解旋酶

不同生物解旋酶的氨基酸序列分析发现它们有9 个高度保守的序列，分别称为Q、I、Ia、Ib、II、III、IV、V 和VI（Fairman-Williams et al., 2010）（图1-2），这说明所有的解旋酶可能起源于相同的基因。这些保守区域是ATP 酶、解旋酶活性以及NTP 和DNA 结合的功能区。其中基序Ia 区通常是GTP 和ATP 结合区；Ⅱ区是ATP 结合蛋白B 区的特殊翻版；I 区可形成一套索结构与NTP 磷酸结合，其结构属ATP 结合蛋白的A区；而Ⅱ区保守的天冬氨酸与镁离子介导的磷酸结合有关；Ia 以及Ⅵ区的保守酪氨酸与可能的DNA 结合蛋白相关，提示涉及多核苷酸的结合；基序VI 则参与ATP 磷酸盐的结合；其他的基序（Ia、Ib、IV、V）则参与RNA 结合以及通过RNA 结合激活ATP 水解的活性；III 是RNA 解旋酶活性必需的结构。

依据以上Motif 的不同，真核生物的解旋酶分为两个大家族Helicase superfamily I和II （SFI 和SFII）（图1-3），其中多数RNA 解旋酶属于SFII，少数属于SFI（Fairman-Williams et al., 2010）。SFI 一般是真菌中的解旋酶；高等植物、酵母、动物中一般都是SFII，它又分为DEAD-box、DEAH-box、DExH、RecQ 和SW1/SNF。

解旋酶SF1 和SF2 的家族分类，引自Fairman-Williams et al., 2010Figure1-5, Helicase SF1 and SF2 family classification .2006 年，RIKEN 基因组科学中心、冈崎研究所的研究人员发现，果蝇DEAD-boxprotein Vasa 的催化核的结构，该催化核与一个单链RNA 和一个ATP 类似物形成复合体。ATP 类似物紧密与这两个结构域结合，并使他们变成更为紧密的形式，而且保守残基间发生域间相互作用。

核糖体rRNA 的成熟和核糖体亚基的装配涉及至少170 个辅助蛋白，包括内切和外切核糖核酸酶、RNA 解旋酶、‘伴侣’或‘组装因子’和很多小核仁核糖核蛋白蛋白（snoRNPs）（Venema et al., 1999;de la Cruz et al., 1999）。在这个复杂的途径中很多步骤涉及RNA 结构的变换，这需要能量的参与。因此，参与核糖体合成的最大的一类作用因子就是RNA 解旋酶。已经确定的酵母中有16 个RNA 解旋酶参与核糖体的组成过程，其中Dbp4p，Dbp8p，Dhr1p，21Dhr2p，Fal1p，Rok1p，和Rrp3p 对于pre-rRNA 早期A0 到A2 的剪接过程是必须的，敲除这些RNA解旋酶导致pre-rRNA加工的异常，说明这些蛋白质相互间没有功能冗余（dela Cruz et al., 1999）(图1-5)。Rok1p 抑制18S pre-rRNA 在A0、A1 和A2 位点的剪接，导致无法合成成熟的18S rRNA。

真核细胞的分化需要来自细胞核到细胞质的转运RNA 分子、蛋白和联合体。通过拟南芥的突变体得到的CRYOPHYTE/LOS4 基因，它编码DEAD-box RNA 解旋酶，并且IMG1 基因编码DEAH‐box RNA 解螺旋酶参与拟南芥雌配子体的发育22已证实与mRNA 的输出有关，还在植物的发育及抗逆中有重要作用（Gong et al., 2005）。酵母中Dbp5p 也与细胞核内带有polyadenylated [poly(A)+]的mRNA 输出有关，Dbp5p主要定位在核膜周围，细胞质中也有少量定位。它可以与CAN/Nup159p 相互作用，从而招募细胞质核孔复合纤维，在细胞质中mRNA 从转运复合体上解离有关。

在真核细胞中，翻译的调节在基因表达调控方面具有十分重要的作用。翻译的调节主要出现在起始阶段，真核细胞翻译起始因子（eukaryocyte protein translation initiationfactors，elFs），它们在翻译起始的过程中发挥各自不同的作用。其中elF-4A 和elF-4B都是依赖于ATP 的DEAD-box RNA 解旋酶，能打开mRNA 分子中的二级结构，保证翻译的顺利进行。酵母中，通过遗传学和生物化学实验，elF-4A 在翻译起始中的作用已被证实。elF-4A蛋白的活性可能被不同的mRNA 分子的各种加工所需要（Rogers et al., 2002; Svitkin etal., 1996）。1992 年，Metz 等人从拟南芥中克隆获得eIF-4A，证实其功能是真核生物中的翻译起始因子（Metz et al., 1992）。细胞器的基因表达在真菌和高等真核生物中，线粒体、叶绿体中基因组的表达需要RNA 解旋酶蛋白。如烟草中的VDL 基因对于叶肉栅栏组织和叶绿体的发育是必须的，它编码一个定位在叶绿体中的DEAD-box RNA 解旋酶，vdl 突变体叶片组织

变白变形，缺失栅栏组织，检测到未分化的质体；除此之外，突变体的根和花在形态上也是异常的（Wang et al.,山东农业大学博士学位论文232000）。叶绿体中包含至少6 个DEAD box RNA 解旋酶（RH3、RH22、RH39、RH47、RH50、RH58），线粒体中包含2 个（PMH1 和PMH2）。其中拟南芥atrh3、atrh22突变体的幼苗都是淡绿色的，RH3 在23S rRNA 前体的剪接以及50SrRNA 后期的组装中起作用。

真核生物生物里许多基因是不连续的，由内含子和外显子组成。转录初始的转录本RNA 分子中同时具有一个基因的外显子和内含子需要通过剪接作用，去除内含子序列，将外显子的序列连接起来，再经过修饰等加工过程形成成熟的mRNA（图1-6）。真核生物mRNA 的剪接反应的第一步分枝点腺嘌呤的2’-羟基对5’端外显子和内含子交界处的磷酸二酯键发动亲核攻击，形成外显子1 和套索结构的外显子的中间体2，第二步是切下的外显子1 的3’-羟基继续对内含子3’端的交界序列进行亲核攻击，切下的外显子2 的5’磷酸和外显子1 的3’羟基形成磷酸二酯键，这样两个外显子就连接到一起，同时释放出套索结构的内含子（Carlson et al., 2004）。mRNA 前体的剪接机制在进IMG1 基因编码DEAH‐box RNA 解螺旋酶参与拟南芥雌配子体的发育24化上保守（Lorković et al., 2000）。图1-8，mRNA 前体中内含子的剪接过程及剪接复合体的循环（Lorković et al., 2000）Figure 1-8, Pre-mRNA splicing and the spliceosome cyclemRNA 的剪接过程依赖于反式作用因子（trans-acting factor）依次的与mRNA 前体相互作用，形成剪接体的催化核心。参与剪接过程的剪接因子分为两类：一类是小核糖核蛋白颗粒（snRNP）U1、U2、U4/U6 和U5，它们分别包括U1、U2、U4/U6 和U5 小分子核内RNA（snRNA），每个蛋白颗粒都包含共同蛋白和特异蛋白；另一类是不包括snRNA 的蛋白质（Madhani et al., 1994; Nilsen et al., 1994）。质谱分析鉴定大于200种蛋白参与剪接过程，其中至少60 个为snRNP 特异蛋白（Hartmuth et al., 2002; Zhou etal., 2002）。U1 snRNP 和mRNA 前体的5’剪接位点结合，U2 snRNP 随即识别前提的分枝结构，形成剪接体前体。随后，U4/U6 和U5 snRNP 三聚复合体结合识别前体结构，形成成熟的剪接体。剪接体的催化过程启动需要其复合体的结构重排，首先U4/U6 解链是非常关键的一步，U2 和U6 相互作用形成新的复合体，U1 snRNP 从5’剪接位点释放，U6snRNA 结合上去。U1 和U4 snRNA 从剪接体中释放，剪接体激活。U5 RNA 具有保守的loop1 与外显子的5’和3’剪接位点相互作用参与到剪接过程，U5 snRNP 在剪接体的组装和剪接过程中起关键作用。

U5 snRNP 在剪接体中的作用剪接过程并不直接需要能量，但RNA-RNA，RNA-蛋白质之间的分子重排却是一个耗能的过程，这个过程中需要ATP 依赖的RNA 解旋酶以及GTPase 的参与。组成U5snRNP 的特异蛋白中有三个NTPase，其中Prp28p 和Brr2p 为DExD/H box 蛋白，Snu114p为GTPase，它与翻译延伸因子EF-2 同源性很高。在剪接过程中，两个关键的解链过程均需要U5snRNP 参与（图1-11）。一为U1与5’剪接位点的分离。在U1 snRNA 的释放以及U6 snRNA 在5’剪接位点的结合，需要U5 snRNP 特异蛋白ATP 依赖的DExH-box RNA 解旋酶Prp28p 的参与才能完成（Fabrizio et al., 1997; Stevens et al., 2001）。二是U4/U6 的解链需要U5 snRNP 的参与。U4/U6-U5 snRNP 三聚体复合体中，U4 snRNA 和U6 snRNA 形成配对结构，从而阻止剪接体催化活性中心的形成。Brr2p 参与U4/U6 的解链过程，进一步研究表明，该蛋白的ATP 水解酶活性在U4/U6 的解链以及U4 和U6 snRNP 的释放中起关键作用（Raghunathan et al., 1998）。这个蛋白为U6 和5’剪接位点的释放以及U6、U2 复合体形成起动力作用。然而剪接体在特定的时间激活需要其它剪接因子的调控。酵母中Snu114p 是U5 snRNP 特异蛋白，在人类中的同源蛋白为U5-116K，它包括翻译延伸因子EF-2 蛋白具有的四个典型的结构域和一个富含疏水氨基酸的N 端序列。N 端序列缺失的Snu114p 突变体为温度敏感性突变体，在37℃下致死并且导致U4/U6 的积累，这表明该蛋白参与U4/U6 的解链。研究表明，Snu114p 活性需要其GTP 的结合