）和共聚焦激光器钥匙（2 把）。 6. 从右至左关闭电源（其中汞灯长按关闭）。 7. 关闭电脑。 8. 待汞灯 300 秒倒计时完毕，关闭两个插线板总电源。
图9 激发分色镜（图 9a）：标识数字为反射的激光波段，其余波段荧光通过。荧光反射镜(图 9b)：标识数字为分界波段，如图表示为<560nm 波段反射，>560nm 波段将透过该镜片。吸收滤色镜（barrier filter）(图 9c)：用于过滤特异波段的荧光，在光谱系统中该部分可以通过狭缝和光栅随意调节。标识一般表示为 “带通”，如图表示 505nm-525nm 波段的荧光可以通过此滤色片。 8. 物镜：成像的决定性部件，对系统的分辨率、检测荧光强度等起决定作用。系统分辨率(能够检测相互靠近两点的最小距离)R = k×NA/λ 物镜的数值孔径（Numerical Aperture）：NA 越高，分辨率越好。介质折射率：折射率越高，物镜能够达到的 NA 越高。色差校正：对可见光各波段的校对能力，使同一点发出的不同颜色的光能够同时成像到同一平面的能力。五、数据采集三步骤获取图像 1. 观察显微镜下观察标本，选择合适的物镜

双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验

感谢您的观看
图像采集与处理
采集参数设置
根据样本特性和实验目的，合理设置图像采集的参数，如曝光时间、增益等，以提高图像质量。
图像处理与分析
利用专业软件对采集到的图像进行必要的处理和分析，如去噪、增强对比度、测量荧光强度等。
数据导出与共享
将处理后的数据导出为通用的文件格式，便于进一步的数据分析和共享。
防止光漂白
在观察过程中，应尽量避免长时间照射和频繁扫描，以减少荧光染料的光漂白。
荧光探针的选择与使用
探针特异性
选择具有高特异性的荧光探针，以确保标记的准确性和可靠性。
探针浓度与稳定性
探针混合使用
在某些情况下，可能需要将几种荧光探针混合使用，此时应确保它们之间不会发生相互干扰或淬灭现象。
根据实验需求，调整荧光探针的浓度，并确保其在样本中的稳定性。
药理学研究中的应用
总结词
双光子和光谱扫描在药理学研究中具有重要价值，能够观察药物对细胞和组织的影响，有助于发现新的药物作用机制和靶点。
详细描述
在药理学研究中，双光子和光谱扫描技术被广泛应用于观察药物对细胞和组织的影响。这些技术能够实时监测药物对细胞代谢、能量代谢、蛋白质表达等方面的影响，帮助科学家们发现新的药物作用机制和靶点，为新药研发提供有力支持。
04 技术挑战与未来展望
提高成像深度与分辨率
优化双光子吸收截面
通过提高双光子吸收截面，可以降低成像所需的激光功率，从而减少光毒性。
开发新型光谱扫描技术
通过改进光谱扫描技术，可以实现更快速、更准确的图像采集，提高分辨率。
优化光学元件
选用高数值孔径的物镜和低噪声的光电探测器，提高成像深度和分辨率。
察细胞和组织的细微结构。

各荧光检测方法简介(流式、荧光显微镜、共聚焦、全内反射与双光

各荧光检测方法简介（流式、荧光显微镜、共聚焦、全内反射与双光很多细胞实验都要检测荧光，为方便大家选择合适的方法，在此简单说一下各种荧光检测方法的特点。

不足的地方，欢迎大家补充：1、流式，优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，完全不用担心荧光淬灭的问题。

缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。

例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。

2、荧光显微镜，刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。

有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。

与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。

尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。

3、共聚焦，荧光显微镜的升级产品，具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。

但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。

共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。

另外，4Pi和 STED又是其中的极品，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。

4、全内反射，荧光显微镜的另一种升级产品，属于近场光学范畴，只适合且最适合做膜研究，无法看到胞内信息。

也是用CCD成像，但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。

5、双光子，另一种共聚焦，因使用长波激发荧光，故能做深层检测（突破共聚焦的100微米极限），最典型的应用是观察活体脑组织。

激光共聚焦显微镜原理

激光共聚焦显微镜原理
激光共聚焦显微镜（Laser Confocal Microscope）是一种光学显微技术，它可以利用激光光束在工作距离内产生一个比空间分辨率更高的光斑，利用这种技术可以获得高空间分辨率和高清晰度的图像。

激光共聚焦显微镜是一种高精度的光学显微镜，它利用激光束来聚焦，从而可以观察到极微小的生物样品或者其它小物体，比如细胞，细菌和病毒等。

激光共聚焦显微镜的工作原理是：当激光束聚焦到一个小物体的表面时，激光束会产生一个强度较高的热斑，这个热斑可以用来检测目标物体的表面特征，比如细胞或病毒的大小、形状、结构等。

当激光束通过物体表面时，一部分激光束会被物体反射，而另一部分激光束会被物体吸收。

这样，就可以得到物体表面的一维和二维图像，从而获得物体表面各种特征的信息。

激光共聚焦显微镜具有空间分辨率高、操作简单、检测结果可靠等优点，可以用来检测病毒的大小、形状、结构等，也可以用来检测细胞的结构、细胞内分子的活性变化等。

目前，激光共聚焦显微镜已经广泛应用于生物学、医学、材料科学等领域，为科学研究带来了许多便利。

激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理

激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。

它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。

本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。

一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。

在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。

与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。

换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。

对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。

二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。

1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。

在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。

荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。

2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。

双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。

在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。

双光子激光扫描荧光显微镜及其应用

表 1 几种常见荧光分子的单光子、双光子和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单、双光子激发过程示意图
图 2 单、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面、准确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
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2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源

激光共聚焦显微镜原理和应用

激光共聚焦显微镜原理和应用共聚焦显微镜的发展历史1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。

1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。

1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。

1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到非常清晰的图像。

1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。

共聚焦显微镜最大的优点就是可以只检测一个聚焦平面的信号。

样品聚焦平面和检测器（光电倍增管）之前均有一个针孔，针孔的设置可以有效地滤除非聚焦平面的信号，增加显微镜的信噪比。

激光扫描显微镜能够逐点和诸行对样品进行扫描，最终根据象素信息形成一个高对比度和高分辨率的图像。

通过逐层对样品扫描并把每一层的图像组合成一个整体，激光扫描显微镜能够对样品进行三维分析，非常适合于超厚样品的检测。

传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用眼睛成像，也无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图象，有一定的时间延迟。

How a Confocal Image is FormedCondenser Lens Pinhole 1Pinhole 2Objective LensSpecimen DetectorWide Microscopy and Confocal MicoscopyWide Field Confocal Field Wide Field Confocal FieldConfocal Principle630 nm BandPass FilterTransmitted LightWhite Light Source620 -640 nm LightTransmitted LightLight Source520 nm Long Pass Filter>520 nm LightTransmitted Light Light Source575 nm Short Pass Filter<575 nm Light Standard Short Pass FiltersOptical FiltersDichroic Filter/Mirror at 45 degReflected light Transmitted Light Light Source 510 LP dichroic Mirror生命科学院的激光共聚焦显微镜Beam Path of Zeiss CLSM 510 METAThe unique scanning module is thecore of the LSM 510 META. It containsmotorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectorsincluding the META detector. All thesecomponents are arranged to ensureoptimum specimen illumination andefficient collection of reflected oremitted light. A highly efficient opticalgrating provides an innovative way ofseparating the fluorescence emissions inthe META detector. The gratingprojects the entire fluorescencespectrum onto the 32 channels of theMETA detector. Thus, the spectralsignature is acquired for each pixel ofthe scanned image and subsequently canbe used for the digital separation intocomponent dyes.Focus ConeSpecimen X/Y ImageXYTo get an 2 D image, the excitation spot has to be moved over the specimen3 D information is acquired by moving the excitation focus not only in XY direction but also in Z direction. The result is a 3 D data stack consisting of number of XY images representing different optical sections from the specimenX/Y/Z StackZ-Driveoptical slice共聚焦显微镜的三维信息采集zxy# z sections =#imagesA confocal data set is similar to a book. A book has many pages, and Each page shows information only available if you move down to that page and ready it. Reading a page in a book, is just like scanning with a confocal microscope –you remove all of the other pages!z xy zyy The advantage of confocal microscopy is that you can visualize frames from a 3D object even in planes that you don’t image directly. This is called “slicing” an object and is an important component of confocal imaging.三维数据重构建荧光共振能量转移荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子标尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。

LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数

1.设备名称双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜2.数量1套3.设备用途说明4.工作条件电源220V±10%，50HZ室温：20~25℃其他：防尘，除湿，抗震动工作台：牢固，稳定，防震5.规格、技术要求及参数5.1 双光子飞秒激光器部分5.1.1Ar激光：458nm、488nm、514nm，25mW5.1.2HeNe激光：543nm，1mW5.1.3HeNe激光：633nm，5mW5.1.4405激光：405nm，30mW5.1.5*红外飞秒脉冲激光器，波长范围:680-1080nm, 包含负色散补偿功能5.1.6根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。

5.1.7*稳定的可见光AOTF，同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间<5微秒。

AOTF对激光强度的控制连续可调（0~100%），步进0.1%）。

5.1.8每支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。

5.1.9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。

5.1.10具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。

5.2扫描器15.2.1扫描器（含检测器）与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接），一体化设计，一体化像差及色差校正。

5.2.2*整个光路的光学设计适用波长范围为360nm～1000nm全光谱范围。

5.2.3每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。

5.2.4有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。

5.2.5*光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。

5.2.6各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检测器。

5.2.7*共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC效果）5.2.8*扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsP spectral 检测器，而且该仪器能够整合FCS技术，使影像品質(S/N ratio)信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能。

激光共聚焦显微镜方法步骤

激光共聚焦显微镜方法步骤
激光共聚焦显微镜（简称CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，常用于生物学、医学和材料科学领域。

下面我将从多个角度全面介
绍激光共聚焦显微镜的方法步骤。

1. 样品准备：
在进行CLSM观察之前，首先需要准备样品。

样品的准备包
括固定、染色和清洁等步骤。

固定样品可以使用化学试剂或生理盐水，染色则可以使用荧光染料或荧光蛋白等方法，以增强样品的对
比度和可见性。

2. 仪器设置：
在进行CLSM观察之前，需要对显微镜进行仪器设置。

这包
括选择合适的激光波长、光学滤波器和放大倍数等参数，以确保获
得清晰的荧光信号和高分辨率的图像。

3. 成像扫描：
接下来是进行成像扫描。

CLSM使用激光束来扫描样品，并
收集样品发出的荧光信号。

通过逐点扫描和逐层堆叠，可以获得样
品的三维图像。

4. 数据分析：
获得图像后，可以进行数据分析。

这包括图像处理和三维重
建等步骤，以获取更多关于样品结构和组织的信息。

5. 结果解释：
最后是结果的解释。

根据获得的图像和数据，可以对样品的
结构和功能进行解释和分析，从而得出科学研究或临床诊断的结论。

总的来说，激光共聚焦显微镜的方法步骤包括样品准备、仪器
设置、成像扫描、数据分析和结果解释。

这些步骤需要精确操作和
细致处理，以获得准确、可靠的显微镜图像和数据。

激光共聚焦显微镜的用途

激光共聚焦显微镜的用途激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率、高对比度的显微镜技术。

通过激光光源的激发和扫描，LSCM可以快速获取高质量的荧光图像，具有出色的三维成像能力。

下面将详细介绍LSCM的用途。

1.生物医学研究LSCM广泛应用于生物医学研究领域。

它可以对活体组织、细胞、蛋白质等进行实时观察和成像。

利用荧光探针标记的细胞、分子等在LSCM 下，可以观察到细胞器的结构和功能，探索细胞的生物学、病理学等方面的问题。

此外，LSCM还可以用于研究神经科学、免疫学和细菌学等领域，为相关疾病的诊断和治疗提供依据。

2.材料科学LSCM在材料科学研究中具有重要的应用价值。

它可以观察材料的微观结构、表面形貌和内部构造。

通过荧光染料标记或利用材料本身的荧光特性，可以研究材料的纳米结构、晶格缺陷、材料界面等特性。

LSCM还可以配合其他技术如拉曼光谱、傅里叶变换红外光谱等，进一步对材料进行分析和表征。

3.植物生物学LSCM在植物生物学研究中也起到关键作用。

通过激光共聚焦显微镜，可以观察到植物细胞的结构和功能，如叶片、根部、维管束等。

利用荧光标记技术，可以观察到植物的细胞器的分布和数量、蛋白质的表达和转运等。

此外，LSCM还可以用于研究植物的光合作用、生长发育等机制。

4.纳米科学LSCM在纳米科学领域也具有广泛应用。

它可以观察纳米材料的形貌、表面结构、聚集状态等。

利用纳米材料的特殊荧光性质，可以研究纳米颗粒的生长、聚集与分散、表面修饰等过程。

此外，LSCM还可以利用近场光学技术对纳米结构进行高分辨率成像，为纳米材料的设计与合成提供支持。

总之，激光共聚焦显微镜是一种用于观察微观结构和功能的强大工具。

在生物医学研究、材料科学、植物生物学和纳米科学等领域，LSCM发挥着重要的作用，为科学研究和技术应用提供了强有力的支持。

随着技术的不断进步，LSCM在未来的应用前景将更加广阔。

激光共聚焦显微镜原理和应用

激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜，又称双代理镜，是一种精密的衍射成像仪器，在
显微镜中用于研究各种微小样品的形态、结构和化学特性。

激光共聚焦显
微镜是一种高灵敏的、具有很高的分辨率的光学显微成像系统，在生物、
材料和分析科学等领域有着广泛的应用。

激光共聚焦显微镜的基本原理是利用一种双代理镜，其中一个代理镜
将外入的量子光束分成两部分，一部分照射到样品上，另一部分反射到另
一个代理镜上，两支平行光线通过要研究的样品，做出聚焦的衍射图像，
然后将衍射图像反射到接收端，接收端再将衍射图像转换成电子信号，然
后显示在屏幕上，这样就能将样品的形态、结构和化学组成辨认出来。

由于激光共聚焦显微镜的衍射成像效果比传统的光学显微镜要好，所
以在研究微小样品的形态、结构和化学组成时非常有用。

它可以用来观察
微小样品的形状和细节，如细胞、细菌和细胞器结构等，还可以观察抗原、抗体和药物在细胞和组织内的分布情况，在药物研发、生物医学、食品卫
生质量检测等多个领域得到了广泛的应用。

LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数

524 有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。

设备名称双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜电源 220V+10%, 50HZ室温：20'25“C貝他：防尘，除湿，抗鳶动工作台：牢固•稳定，防夜Ax 激光：458nui 、488nm. 514nm» 25mW2. 数量3. 设备用途说明4. 工作条件5. 规格、技术要求及参数5.1 双光子飞秒激光器部分5JJ 5」・2 HeNe 激光：543nm, ImW5」・3 HeNe 激光：633nm, 5mW5」4405 激光：405nm, 30mW 5.L5 •红外飞秒脉冲激光器，波长范围：680・1080nm,包含负色散补偿功能5」・6 根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。

5丄7 去稳定的可见光AOTF,同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间＜5微秒。

AOTF 对激光强度的控制连续可调（0-100%）,步进0・1%）°5」・8 毎支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。

5」・9 光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。

5」」0 具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。

5・2扫描器521 扫描器（含检测器〉与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接人一体化设ih 一体化像差及色差校正。

5・2・2 壳整个光路的光学设计适用波长范围为360nm-1000nm 全光谱范围。

523 每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。

同时满足下列速度指标:8幅/秒（512x512像素，16位〉，250幅/秒（512x16像素，16位）多重扫描功能，可以在扫描过程中以线和幅方式切换光路配程。

53显微镜525去光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。

526 各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检527 •共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC 效果〉5・2・8 协扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsPspectial 检测器,而且该仪器能够整合FCS 技术，使影像品B （S/N ratio ）信噪比有2X 提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能•529一个可用于明场和DIC 观察的透射光检测通道。

双光子共聚焦显微镜的原理

双光子共聚焦显微镜的原理概述双光子共聚焦显微镜（Two-Photon Confocal Microscopy）是一种高分辨率三维显微镜技术，能够实时观察生物标本的活体动态过程。

相较于传统的单光子共聚焦显微镜，双光子共聚焦显微镜具有更高的分辨率、较大的穿透深度和较小的光损伤。

双光子共聚焦显微镜基于非线性光学效应，利用非线性显微镜技术实现高分辨率成像。

其原理是通过同时或交替地聚焦两束高能量激光光束，在聚焦点附近产生非线性吸收效应，从而实现高分辨率的三维成像。

光学原理1. 激光光源双光子共聚焦显微镜通常使用飞秒激光器作为光源。

飞秒激光器具有短脉冲宽度和高峰值功率的特点，激发样品时光线非常集中，能够有效减小光损伤和光散射。

2. 非线性光学效应双光子共聚焦显微镜利用非线性吸收现象来实现高分辨率成像。

在样品中，通常需要使用荧光标记的染料或者色素进行成像。

这些染料或者色素具有非线性吸收的特性。

在双光子共聚焦显微镜中，两束飞秒激光光束在样品的焦点处交叉，产生高能量密度的光子。

这些光子被样品中的非线性物质吸收，导致非线性激发发生。

非线性激发产生的荧光信号被收集并记录下来，从而实现高分辨率的成像。

3. 深度成像双光子共聚焦显微镜由于使用了长波长的激光束，具有较大的光学穿透深度。

这是因为长波长的光在样品中的散射和吸收较小，能够更好地穿透表面的组织。

此外，由于双光子共聚焦显微镜是基于非线性吸收效应的，只有在激光焦点附近才会发生非线性吸收。

这也意味着只有在焦点位置处的样品才会被激光激发，从而减小了其它位置的光损伤，增加了穿透深度。

操作原理1. 激光扫描双光子共聚焦显微镜通过激光扫描的方式获取样品的三维信息。

通常，激光束经过反射镜和扫描镜，通过改变扫描镜的角度和位置，使激光在样品表面扫描移动。

2. 荧光信号收集双光子共聚焦显微镜在样品表面或焦点处收集荧光信号。

收集的荧光信号经过乳胶片或者光电倍增管进行记录和放大。

由于双光子共聚焦显微镜具有优异的光收集能力和高信噪比，能够对低强度荧光信号进行高灵敏度的接收。

双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜

双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜
院系：生命科学联合中心
仪器编号制造商国别经费来源责任教授
201214339 德国科研专款或基金程和平
所属ห้องสมุดไป่ตู้实验室制造厂商单价存放地点
北京大学生命科学联合中心蔡司 402.82万元型号购置日期 LSM 710 NLOFLIM 2012年11月
程和平否程和平服务对象电子邮件 — chengp@ 收费标准联系电话 62765957 — 开放时间 —
608
双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜
主要研究方向在研或曾承担重大项目奖项专利人才培养相关科研信息学术论文
线粒体超氧炫、钙离子活动的机制和生理功能，活细胞内CaMKII酶活性和ATP浓度成像
国家基础研究项目（“973计划”）
— 博士生4人，硕士生2人
—
知名用户共享信息备注是否对外开放联系人
英杰交流中心335E
基本信息
技术指标及功能简介
红外飞秒激光，可见激光， 34 通道光谱检测系统， 10 种染料可用同一时间精确区分，电动显微镜， FLIM荧光寿命成像系统。细胞自身荧光寿命分析，自身荧光对于标记荧光的有效区分活细胞钙离子浓度测量,共振能量转移，局部氧气浓度测量。光谱范围 350nm-1100nm ；覆盖近紫外、可见光、近红外波段。其光谱分辨率 3nm ，采用 x 、 y 轴独立双镜扫描；Coherent- Chameleon Vision II红外飞秒脉冲激光器，波长范围：680-1080nm，包含色散补偿功能；双光子显微镜提供反射和透射的 NDD 通道；32通道可见光光谱成像；TCSPC设备时间通道宽度最小可达813fs，荧光寿命图像最高分辨率可达 8192×8192。

共聚焦显微镜原理

激光共聚焦显微镜的构件与原理一、主要构件：一个完整的激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。

硬件包括表面荧光显微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制系统、显示器和图像输出打印设备，软件由三维图像分析系统和三维图像文件管理系统构成。

1、Illuminating pinhole:照明针孔功能:使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。

且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。

2、Objective:物镜3、Focal plane:焦平面功能:激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。

该光斑经过objective、beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及detector pinhole两处聚焦。

共聚焦的含义由此而来。

4、Detector pinhole:探测器针孔功能:与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。

最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。

5、PMT：光电倍增管（探测器）功能:接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。

6、激光器我们可以根据研究需要选择不同的激光器。

ArUV(351、364 nm)，AR(457、488、514 nm)，HeNe(543 、633 nm)等二、基本原理：传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰。

双光子激光共聚焦显微镜

双光子激光共聚焦显微镜
院系：生命学院
双光子激光共聚焦显微镜
配有常用单光子激光器及双光子激光器，并具备光操作及双扫功能，可对多种生物样品如组织切片、固定细胞样品、活细胞、
植物标本等进行荧光观察，还可以对脑片或斑马鱼等在体动物进行双光子观察，适合病理学、微生物学、细胞生物学、分子生
物学、遗传学与发育学等广泛生命科学领域的研究用途。

本仪器为北京大学生命科学学院公共仪器中心成像平台的仪器，属于学院公用仪器，为学院科研提供技术服务。

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激光扫描共聚焦显微镜(研究生)

1） DNA用 Hoechst33342标记（蓝），
2）细胞膜用 NBDPC染色（绿），
3）线粒体用 Mitotracker标记（红）
如何改善图像质量
1、“更多信号！”
1）、通过减慢扫描速度 2）、使用“平均”方法 3）、增加发射滤镜的带宽 4）、加大针孔直径；注意：光学切片的厚度也会相应地增大。 5）、增大激发能（激光功率）；注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。
2、“更多细节！”
1）、使用较高数值孔径 (NA) 的物镜 2）、增加“帧大小” = 每条线的像素值 + 每帧的线条数 3）、优化扫描焦距 (Z) 4）、增加动态范围
3、“更可靠！”
1）、使用多轨 2）、提供预定义配置。 3）、可同时定义和使用任何形状的多个研究区。
Cultured cells, multiple fluorescence
原理优缺点
激光共聚焦显微镜的基本结构
扫描系统
（1）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微镜相连，与所接显微镜一体化设计
（2）、检测器数量（3）、共聚焦针孔
50-300微米
（4）、扫描分辨率及灰度级
（5）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）
（6）、光谱扫描功能（7）、扫描速度及速度调节
1）蛋白质、单糖和多糖探针； 2）细胞器探针； 3）核酸探针； 4）细胞活性探针； 5）膜和受体探针； 6）细胞膜电位和细胞内pH探针； 7）金属探针； 8）分子的特殊基团结合探针； 9）其他
（三）仪器使用步骤
（1）、选择激光器类型（2）、选择相应的滤片（3）、根据实验目的选择适当软件（4）、按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。
仪器名称