发酵工程.ppt

培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌
用选择性培养基分批富集培养2-3代
稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落
性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）
乳酸生成量测定（滴定法）
Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）
放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例 （从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛选模型：形态依据
斜面保藏 高产菌恢复 放大培养，发酵液性能测试
真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和 产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH 值、提取工艺等。
（一）含微生物样品的采集
• 如何使样品中所含微生物的可能性大? • 采样时应注意的问题:
– 土壤微生物的分布 – 采土深度 – 土壤植被情况 – 采样季节 – 土壤的酸碱度
• 对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：
样品逐步分批寄回，以便及时分离。
（二）富集培养
• 由于采集样品中各种微生物数量有很大差
异，若估计到要分离的菌种数量不多时， 就要人为增加分离的概率，增加该菌种的 数量，称为富集培养。
• 方法：
控制一定的养分，例如碳源的控制。 控制一定的培养条件。
（三）纯种分离
• 划线分离法 • 稀释分离法 • 组织分离法
特别是在华南地区建厂，夏季气温炎热，应选择耐 高温的菌种。
二、工业发酵对生产菌种的一般要 求
③所选菌株生长速度和产物生成速度应较快， 发酵周期较短。
④根据代谢控制的要求，选择单产高的营养 缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌 株。
⑤不易被噬菌体感染。 ⑥不易变异退化。
三、工业发酵生产菌种来源
1、自然选育（需要通过菌种改良即菌种选育 才能得到符合工艺要求的菌种）。
• 次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，
如抗生素、生物碱、色素、激素和毒素等。
（二）工业发酵常见微生物及其代谢产 物
1、细菌及其代谢产物 2、放线菌及其代谢产物 3、霉菌及其代谢产物 4、酵母及其代谢产物
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二、工业发酵对生产菌种的一般要 求
①原料廉价易得，代谢产物产量高。
②对培养条件(糖浓度、温度、PH、溶解氧及 渗透压等)要求不高，易于控制，酶活性高。
– 土壤来源广泛。 – 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻
找新菌种。
• 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，
取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮 纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地 点、环境条件等，以备查考。
• 为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将
生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
2、新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特
性。
• 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖
培养后，在数量上占优势。
• 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。包括形态、培养特
第二章 工业发酵菌种的选育
第一节 工业发酵生产菌种 第二节 生产菌种的选育
第三节 工业发酵生产菌种的保藏
第一节 工业发酵生产菌种
一、工业发酵微生物及其代谢产物 (一)微生物代谢产物的类型 1．初级代谢产物 2．次级代谢产物
• 初级代谢主要是指把营养物质转化为机体结构和生
理活性物质以及提供能量的代谢作用。
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
3、生长圈法
• 工具菌是一些营养缺陷型菌株。 • 将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少
工具菌所需营养物的平板培养基上，进行 培养，若某菌株能合成工具菌所需营养， 在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的 生长圈。
细菌分离：以乳酸菌为例
取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中
加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h
2、从菌种保藏机构获得。 3、从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变
的优良菌种。
第二节 生产菌种的选育
一、自然选育 二、诱变育种 三、杂交育种 四、基因工程育种
一、自然选育
• 在生产过程中，不经过人工诱变处理，利
用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程， 称为自然选育或自然分离。
1、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照
1、变色圈法
• 在底物平板上加入指示剂或显色剂，由于目的微
生物分解底物或代谢产引起平板上出现变色圈， 使所需微生物能够被快速鉴别出来。 • 例如，筛选果胶酶产生菌时，用含0．2％果胶为唯一碳源，
待培养基平板菌落长成后加入0．2％刚果红溶液染色4 h， 具有分解果胶能力的菌落周围便出现绛红色水解圈。
• 微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁
殖所必需的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物。
初级代谢产物包括分解或合成过程中的各种中 间代谢物、前体物、高分子物质以及能量代谢和代 谢调控中起作用的各种物质，如氨基酸、核苷酸、 蛋白质、多糖和核酸等。
• 次级代谢是微生物在一定的生理阶段出现的
一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免 在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不 利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类 型，次级代谢产物通常是在生长后期合成。
步骤十
在营养平板上贴好标签， 标示好接种日期、操作者 姓名、菌种学名以及培养 基名称。
（四）生产能力的考察
1、初筛——以量为主
• 初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目
的产物的菌种筛选出来的过程。
平板筛选 摇瓶发酵筛选
2、复筛——以质为主
（五）微生物选择分离的原理和方法
1、变色圈法 2、透明圈法 3、生长圈法 4、抑菌圈法