愈伤组织培养

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第三节 愈伤组织形态的发生
愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分
化产生不定芽或根的分生组织甚至是胚状
体，继之，由这些有结构的组织而发育成
苗或完整小植株。
一、愈伤组织通过再分化形成再生植株的 方式：主要有三种(1)先产生芽，后在茎的
外植体的细胞数目多，获得愈伤组织的机会也多。
如果目的仅在于得到愈伤组织，那末将茎的切
段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种 组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以 了。
如果要定量地研究愈伤组织的发生，那末外植体
的大小必须一致，形状和组成也要基本相同。进 行这类研究常选用组织块较大的材料，例如胡萝 卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草
成的能力，因此表面积越大，产生分泌物数量也
越多，愈伤组织的得率也越高。
外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的
外植体。外植体最小的限度由其亲本组织细胞的
平均大小来决定。细胞数目。
例如菊芋的细胞比胡萝卜根次生韧皮部的细胞 大三倍，一个3.8毫克的胡萝卜外植体大约包含
25，000个细胞，这样一个外植体是能够成活的。
• 理论上愈伤组织是可以无限制继代，但 愈伤组织继代次数增加，形态发生能力 逐渐丧失。 • 原因：遗传因素即继代培养中通常出现 染色体紊乱。
REASONS
遗传上表现不稳定：染色体出现多倍 体和非整倍体
• 四、培养条件
• 1、光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需 光，分化需光。继代培养一般需光。此 时光对器官的作用是一种诱导反应。 • 2、温度：一般采用24～28℃的恒温条件 进行。 • 3、湿度：较大，以免引起培养基干缩。
有好几种化学试剂都能起到表面消毒的作
用，试剂的选择及处理时间的长短要根据 材料对试剂的敏感性来决定。
一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。 因为消毒剂对植物细胞也有杀伤作用，若
不去除就会妨碍愈伤组织的发生。 例如用无菌水反复冲洗后可以把大部分药 剂都洗掉，或者能自动分解变成低毒性物 质。
本氯酸钠能分解成为具有杀菌效能的氯气，然
等。这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、 适合于培养的外植体。
具体的操作过程： 无菌的块茎或块根，用钻孔器钻出一批同一类薄 壁组织圆柱形的组织，平行排列好。多把刀片等 距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到
许多个长短一致的圆柱形的外植体。
圆柱形大量地、准确地得到外形相同的外植体。 圆柱体的表面积大，利于组织块和外界气体和营 养物的交换。 外植体的损伤表面分泌物，具有促进愈伤组织形
裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。
2.材料必须完全无菌
微生物一旦与培养基接触，就迅速繁殖，抑制
愈伤组织的生长。
用抗菌素来抑制微生物的生长，在短时间有效， 而且抗菌素只能对一定谱系中的细菌才产生作 用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。 抗菌素还可能抑制植物组织的生长。
得到无菌材料，植物组织必须先进行消毒。
愈伤组织培养
• • • • • 主要内容: 材料的制备 愈伤诱导与分化 形态发生 愈伤的培养
第一节
植物材料（外植体）的制备
1.一般植物组织都能诱发愈伤组织。 : 诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而
是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的
因素。
双子叶植物为最多，单子叶植物(1990’s)，此外，
而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目 少，在分离过程中造成损伤往往难以成活。必
须重量达到8毫克才包含约20，000个细胞，使
之易于成活。
第四节
一、培养基
愈伤组织的 培养
培养基一般包括大量元素、微量元素和一种碳 水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。 这样简单的培养基(基本培养基)只有很少几种植 物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要 添加各种各样的附加物（完全培养基），如维 生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、 赤霉素、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物
到新的培养基上。
一般在25-28℃下进行固体培养时，每隔45周进行一次继代培养。
组织块较小时，继代培养时可将整块组织 转移。组织块较大时，可先将组织分成 几小块再接种。继代培养必须及时进行， 长期不传代常常由于代谢产物的累积， 对组织起毒害作用，某些植物愈伤组织 的褐化现象即往往由此引起的。褐化的 愈伤组织反复地进行继代培养，可使愈 伤组织恢复活力而迅速生长
后就散失到空气中。
低浓度的氯化汞是一种令人满意的消毒剂，只
是难以去除，故在消毒后必须用大量清水冲洗 材料。 在材料放入消毒剂之前，先在乙醇中漂洗一下， 可以使材料表面弄湿，从而使消毒剂易于渗入
并杀死微生物。
3.外植体的大小和形态
消毒后的植物材料，即可进行培养。
从外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶 段是相当一致的，而从茎、根等器官切段上长出 的则是一个混杂的愈伤组织。
烟草的愈伤组织。
• 注意：
• 激素的种类和用量的添加
•一般诱导愈伤常添加2.4-D
二、愈伤的培养方式： 培养分为固体和液体培养两大类。
液体培养又分静止和振荡培养的二类。
继代培养（传代）：愈伤组织在培养基 上生长一段时间后，由于养分的枯竭，
水分的散失，组织代谢产物的积累，影
响愈伤组织生长，因此必须将组织转移
注意：选用完全已知的合成化合物，不大主张用 复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子 汁等。 必须强调： 适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适合于维持 这些愈伤组织；适合于液体培养的培养基也不一 定适合于固体培养。
培养基中的N，大多数都用硝态氮，只有MS培 养基和B5培养基中才用硝态和铵态的混合物。 K的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势。 有趣的是，各种离子浓度大为不同的培养基往 往能使相同的组织快速生长。例如Hildebrandt 培养基与MS培养基显著不同，但二者都能培养
ห้องสมุดไป่ตู้
有些外植体外表上看来是由同一类细胞组成，例 如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎 等，这些细胞中DNA的含量有很大差别。这种差 别可能是由于细胞核中染色体数目的差别，即倍 性不同所造成的。
接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制 不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可
能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。