赖解旋酶恒温基因扩增技术的研究进展
等温扩增技术的原理及其在病原检测中的应用
Ｐｒ ｏｇｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄｉ ｃ ｉ ｎ ｅ
等 温 扩 增 技 术 的原 理 及 其在 病 原 检 测 中 的应 用
高 瑶 。 ， 孟 星 宇 ， 罗 玉 子 ， 胡 永 浩 ， 仇 华吉¨
（ １ ． 中 国农 业 科 学 院 哈 尔 滨 兽 医 研 究 所 兽 医生 物 技 术 国 家 重 点 实 验 室 ， 黑 龙 江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ６ ９ ； ２ ． 甘 肃 农 业 大 学 动物 医 学 院 ， 甘肃兰州 ７ ３ ０ ０ ７ ０ ）
摘 要 ： 等温扩增 技术 （ Ｉ Ａ Ｔ） 作 为一种新 型的体 外核 酸扩增技 术 ， 与Ｐ Ｃ Ｒ相 比 ， 该技 术具有 特异性 强、 敏 感 性高、 简单便 捷 和 成 本 低 等 优 点。 目前 ， 等 温扩 增 技 术在 病 原 检 测 方 面得 以应 用 ， 论 文 对 环介 导 等 温 扩 增 （ Ｌ ＡＭＰ ） 、 依 赖解 旋酶的等 温扩增 （ ＨＤ Ａ） 、 依赖核 酸序 列的等温扩增 （ ＮＡ Ｓ Ｂ Ａ） 、 链 置换等 温扩增（ Ｓ Ｄ Ａ） 、 交叉 引 物扩 增 （ ｃ Ｐ Ａ） ５种扩增技 术 的原 理 、 特点及应 用分 别予以介绍 ， 为该技 术在病原检 测 的实际应用提供参 考。 关键 词 ： 等 温扩增技 术 ； 原理； 病 原检 测
ｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｓ Ｄ Ａ） 和交叉 引物扩增 （ ｃ ｒ ｏ ｓ ｓ — ｐ ｒ ｉ ｍｉ ｎ ｇ
优点 ： 该 方 法在 等温 条件下 进行 ， 不 需 要循 环 仪 等 昂贵 的 仪器 ； 扩 增 反应 快 ， 一般 在 １ ｈ内 完成 ； 扩
恒温扩增技术综述
恒温扩增技术综述(总6页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。
目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。
它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。
本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。
关键词：恒温扩增；PCR引言：近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。
与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。
所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。
1滚环核酸扩增1. 1 滚环核酸扩增的原理滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。
线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。
核酸扩增新技术
核酸扩增新技术鲁雪;李赟;黄倢【摘要】核酸扩增技术广泛应用于生命科学及其相关的各个领域,对生命科学的发展发挥着重要的作用.论文对核酸扩增的一些新技术进行综述,包括环介导等温扩增(LAMP)技术,赖解旋酶恒温基因扩增(HDA)技术,固相PCR技术,指数富集配体的系统进化(SELEX)技术,SOLEXA高通量测序技术.这些新技术具有重要的应用价值,随着技术的不断完善,将会有广阔的应用前景.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2010(031)003【总页数】4页(P103-106)【关键词】LAMP技术;HDA技术;固相PCR技术;SELEX技术;SOLEXA技术【作者】鲁雪;李赟;黄倢【作者单位】中国海洋大学水产学院,山东青岛,266003;中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室,山东青岛,266071;中国海洋大学水产学院,山东青岛,266003;中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室,山东青岛,266071【正文语种】中文【中图分类】S854.43聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是体外扩增 DNA序列的技术,它的基本原理类似于DNA的天然复制过程。
自1985年PCR技术建立以来[1],该技术不断发展,逐渐成为分子生物学、基因组学、疾病诊断等领域的基本研究手段。
PCR反应过程包括变性、退火和延伸三个阶段,因此PCR技术需要特殊的热循环仪器,耗时长(2 h～3 h)。
由于PCR技术灵敏度高,容易产生假阳性反应,并且,由于检测形式单一,结果不易判读[2]。
因此,亟需更加有效的核酸扩增方法来替代PCR技术。
目前,在聚合酶链反应这一基本原理的基础上发展出来一系列新的核酸扩增概念和实验方法,本文简要介绍了几种新的核酸扩增技术。
1 环介导等温扩增技术环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermalamp lification,LAMP)是一种简单、快速、特异性强、耗费低的核酸扩增技术,可以在等温条件下一步完成。
食品沙门氏菌检测方法进展
食品沙门氏菌检测方法进展沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，而且，沙门氏菌的检验在食品检测中具有重要意义。
建立一种快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题。
本文认为，传统方法可以对沙门氏菌做出鉴定，但需要4～7 d的时间；以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，且灵敏性高和特异性强；以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于沙门氏菌检测。
但是这些方法仍然存在一定的不足，需要进一步加以改进，关于食品中沙门氏菌的检测方法的研究还有待进一步深入。
标签：沙门氏菌；微生物；进展沙门氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，在自然界中分布广泛，寄生在人类和动物的肠道内，对营养要求不高，耐胆盐，对外界的抵抗力较强。
该菌有200多种，致病的只占少数，如伤寒、副伤寒菌。
引起食物中毒或败血症，如鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等十余种，沙门氏菌血清型繁多，已知的就有2500多个，而且几乎所有的沙门氏菌都会污染食物引起发病，是人畜共患的肠道病原菌。
沙门氏菌中毒常常是大面积的，致病速度快，给人类健康带来极大威胁。
繁杂的各类生化反应型，使常规检验程序复杂繁琐、耗时费力，不仅给检验部门带来沉重的负担，而且还使产品运转和仓贮的时间延长，费用增加。
提高检测技术是有效控制该菌的重要手段，尤其是大面积普查时更需要快速简便的检测方法。
近年来，随着免疫学实验技术和分子生物学技术的发展，沙门氏菌检验技术的研究也有了新的研究进展。
本文将近年来关于沙门氏菌检验技术研究进展情况作以概述。
1沙门氏菌的检测1.1传统方法检测（国标法GB 4789.4-2010）。
吸取待测样品25ml于225ml 缓冲蛋白胨水（BPW）中，于36℃培养18～24h。
取BPW增菌液1ml转接到10ml四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液中，于42℃培养18～24h。
另取BPW增菌液1ml转接到10ml亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液中，于36℃培养18～24h。
溶藻弧菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法的建立
Ｍ ｅ ｈ ｄ ｆ ｒ Ｄｅ ｅ ｔｎ ｂ ｏ ＡＺ Ｄ ｃ ｔ ｏ ｏ ｔ ｃ ｉ ｇ Ｖｉ ｉ ｇｆ Ｚ
ＱＩ ｈ ｎ —ｉ Ｎ Ｓ ｅ ｇｌ ．Ｗ ＡＮＧ ｉｎｇ ａ ｇ’ Ｊ ａ —ｕ ｎ
（ ． ｌｅ ｅ ｉａ １ ＣｏｌｇｅｏｆＣｈ ｍ ｃｌＥｎｇｎ ｅ ｉｇ，Ｑｉｇ ａ ｉｅ ｓｔ ｆＳ ｉｎ ｅａ ｄＴｅ ｈ ｏｏ ｙ，Ｑｉｇ ａ ６ ０ ２， ｉａ ｉｅ ｒｎ ｎ ｄ ｏ Ｕｎｖ ｒｉｙｏ ｃｅ ｃ ｎ ｃ ｎ ｌｇ ｎ ｄ ｏ ２ ６ ４ Ｃｈｎ ２ Ｓ ａ ｄ ｎ ｔｙＥｘｔＩ ｓ ｅ ｔｏ ｎ ａ ａ ｉ ｒａ ． ｈ ｎ ｏ ｇ Ｅｎ ｒ ｉ ｎ ｐ ｃｉｎ ａ ｄ Ｑｕ ｒｎｔ Ｂｕ ｅ ｕ，Ｑｉｇ ａ ６ ０ ２，Ｃｈ ｎ ） ｎｅ ｎ ｄｏ２ ６ ０ ｉ ａ
ｍｍｏ ・Ｌ 。 Ｃ ２ ５ ｍｍｏ ・Ｌ 二 硫 苏 糖 醇 ］ ｌ ＿ Ｍｇ １， ｌ
２ ０ Ｌ， 甲基亚 砜 ２ ５ Ｌ， 板 Ｒ Ｌ 弓 ． 二 ． 模 ＮＡ ５ ， Ｉ
物 Ｆ、 １ ｔｏ Ｒ（ ０ ｏ ｌ・Ｌ 各 １ Ｌ， ＮＴＰ ． 一） ｄ ｓ ２５
［
。
溶藻 弧菌 过 去一 直 被 认 为 不 致 病 或 仅 能
引起 部分创 伤性 感染 而未 受重视 ， 到 １ ８ 直 ９ ０年 才
收稿 Ｅ期 ：２ １ 一 ５ １ ｔ ０ １Ｏ — Ｏ 基 金 项 目 ：国家 质 检 总 局科 研 项 目（０ ８Ｋ１ ０ ； 东 出 入境 检 验检 疫 局 科 研 项 目（ Ｋ２ ０ ２ ） ２０Ｉ ４）山 Ｓ ０ ８ １ 作 者 简 介 ： 胜 利 （ ９ ９ ） 男 ， 士研 究 生 ． 秦 １ ７ ， 硕
ｌ ｈ Ｎｕ ｌｉ ｉ ｅ ｕ ｎ ｅ ｂ ｓ ｄ Ａｍｐ ｉ ｃ ｔｏ ｔ ｏ ．Ｓ ｅ ｉ ｃｔ ｎ ｅ ｓｔｖｔ ｒ ｉ ｃ ｅｃ Ａｃｄ Ｓ ｑ ｅ ｃ — ａ ｅ ｓ ｌ ｉａ ｉ ｎ ｍｅ ｈ ｄ ｆ ｐ ｃ ｆ ｉ ａ ｄ ｓ ｎ ｉｉ ｉ ｗｅ ｅ ｉ ｙ ｙ ｔ ｓ ｅ ． ｅ ｒ ｓ ｌｓｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｅ ｓｔｖ ｔ ｆＮＡＳ ｅ ｔ ｄ Ｔｈ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔｔ ｅ ｓ ｎ ｉ ｉｙ ｏ ｉ ＢＡ ｓ６ ９ １ ｆ ・ｍ Ｌ ｗｈ ｃ ｗａ ． × ０ ｃ ｕ 一 ｉｈ ｗａ ｉ ｈ ｒ ｔ ａ ｈ ｅ ｕ ｔｏ ｓｈ ｇ ｅ ｈ ｎ ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｆ ＰＣＲ ｍｅ ｈ ｄ ｔ ｏ ．Ｄｅ ｅ ｔｎ ｂ ｏ ａ ｇ ｎ ｌ ｔ ｃ ｓ ｗｉ ｔ ｃ ｉ ｇ Ｖｉ ｉ ｌ ｉ ｏ ｙ ｉ ｕ ｔ ＮＡＳ Ａ ｈ Ｂ
应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌
应 用 依 赖 解 旋 酶 Ｄ Ａ 恒 温 扩 增 技 术 Ｎ 检 测 副 溶 血 性 弧 菌
石 琰 璩 王 建 广 ， 保 海 张 健 祝 素 珍 刘 云 国 。姜 英 辉 雷 质 文 “ 。杨 大 伟 ， 房 ， ， ， ， ，
第 ３卷 第 １ ２ 期 青 岛 科 技 大 学 学 报（ 自然 科 学 版 ） Ｖ １３ ｏ １ ｏ． ２ Ｎ ． ２ １ 年 ２月 ０ １ Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｎ ｄ ｏ Ｕｎｖ ｒｉ ｆ ｃ ｎ ｅ ｎ ｃ ｎ １ ｙ Ｎ ｔ ｒ ｌ ｃ ｎ ｅＥ ｉｏ ） ｏ ｒ ａ ｏ ｇ ａ ｉｅｓ ｙｏ ｉ ｃ ｄＴｅｈ ｏｏ （ ａ ｕａ Ｓ ｉ ｃ ｄｔ ｎ Ｆ ｂ ２ １ Ｑｉ ｔ Ｓ ｅ ａ ｇ ｅ ｉ ｅ ．０ １
ｗｈ ｃ ｓ ｓｍ ｉ ｒｔ ｈ ｅ ｕｌ ｏ ｉｈ ｗａ ｉ ｌ ｏｔ ｅｒ ｓ ｔ ｆＰＣＲ ｔ ｏ ． Ｄｅ ｅ ｔｎ ｂ ｉ ｒ ｈ ｅ ｌ ｉｕ ｔ ＤＡ ａ ｍｅ ｈ ｄ ｔｃ ｉｇ Ｖｉｒ ｏｐａ ａ ａ ｍｏ ｙｔｃ ｓｗｉｈ Ｈ
ｉ ｐ ｃｆ ｎ ｅ ｓｔ ｅ ａ ｌ ａ ｓｓ ｅ ｉｉ ａ ｄ ｓ ｎ ｉｉ ｓｗｅｌ ｓＰＣＲ ｔ ｏ ｎ ａ ｏ ｒ ｉｓ ｒ ｍｅ ｔｌｒ ｑ ｒ ｍｅ ｔ ｃ ｖ ｍｅｈ ｄ ａ ｄ ｈ ｓ ｌｗｅ ｎ ｔ ｕ ｎ ａ ｅ ｕｉｅ ｎ ．
Ｋ ｅ ｒ ｓ Ｖｉ ｒ ｏ ｙ ｗｏ ｄ ： ｂ ｉ ｐａｒ ｈａ ｍ ｏ ｙｔｃ ｓ； ｄｅ ｅ ｔｏｎ； ｈ ｌｃ ｓ — ｐｅ ｅ ｔ ｓ ｈｅ ｍ ａ ＤＮ Ａ ａ ｅ ｌ ｉｕ ｔ ｃｉ ｅ ｉａ ｅ ｄｅ ｎｄ ｎ ｉｏｔ ｒ ｌ ａ ｐｌ ｉａ ｉｎ ｍ ｉ ｃ ｔｏ ｆ
核酸恒温扩增技术研究进展
Ｂ ｉｎ ｎ ｙ Ｅ ｉ Ｉｓｅｔ ｎ ａｄ Ｑ ａａ ｔ ｅ Ｂ ｒａ ， ｅ ｉ ０ ０ ６ Ｃ ｉａ ｅ ｉｇＥ ｔ — ｘ ｎｐｃ ｏ ｎ ｕ ｒ ｉ ｕｅｕ Ｂ ｉｎ １ ０ ２ ， ｈｎ ｊ ｒ ｔ ｉ ｎｎ ｊｇ
ｓ ａ ｄ ｄ ｓ ｌ ｃ ｍｅ ｔ ａ ｌ ｉａ ｉｎ ｎ ｃｅ ｃ ａ ｉ ｅ ｕ ｎ ｅ ｂ ｓ ｄ ａ ｌ ｃ ｔ ｎ ｒ ｌ ｎ ｃｒｌ ａ ｌ ｃ ｔ ｎ ｎ ｃ ｉ ｇ ｔ ｎ ｉｐ ａ ｅ ｎ ｍｐ ｉ ｃ ｔ ， ｕ ｌｉ ｃ ｄ ｓ ｑ ｅ ｃ － ａ ｅ ｍｐ ｉ ａｉ ， ｏｌ ｇ ｉｃｅ ｍｐ ｉ ａｉ ， ｉ ｋｎ ｒ ｆ ｏ ｉ ｆ ｏ ｉ ｉ ｆ ｏ ｅ ｚ ｍｅ ｍｅ ｉｔ ｄ ａ ｌ ｃ ｔ ｎ ｅｉａ ｅ ｄ ｐ ｎ ｅ ｔ ｉ ｔ ｅ ｍａ Ｄ ｎ ｙ ｄ ａｅ ｍｐ ｉ ａ ｉ ，ｈ ｌ ｓ — ｅ ｅ ｄ ｎ ｓ ｈ ｒ ｌ ＮＡ ｍｐ ｉ ｃ ｔ ｎ ｙ ｒｄ ｃ ｐｕ ｅ ｔａ ． ｉ ｆ ｏ ｃ ｏ ａ ｌ ａｉ ，ｈ ｂ ａ ｔ ｒ ，ｅ １ ｉ ｆ ｏ ｉ
综
述
核酸恒温 扩增技术研 究进展
汪琳 ， 罗英 ， 琦 ， 周 赖平 安 ， 亚铎 柏
北 京 出入 境 检 验 检 疫 局 检 验 检 疫 技 术 中心 ． 京 １ ０ ２ 北 ００６
［ 要 ］ 核 酸 恒 温 扩增 技 术 在 生 命 科 学研 究及 相 关 诸 多领 域 已经 得 到 了广 泛 应 用 。 我 们 对 核 酸 恒 温 扩 增 技 术 的 最 摘 新 进 展 作 一 简 要 综述 ， 括 环介 导恒 温扩 增 、 替 代 扩 增 、 赖 核 酸序 列 的扩 增 、 环 扩 增 、 口酶 核 酸 恒 温 扩 增 、 包 链 依 滚 切 依 赖 解 旋 酶 的 恒 温扩 增 、 录 依赖 的扩 增 、 交捕 获 法 、 录介 导 的扩 增 等 的 原理 、 缺 点及 应 用 。 转 杂 转 优 【 键 词 ］ 核 酸 恒 温扩 增 ； 介 导 恒 温扩 增 ； 替 代 扩 增 ； 赖 核 酸 序 列 的 扩 增 ； 环 扩 增 关 环 链 依 滚
重组酶聚合酶扩增技术的研究进展及其应用
重组酶聚合酶扩增技术的研究进展及其应用杜亚楠;赵笑;范小瑞;张琪;赵凯;许燕【摘要】重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型的恒温核酸扩增技术.本文介绍了RPA技术的扩增原理、引物设计、成本分析及产物检测等内容,归纳了RPA技术与其他等温扩增方法的优缺点,并对RPA技术在病原微生物、基因突变和食品安全检测中的应用现状进行了阐述.希望RPA技术可以得到更多生物学家的关注,更好地应用于生命科学的各个领域.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2018(034)006【总页数】6页(P117-122)【关键词】重组酶聚合酶扩增;核酸检测;引物设计;产物检测;研究进展【作者】杜亚楠;赵笑;范小瑞;张琪;赵凯;许燕【作者单位】上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海市农业科学院生物技术研究所,上海201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海市农业科学院生物技术研究所,上海201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234【正文语种】中文【中图分类】Q78核酸体外扩增技术是生命科学研究中最常用的技术之一。
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，简称PCR)发明于1983年，目前已经成为应用最为广泛的核酸扩增技术[1]。
该技术特异性强、灵敏度高，但需要昂贵的控温循环仪，难以推广到现场检测。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，恒温核酸扩增技术的出现解决了PCR技术在仪器上的局限性。
该技术不需要温度循环且反应更加快速，非常适用于资源有限地区的现场检测[2]。
目前已报道的的恒温扩增技术有十几种[3]。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)是一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增新技术[4]，可在23—45℃下连续进行反应，反应时间只需5—20min，特异性强、灵敏度高，非常适用于疾病诊断和现场检测。
依赖解旋酶的等温扩增技术
依赖解旋酶的等温扩增技术 HDA
信息来源：
依赖解旋酶的等温扩增技术 HDA
依赖解旋酶DNA 恒温扩增技术( Helicase-dependent Isothermal DNA Amplification, HDA)是由美国NEB公司研究⼈员V incent等于2004年发明的⼀种新型核酸恒温扩增技术。
该技术模拟⾃然界⽣物体内DNA 复制的⾃然过程, 在恒温条件下利⽤解旋酶解开DNA双链, 同时DNA单链结合蛋⽩( single- stranded DNA - binding protein, SSB )稳定解开的单链, 并为引物提供结合模板, 然后由DNA 聚合酶催化合成互补链。
新合成的双链在解旋酶的作⽤下⼜解成单链, 并作为下⼀轮合成的模板进⼊上述的循环扩增反应, 最终实现靶序列的指数式增长。
⽂章延伸阅读：LAMP，环介导，等温扩增，恒温扩增，实时浊度仪，等温PCR，bst酶
⽂章由紫⼩晨编辑发布,⽬的仅为了传递互联⽹信息。
如侵犯您的版权请及时与紫⼩晨联系，我们将第⼀时间予以删除，感谢您的⽀持。
恒温扩增技术的原理与用途探究
恒温扩增技术的原理与用途探究即通过对靶序列的特异性扩增，使其产生大量拷贝，以达到检测水平。
主要包括以下技术。
环介导等温扩增技术，又称为环媒恒温扩增技术或连环恒温扩增技术，是由Notomi等于2000年所开发的一种核酸扩增技术[7]。
LAMP的核心是具有链置换活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的应用以及基于靶核酸6个特异性片段（即5’端的F1、F2和F3区和3’端的B3c、B2c和B1c区，其中F2区和B2区为目的扩增片段）的4条特殊引物的设计，分别为上游内部引物（FIP，由F1c区和F2区组成）、下游内部引物（BIP，由B1c区和B2区组成）、上游外部引物（F3，由F3区组成）及下游外部引物（B3，由B3组成）。
整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段。
⑴起始阶段：FIP的F2序列首先和模板F2c结合，引领合成互补链；随后，F3与模板F3c结合，在BstDNA聚合酶的作用下启动链置换合成并释放出结合有FIP的完整互补链。
此单链5’端F1c和F1自我碱基配对形成环状结构。
以此链为模版，引物BIP和B3以相同的方式引领另一端链合成、链替换，从而形成哑铃状结构的单链。
F1c末端可自发引领补齐中间单链缺口,使哑铃状单链转化为双链茎环结构。
此产物可作为下一阶段的起始物为LAMP基因的扩增循环提供模板。
⑵循环扩增阶段：引物FIP与茎环结构结合,以双链中一条链为模板延伸,并释放出另一条链,；释出链游离3c端自身成环,引发链延伸取代并释放FIP引领合成的链,两产物均可作为下一循环的起始物。
引物BIP和FIP与上述产物的茎环结合重复以上延伸过程,使产物延长同时释放新的链成环并作为新的起始物。
其最终产物为一系列长度不同的茎环状双链DNA片段。
LAMP灵敏度高、特异性好，且操作简便、快速，结果易于判定，这些优点使得该技术自成立十余年以来在病毒、细菌、寄生虫等各类病原体的基因检测上得到了广泛应用。
一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法[发明专利]
![一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/51edf8551fd9ad51f01dc281e53a580217fc505f.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710325050.0(22)申请日 2017.05.10(71)申请人 山东师范大学地址 250014 山东省济南市文化东路88号(72)发明人 张春阳 马飞 刘萌 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限公司 37221代理人 薛鹏喜(51)Int.Cl.C12Q 1/68(2006.01)(54)发明名称一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法(57)摘要本发明公开了一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法，步骤如下：(1)提取样品中的总RNA；(2)向提取的总RNA中加入单链DNA探针和过量的核酸外切酶I，在反应缓冲液中进行孵育，实现目标microRNA与单链DNA探针的特异性结合，利用过量的核酸外切酶I将多余的单链DNA探针消除；(3)向步骤(2)的反应体系中加入上游引物、下游引物、单链结合蛋白和解旋酶，对目标microRNA进行扩增反应，通过荧光信号检测目标microRNA的表达。
本发明借助核酸外切酶I的消化以降低背景、利用解旋酶辅助的恒温扩增(H D A )反应以放大信号，实现了对microRNA的快速和高灵敏检测。
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图2页CN 107130024 A 2017.09.05C N 107130024A1.一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法，其特征在于，步骤如下：(1)提取样品中的总RNA；(2)向提取的总RNA中加入单链DNA探针和过量的核酸外切酶I，在反应缓冲液中进行孵育，实现目标microRNA与单链DNA探针的特异性结合，利用过量的核酸外切酶I将多余的单链DNA探针消除；(3)向步骤(2)的反应体系中加入上游引物、下游引物、单链结合蛋白和解旋酶，对目标microRNA进行扩增反应，通过荧光信号检测目标microRNA的表达。
一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用[发明专利]
![一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/75668411abea998fcc22bcd126fff705cc175cbc.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.12.24C N 104232622A (21)申请号 201410535579.1(22)申请日 2014.10.11201410492302.5 2014.09.24 CNC12N 15/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人中国人民解放军疾病预防控制所地址100071 北京市丰台区东大街20号(72)发明人刘威 袁静 陈泽良 黄留玉董德荣(74)专利代理机构北京尚诚知识产权代理有限公司 11322代理人鲁兵(54)发明名称一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法，是用一对寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互为反向的核苷酸片段，在恒温条件下使得目的基因在引物及DNA 聚合酶的作用下进行聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。
本发明为核酸检测提供了新的技术平台，扩增产物比较简单，不仅可以应用在检测领域，还可以再稍加处理后对扩增产物进行克隆回收和测序，该方法可以应用在所有需要核酸扩增的领域，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
(66)本国优先权数据(51)Int.Cl.权利要求书3页 说明书11页序列表3页 附图5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书3页 说明书11页序列表3页 附图5页(10)申请公布号CN 104232622 A1.一种用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法，是用一对寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互为反向的核苷酸片段，在恒温条件下使得目的基因在引物及DNA聚合酶的作用下进行聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。
2.根据权利要求1所述的恒温扩增核酸的方法，其特征在于：所述聚合酶螺旋反应(PSR)的最基本引物只包括一对引物，一条正向引物FP和一条反向引物BP，，F和B为引物设计区，它们之间为延伸区，在这两条引物的引导下，聚合酶螺旋反应(自螺旋链式反应)就可以开始：FP(Forward Primer)：该引物由F区域和N区域两部分组成，F区域与靶序列的Fc区域互补，N区域是一段特别的序列，可以来自靶序列本身，也可以来自外源序列，但必须和BP 引物5′端N区域序列一样；BP(Backward Primer)：该引物由B区域和N区域两部分组成，B区域与靶序列的Bc区域互补，N区域是一段特别的序列，可以来自靶序列本身，也可以来自外源序列，但必须和FP引物5′端N区域序列一样。
鱼类鳗弧菌赖解旋酶基因扩增技术的建立
鱼类鳗弧菌赖解旋酶基因扩增技术的建立梁君妮;尹伟力;刘宁;许红岩【摘要】为建立一种鱼类鳗弧菌的快速检测方法,本研究以鳗弧菌的toxR基因为靶基因设计特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了基于赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的鳗弧菌快速检测方法.结果显示,该方法对鱼类鳗弧菌检测为阳性,而对其他鱼类病原菌的检测结果均为阴性,具有良好的特异性;标准菌株菌体基因组DNA最低检测限为30 ng/mL,人工污染模拟样品的最低检出限为2.1×102 cfu/mL;利用该方法与普通PCR方法对临床120份鱼类样品进行检测,符合率为100％,检出率均高于细菌培养法.本研究建立的检测鳗弧菌的HDA法具有快速、简便、特异、灵敏等特点,适合基层实验室使用,具有广泛的应用前景.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2015(037)008【总页数】4页(P628-631)【关键词】鳗弧菌;检测;赖解旋酶DNA恒温扩增技术【作者】梁君妮;尹伟力;刘宁;许红岩【作者单位】烟台出入境检验检疫局,山东烟台264000;烟台出入境检验检疫局,山东烟台264000;烟台出入境检验检疫局,山东烟台264000;烟台出入境检验检疫局,山东烟台264000【正文语种】中文【中图分类】S852.61弧菌广泛分布于淡水环境和海水环境，许多研究表明，有多种弧菌是鱼类的重要条件性病原菌，主要包括鳗弧菌、灿烂弧菌、创伤弧菌、溶藻胶弧菌和哈维氏弧菌等[1]。
其中鳗弧菌引起的疾病最为严重，在世界范围流行。
鳗弧菌也是我国海水养殖鱼类重要的条件致病菌。
李清禄等从网箱养殖发病的大黄鱼体内分离到2 株鳗弧菌[2]。
肖慧等从发生烂鳃、烂尾病的鲈鱼体内分离到鳗弧菌[3]。
莫照兰等从患病的牙鲆体内分离到一株鳗弧菌[4]。
研究表明分离出的鳗弧菌均具有致病性。
赖解旋酶DNA 恒温扩增技术(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)是模拟自然界生物体内DNA 复制的自然过程，在恒温条件下利用解旋酶解开DNA 双链，同时DNA 单链结合蛋白(SSB)稳定解开的单链，为引物提供结合模板，由DNA 聚合酶催化合成互补链。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
旋方向是３’一５ｎ ９Ｉ。已有研究¨０’ｕ１报道，ＵｖｒＤ与甲
基定向错配修复中的ＭｕｔＬ蛋白相互作用，ＭｕｔＳ和 ＭｕｔＬ可以激活ＵｖｒＤ错配依赖方式的解旋过程¨２１。 Ｍｅｃｈａｎｉｃ等和ＭａｔＳｏｎ等¨３，１４１提出的模式认为，在
基金项目：福建省医学创新课题（２００９一ＣＸ－５）；福建省科技创新
３．１模版的选择
可扩增序列的长度。由于目前ＨＤＡ选用大肠杆菌 ＵｖｒＤ解旋酶，其解链的速度为２０ ｂｐ／ｓ，连续性为
１００
ｂｐ左右旧Ｊ，故扩增选用的模板长度在８０～
１２０ ｂｐ。
３．２酶的选择ＤＮＡ解旋酶的解链能力受限于解 旋酶的解链速度和酶的连续性等因素。目前ＨＤＡ 主要选用的为大肠杆菌解旋酶Ⅱ（ＵｖｒＤ）。大肠杆菌 解旋酶Ⅱ（ＵｖｒＤ）是在错配修复和核苷酸切除修复中 起重要作用的解旋酶，它由７２０个氨基酸组成，相对 分子质量约为８２×１０３，属于ＳＦｌ解旋酶家族，其解
ｃｈａｉｎ
单链ＤＮＡ结合蛋白（ｓｉｎｇｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＳＢ）与模板单链结合，使模板单链处于单链 状态并保护它的完整性；引物与模板杂交，然后在 ＤＮＡ聚合酶催化下扩增，新合成的双链ＤＮＡ即产物 作为底物进入下一轮扩增。 目前在ＨＤＡ系统中选用的解旋酶是大肠杆菌 ＵｖｒＤ解旋酶、Ｔｔｅ—ＵｖｒＤ解旋酶。选用的ＳＳＢ是Ｔ４基 因３２蛋白或ＲＢ４９基因３２蛋白。聚合酶选用的可 以为Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’－５’ｅｘｏ一）聚 合酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｇｓｔ ＤＮＡ聚合酶。 ＨＤＡ适用范围较广，可以在凝胶电泳、实时定量
ｇｒｅａｔ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｕｓｅ．
ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈｅｌｉｅａｓｅ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＤＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ；Ｓｉｎｇｌｅ－ｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ
解旋酶解开双链ＤＮＡ；再依靠
ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ
在生物学研究和诊断中，ＤＮＡ扩增是一个基本 和必要的技术手段。其中最为普遍使用的是聚合酶 链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ａｄｖａｎｃｅｓ
因的扩增∞Ｊ。尽管环介导等 温基因扩增技术同链置换技 术被认作是恒温扩增，但都需 要先经过热变性。转录介导 的扩增则需要三种酶来完成 恒温ＲＮＡ扩增，而且反应的复 杂性限制了它的使用范围∞Ｊ。
２
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｌｌ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｈｅｌｉｃａｓｅ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｐｐｅａｒｓ∞ａ ｓｉｍｐｌｅ．ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｅｉｅｎｔ ｖｉｔｒｏ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＨＤＡ ｕｔｉｌｉｚｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅｌｉ． ｃａｇｅｓ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｄｏｕｂｌｅ．ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ，ｔｈｅ ｓｉｎｄｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ
前景。ＨＤＡ反应在同一温度下可以进行，因而不需
Ｕ或Ｔｔｅ—ＵｗＤ解旋酶３００
ｎｇ，ＥＴ ＳＳＢ ５０ ｎｇ，Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶２６．５ Ｕ。与以往的定量ＰＣＲ不同是
ＨＤＡ－Ｔａｑ
Ｍａｎ技术对上下游引物浓度的等对性没有
要昂贵的ＰＣＲ仪，很适于基层实验室的使用，虽然目 前ＨＤＡ仍然在ＰＣＲ仪上使用，但随着仪器的发展， 会有适于ＨＤＡ的简单仪器出现。ＨＤＡ技术模仿自 然界ＤＮＡ合成方式，不易引起非特异性扩增，具有 高度的敏感性及高保真性。然而，该法受ＤＮＡ解旋
在不久的将来，随着对解旋酶的深入探索分析，不断
和Ｂ两混合物组成，其中混合物Ａ含模板、引物、 ｄｄＨ：Ｏ、缓冲液；混合物Ｂ由大肠杆菌ＵｖｒＤ解旋酶、 ＳＳＢ、三磷酸脱氧核糖核苷、ＭｕｔＬ、ＤＮＡ聚合酶和缓
冲液按比例配制。
ＳＳＢ结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生
的单链区，防止新形成的单链ＤＮＡ重新配对形成双
ｓｓｂｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＴ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ
ＳＳＢ），是从极度耐热的微生物中得
［２］陈庆山，刘春燕，刘迎雪，等．核酸体外扩增技术［Ｊ］．中国生物
万方数据
・１９３４・
匡堂缝述垫！Ｑ生！旦筮！！鲞笠！≥期丛鲤地堂曼竺靶韭坚丛！：』！！垫！Ｑ：坠！：！§：№：１２
ＭｍＬ ａｎｄ
ห้องสมุดไป่ตู้
工程杂志。２００４，２４（５）：ｌＯ－１４． ［３］
Ａｎ Ｌ，Ｔａｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ａ
ＵｖｒＤ［Ｊ］．ＥＭＢＯ Ｊ，１９９８，１７（５）：１５３５—１５４１．
酶的限制，目前主要扩增小片段的ＤＮＡ序列。随着
严格要求。 ３．３引物的设计和ＰＣＲ一样，ＨＤＡ需要两条引 物。引物的最适长度为２４～２７ ｂｐ，最大不超过
３３
ｂｐ，Ｔｍ值在６０～６８℃，ＧＣ含量为３５％－４４％。
ＨＤＡ的反应体系ＨＤＡ反应体系的组成由Ａ
４瑚ＤＡ的反应体系及操作步骤
４．１
技术的发展，环ＨＤＡ可以直接扩增完整的环状质粒 ＤＮＡ，其利用，Ⅳ基因４蛋白——一种新发现的解旋 酶，让基因扩增跟基因筛选同时进行，它的反应温度 为２５℃，可以在室温下进行，操作简单易行。相信
增分析技术（ＨＤＡ．Ｔａｑ Ｍａｎ）检测炭疽杆菌与霍乱弧 菌等病原菌，提出此技术比其他传统的ＰＣＲ扩增技 术具有更好的稳定性和特异性，明显改善了ＰＣＲ技 术的假阳性与假阴性的问题。之前有研究表明，
ＨＤＡ．ＥｖａＧｒｅｅｎ实时定量扩增体系应用Ｇｓｔ ＤＮＡ聚
而后加入同体积的混合物Ｂ于６２—６５℃反应７５～
摘要：随着分子生物学研究领域的发展，赖解旋酶恒温基因扩增技术（ＨＤＡ）作为一种简便、 快速、高效的体外恒温基因扩增技术出现。ＨＤＡ依靠解旋酶解开双链ＤＮＡ、结合蛋白维持单链 ＤＮＡ状态、ＤＮＡ聚合酶催化靶片段的扩增。可以用于微生物基因组ＤＮＡ、病原菌ＤＮＡ、质粒ＤＮＡ 和ｅＤＮＡ等的扩增，该法具有广阔的实用前景。 关键词：赖解旋酶恒温基因扩增；ＤＮＡ解旋酶；单链ＤＮＡ结合蛋白
ＭＧＢ探针的荧光信号，并且得出Ｇｓｔ ＤＮＡ聚合酶与
Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶在调整适当的浓度后均可用于Ｔａｑ
ｎｇ，Ｅｌ＇ＳＳＢ ５０
Ｍａｎ探针的检测的结论，如在５０灿反应体系中Ｔｔｅ－
ＵｖｒＤ解旋酶２００
６０ ｎｇ，Ｇｓｔ
ＤＮＡ聚合酶
ＤＮＡ、质粒ＤＮＡ和ｃＤＮＡ等，作为一种崭新的恒温核 酸扩增方法，目前仅处于初期阶段，但从敏感性、准 确性和可操作性几方面看，该方法具有很大的发展
ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）。ＰＣＲ是２０
世纪８０年代后期由Ｍｕｌｌｉｓ建立的一种体外酶促扩增 特异ＤＮＡ片段的技术。ＰＣＲ具有灵敏度高、特异性 强、操作简便等特点因而被广泛使用。 ２００４年有研究¨，２ ｏ报道了一种新型的恒温基因
扩增——赖解旋酶恒温基因扩增（ｈｅｌｉｃａｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＨＤＡ）。同传统ＰＣＲ一样，ＨＤＡ利用２ 条引物扩增目的基因片段口Ｊ，不同的是ＨＤＡ技术模 仿自然界ＤＮＡ合成方式，利用ＤＮＡ解旋酶解开双链 并完成扩增，而非通过变性一退火一延伸过程的多次循 环实现，因此可以在同一温度下进行，不需要昂贵的
ｉｎ ＨｅＨｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＣＨＥＮ Ｌｕ．ＳＨＥＮ＾ａｎ－ｚｈｅｎ．ｔ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｕｎｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＦｕｊｉａｎ Ｍｅｄｗａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ ３５０００１．Ｃｈｉｎａ）
・１９３２・
匿堂堡述垫！Ｑ至！旦复！ｉ鲞箍！≥翅墅盟ｉ！型曼丝塑ｉ坐堕！：丛垫！Ｑ：№！：！垒，基！：！！
赖解旋酶恒温基因扩增技术的研究进展
陈
中图分类号：Ｑ５５
璐△（综述），沈建箴缓（审校）
文章编号：１００６－２０８４（２０１０）１３—１９３２－０３
（福建医科大学附属协和医院血液科，福州３５０００１） 文献标识码：Ａ
员发现了一种解旋酶（Ｔ４基因４蛋白），其解链速度 为３００ ｂｐ／ｓ，扩增质粒ＤＮＡ的长度达到２．５ ｋｂ，可以
构区域的ＤＮＡ测序，并能通过ｓｓＤＮＡ结合和链置
换，增强ＲｅｃＡ蛋白的活性。
其中值得一提的是ＭｕｔＬ。早期的解旋酶为大肠 杆菌解旋酶ＵｖｒＤ，实验证明ＭｕｔＬ的存在大大促进了
ＵｖｒＤ解旋酶的活性，因此在早期实验ＵｖｒＤ解旋酶、 ＭｕｔＬ缺一不可。随着解旋酶同工酶的不断发现，
方法和酶联免疫吸附试验中应用¨ｊ。
３
ＨＤＡ方法建立的要点 解旋酶解旋能力的强弱决定了
ＰＣＲ仪，有利于在基层实验室推广使用；扩增反应过
程简单，时间明显缩短。 ｌ早期恒温扩增技术的缺点 随着核酸扩增技术的发展，出现了链置换、依赖 核酸序列扩增、转录介导的扩增、环介导等温基因扩 增等恒温扩增技术，这些方法都能将微量标本进行 快速扩增，但在特异性、简便程度、温度和试剂仪器 要求等方面存在缺点。如环介导等温基因扩增技术 依赖于能够识别靶序列上６个特异区域的４条引物 和一种具有链置换特性的ＤＮＡ聚合酶，其引物设计 复杂，且因为其产物的独特性，为单链ＤＮＡ的分离 增加了难度【４Ｊ。链置换技术不适用于大片段目的基
分子复性。 ＤＮＡ解旋酶、ＳＳＢ、ＤＮＡ聚合酶的浓度对ＨＤＡ
依然具有全部的活性。因为具有极高的热稳定性，
ＥＴ
ＳＳＢ可用于需要高反应条件的实验中。除了能够
稳定和标记ｓｓＤＮＡ结构，还能提高ＤＮＡ聚合酶的延
伸力、增加ＰＣＲ反应的产量和特异性、增加反转录 ＰＣＲ中反转录的产量和延伸能力Ⅲ】、改善强二级结
扩增效果影响极大，因此筛选ＤＮＡ解旋酶和优化系 统各成分的浓度是近年研究的热点。最近有研究人
优化ＨＤＡ反应体系，它可以完全代替传统ＰＣＲ成为