westen blot 免疫蛋白印迹实验步骤

Western blot 实验步骤

——2018.8.8

一、样品及溶液准备

1、匀浆器：上海净信科技有限公司

线虫蛋白提取：5000条线虫加300μL western及IP裂解液（10:1加入PMSF），研磨三次，（设置：研磨45s停止30s），提取蛋白量约1500-2500mg/ml。

2、溶液

①5*电泳液：Tris-base(三甲基氨基甲烷)15.1g，甘氨酸72g，SDS 5g，加水至1L，室温保存，使用时稀释10倍。（稀释5倍，BIO-RAD电泳仪器不能维持恒压，marker很难跑全条带）。

②5*Transfer buffer ：Tris-base 15.1g，甘氨酸72g，加800mL，使用时，稀释4倍，每800mL加200mL甲醇（就是用的时候，取200mL 5X溶液，稀释成800mL，再加200mL甲醇就可以用了）。

③5* TBS buffer：NaCl 40g，KCl 1g，Tris base 15g，溶于750mL水，浓HCl 调整PH7.4，加水至1L。使用时稀释5倍。

④TBST：500ml TBS中加入1mL Tween20

⑤5%封闭液：10g脱脂奶粉加入200mLTBST。

二，电泳

(一) 制胶

不同蛋白质分子量适宜使用的分离胶浓度范围如下：

1.0mm胶一般需要5ml分离胶溶液，1.5mm一般需要7ml分离胶溶液

（加入TEMED后容易凝固，可以加大量2-3倍，以加速凝固）

加入到玻璃板之间距离上缘1cm处，水封闭上层液体，达到除气泡和压胶目的。肉眼确定水和分离胶之间出现明显的分离后，确定分离胶已完全凝结，倒掉水，并用滤纸吸掉残留在分离胶上的溶液。

将配制好的浓缩胶加到分离胶上层，加满，插入梳子。

待胶干后，保鲜膜包好（保留梳子）。胶可提前一天制好，室温放置以便充分交联，也可现用现制。

(二）电泳

1，BCA测定的蛋白浓度，并定量到同一浓度后，5*SDS loading buffer按1:5加入到样品中，100℃加热10min 蛋白变性，12000rpm离心1min 取上清。（可以将样品全部变性后-80℃保存，更方便使用）

2，将制好的胶板,固定于电泳仪器中，并倒入0.5* Running buffer直至浸没整个胶版(内层高于外层)，在电泳缓冲液的浸润下慢慢拔去插槽，形成上样孔。

拔出梳子，marker 5ul/孔，样品一般20ul/孔（最大容纳量35u），浓缩胶60 V（约

20 min）电泳至条带到分离胶处，分离胶120 V（约30 min）。

三、半干转

1，裁剪与分离胶大致面积的PVDF膜先置于甲醇溶液中活化约10 s后转移至1*Transfer buffer，浸润（上下层滤纸分开使用），并将下层滤纸置于半干转仪器上，随即将活化后的PVDF膜置于滤纸上，注意不能留有气泡。海绵浸入Transfer buffer，拿出后挤出至半干。

2，电泳完毕后，取出胶板，浸入Transfer buffer，从塑料板剥离上层制胶玻璃，除去浓缩胶，并用塑料板分离两侧与下层制胶玻璃的粘连。

分离凝胶并用1*转移缓冲液浸润后放置于PVDF膜上，注意不能留有气泡。盖上滤纸，半干海绵。保证上下层滤纸不可直接接触，容易短路。盖上半干转仪器上方电板，并盖上仪器盖板，注意正反和方向。恒压25V，25-30min

四，封闭及孵育

1，半干转完成后，PVDF膜上左上方剪角标明正向。5%封闭液封闭1 h，以封闭PVDF膜上未与蛋白结合的部位。

2，封闭完毕后，TBST洗净封闭液，并做好标记，记录，孵育一抗。一抗使用CST按1:1500稀释，一般每次使用30ml。常温摇床孵育1h即可，或4℃放置过夜，取出后最好摇半小时。一抗孵育完毕后1*TBST溶液洗3次，每次20 min。3，CST二抗按1:1500稀释，孵育1h。孵育完毕后1*TBST溶液洗3次，每次20 min。

五，显影

保鲜膜铺在桌面上，将PVDF膜放置到保鲜膜上，加ECL均匀润湿3min，然后用保鲜膜包好，除去气泡，放置到夹板中，暗处胶片曝光，分别在显影液，水，定影液中浸泡3min，流水下冲洗长时间，彻底干燥后保存。

将膜片段转移至化学发光显色用的夹板中，均匀滴上化学发光显色剂放置3min，用滤纸吸干液体，检测二抗探针上标记的辣根过氧化物酶的方法检测目的蛋白条带。最终用胶片曝光，1-3min，胶片分别显影液，水，定影液，流水下冲洗一段时间，得到实验结果。

灰度分析：Image J

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