醋酸纤维薄膜电泳 实验报告

实验九醋酸纤维薄膜电泳

一、实验目的

学习掌握电泳原理

学习醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及染色鉴定

二. 实验原理

带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。电泳的基本原理

带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。

在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。F＝QX

质点的前移同样要受到阻力（ f ）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f ＝6πr ην（r为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质点移动速度）

当质点在电场中作稳定运动时：F＝f 即：QX＝6πrην

在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移动的距离d（单位为cm），即V＝d/t。电场强度X为单位距离L（单位为cm）内电势差E （单位为伏特），即

X＝E/L。将这两个公式代入上述公式，得到

U=v/X=dL/Et d=u*Et/L

由此可以得到两种物质移动距离的差为

△d=(d A-d B)=(u A-u B)Et/L

从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。

影响因素

1. 待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快

2. 缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减

慢。一般所用离子强度为0.02-0.2之间。

3. 电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置

4. 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。

5. 支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大

三、实验试剂

1、巴比妥缓冲液（PH8.6、0.07mol/ml、离子强度0.06）

2、染色液

3、漂洗液

四、实验操作

1、准备：（1）剪裁尺寸合适的滤纸条，叠成两层贴在电泳槽的两侧支架上，一端与支架前沿对齐，另一端浸入电泳槽的缓冲液中，使滤纸全部浸湿驱除其中气泡，即制成滤纸桥。

（2）量取缓冲液700-800ml倒入电泳槽

（3）在醋酸纤维素薄膜无光泽面约1.5cm处，用铅笔画直线作为点样位置，并做好编号，将纤维素薄膜的无光泽慢朝下，浸入盛有缓冲液的培养皿内，待完全浸透（约20分钟）级纤维素薄膜已无白斑后取出来夹在滤纸中间，轻轻吸着多余的缓冲液

2、点样：取少量血清置于玻璃板上，用加样器取血清2-3ml均匀的加于点样线，待血清渗入膜内后，移开样器应使血清形成具一定宽度的直线

3、电泳将薄膜点样的一端靠紧阴极侧，无光泽面朝下，平整地贴于电泳电泳膜横支架的滤纸桥上，使其平衡约5min打开电源开关，调节电压为100-160v电流为0.4-0.6mA/cm膜宽，通电60min，使电泳区带展开约3.5cm关闭电源。

4、染色用镊子小心取出薄膜，浸入让色液中染色2min。然后取出，浸入盛入漂洗液的培养皿中反复漂洗几次即可。此时得到5 条蛋白带从阳极端起，依次为清蛋白α1、α2、β和γ-球蛋白。

五、试验结果

由于仪器原因，未得到分离的5条蛋白色带。

六、结果分析

1、电泳仪起损坏，无法进行正常实验。

2、点样过粗略，不能正常电泳

3、正负极位置接的有问题，将点样端放与正极端