三醋酸纤维素薄膜分离血清蛋白

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实验三醋酸纤维素薄膜分离血清蛋白

实验类型:验证型

目的和要求

掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。

原理

采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法,叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素,是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如:丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构,有强渗透性,厚度约为120微米。

醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术,它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结构球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前,醋酸纤维素薄膜电泳趋向于代替纸电泳。

操作方法

一、仪器和薄膜的准备

1. 醋酸纤维素薄膜的润湿和选择:取2cm×8cm的薄膜,于无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻轻地划一直线,然后将薄膜小心放入盛有缓冲溶液的培养皿内,使它漂浮在液面。若迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则表明薄膜质地均匀;若润湿时,薄膜上出现深浅不一致的条纹或斑点等,则为不均匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如,膜厚薄不匀可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不清、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。

将选用的薄膜用镊子轻压,使它全部浸入缓冲液内,待膜完全浸透(约半小时)后取出,夹在清洁的滤纸中间,轻轻吸去多余的缓冲液,同时分辨出光泽面和无光泽面。

2.制作“滤纸桥”:剪裁尺寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上,使它的一端与支架的前沿对齐,而另一端浸入电极槽的缓冲液内。然后,用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡,使滤纸紧贴在支架上,即为“滤纸桥”。按照同样的方法,在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。

3.平衡:用平衡装置(或自制的平衡管),使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一般需要平衡15—20分钟。注意,平衡后应将平衡装置的活塞关好(或除去平衡管)。

二、点样

在薄膜无光泽的一面点样。点样时,先用毛细管蘸取血清,点加在原划好线的1.5厘米处(见图1),一般点加2-3次。注意,应使每次点样同心圆,切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样,掌握点样技术,这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。

三、电泳

将已点样的薄膜使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上(见图2),点样端靠近负极。平衡10分钟,仔细检查电泳装置的线路是否正确,然后通电。打开电源开关,调节电压和电流强度,先旋动仪器粗调旋钮,再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3毫安,通电10—15分钟后,再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为15伏左右,薄膜每厘米宽的电流强度为0.4—0.6毫安。在电泳过程中,应注意控制电压和电流强度,防止过高或偏低。待电泳区带展开约3.5厘米时,则关闭电源,一般通电时间为50分钟左右。

四、染色

电泳完毕立即取出薄膜,直接浸入染色液中,染色5分钟。然后,用漂洗液浸洗,隔5分钟左右换一次漂洗液,连续更换三次,可使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中,吸去多余的溶液。操作中,要注意控制染色和漂洗的时间,防止背景过深或某些区带太浅。

五、结果判断

一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起,依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。

试剂和器材

一、试剂

(1)新鲜血清——无溶血现象。

(2)巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液(PH8.6,0.07M,离子强度0.06):称取巴比妥1.66克和巴比妥钠12.76克,溶于少量蒸馏水后定容1000毫升。

(3)染色液:称取氨基黑10B 0.5克,加入蒸馏水40毫升,甲醇50毫升和冰乙酸10毫升,混匀,在具塞试剂瓶中贮存。

(4)漂洗液:取95%乙醇45毫升,冰乙酸5毫升和蒸馏水50毫升。混匀,在具塞试剂瓶内贮存。

(5)透明液:

甲液——取冰乙酸15毫升和无水乙醇85毫升,混匀,装入试剂瓶内,塞紧瓶塞,备用。

乙液——取冰乙酸25毫升和无水乙醇75毫升,混匀,装入试剂瓶内,塞紧瓶塞,备用。

二、器材

(1)醋酸纤维素薄膜——2cm×8cm (2)培养皿(直径9—10cm)

(3)毛细管(4)直尺和铅笔

(5)镊子(6)电泳仪和电泳槽

(7)普通滤纸(8)染色缸

思考题

⒈电泳中,血清样品点在支持介质的哪一端?为什么?

⒉引起电泳图谱不整齐的原因是什么?

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