实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳要点

实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

一、目的：

1、掌握醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法

2、学会常用电泳的使用方法

3、了解用醋酸纤维薄膜作支持物的优点及使用范围

二、原理：

由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在pH8.6的缓冲液中，各种血清蛋白质所带电荷量不同，同时由于它们的分子量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在醋酸纤维薄膜上，电泳后，可将各种血清蛋白质分离开。

三、器材：

醋酸纤维薄膜（2×8cm）、电泳仪、点样器（盖玻片）、培养皿、粗滤纸、玻璃板（载玻片）、镊子等。

四、试剂：

巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07。巴比妥钠12.7g、巴比妥1.66g于蒸馏水中加热溶解后再加水至1000ml）

氨基黑染色液（氯基黑10B0.5g、甲醇50ml、冰醋酸10ml、蒸馏水10ml）

漂洗液（95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml）

血清

五、操作：

1、识别标记：将薄膜切成2.5×8cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2cm处用铅笔划一线，以标明点样位置。

2、浸泡：用镊子将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上(缓冲液盛于培养皿中)，使膜条自然浸湿下沉。大约10min。

3、点样：取出薄膜，用滤纸将表面的明水吸干，然后平铺在载玻片上（无光泽面朝上），将盖玻片先在小培养皿中的血清中沾一下，再在距膜条一端2cm处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。

4、电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲溶液内。用缓冲溶液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥）。点样端靠近负极，盖严电泳室，160V，45min。

5、染色：将膜条取出，放在显色液中显色10min。

6、漂洗：将膜条放在漂洗液中漂洗数次，至底色脱净为止，可得到清晰电泳图谱。

六、注意事项：

1、点样要少、轻、直、匀

2、不要将薄膜吸得过干

3、漂洗时不要用镊子来回拉动

4、节约漂洗液

七、结果与分析：

将图谱画在报告纸上，注明各种蛋白顺序，并分析结果