水稻锌指蛋白基因OsZFP1的功能分析

水稻锌指蛋白基因O s Z F P１的功能分析李贺１,２㊀韩艺娟１㊀林艺娟１㊀刘丽华１㊀张承康１㊀张连虎１㊀王宗华１㊀鲁国东１,∗(１福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福州３５００００;２泉州出入境检验检疫局,福建泉州３６２０００;∗通讯联系人,EＧm a i l:g d l u f a f u＠１６３．c o m)F u n c t i o n a lA n a l y s i s o f Z i n cF i n g e rP r o t e i nG e n e O s Z F P１i nR i c eL I H e１,２,H A N Y iＧj u a n１,L I N Y iＧj u a n１,L I U L iＧh u a１,Z H A N G C h e n gＧk a n g１,Z H A N G L i a nＧh u１,W A N G Z o n gＧh u a１, L U G u oＧd o n g１,∗(１K e y L a b o r a t o r y o f B i o p e s t i c i d ea n d C h e m i c a lB i o l o g y,M i n i s t r y o f E d u c a t i o n,F u j i a n A g r i c u l t u r ea n d F o r e s t r y U n i v e r s i t y, F u z h o u３５００００,C h i n a;２Q u a n z h o u E n t r yＧE x i tI n s p e c t i o n a n d Q u a r a n t i n e B u r e a u,Q u a n z h o u３６２０００,C h i n a;∗C o r r e s p o n d i n g a u t h o r,EＧm a i l:g d l u f a f u＠１６３．c o m)L IH e,HA N Y i j u a n,L I NY i j u a n,e t a l．F u n c t i o n a l a n a l y s i s o f z i n c f i n g e r p r o t e i n g e n e O s Z F P１i n r i c e．C h i n JR i c e S c i,２０１５,２９(２):１３５Ｇ１４０．A b s t r a c t:T h er i c e p r o t e i n O s Z f p１w h i c hi n t e r a c t s w i t h M o S p１i saC３H C４Ｇt y p e R I N GＧf i n g e r p r o t e i n p r e d i c t e db yb i o i n f o r m a t ic t o o l s．T h e t r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s o f O s Z F P１g e n ed u r i n g M a g n a p o r t he o r y z a e i nf e c t i o n s h o w e d t h a t t h ee x p r e s s i o n l e v e l of O s Z F P１p e a k e dw i t h３．８f o l d s a t１８h o u r s a f t e r s p o r eＧs p a y i ng i n o c u l a t i o n,r e v e a l i n g th a t O s Z F P１m i g h t r e s p o n d t o M．o r y z a e i n v a s i o n．T h e O s Z F P１o v e r e x p r e s s i o n t r a n s g e n i c r i c e p l a n t sw e r e g a i n e d t h r o u g hm o d i f i e dA g r o b a c t e r i u mＧm e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n．T h e s t a t i s t i c a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e o v e r e x p r e s s i o n p l a n t s c o n f e r r e s i s t a n c ea g a i n s t M．o r y z a e．I n c o n c l u s i o n,t h e O s Z F P１g e n em a yp l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n r i c e i mm u n i t y a g a i n s t M．o r y z a e．K e y w o r d s:M a g n a p o r t h e o r y z a e;z i n c f i n g e r p r o t e i n;t r a n s g e n i c r i c e．李贺,韩艺娟,林艺娟,等．水稻锌指蛋白基因O s Z F P１的功能分析．中国水稻科学,２０１５,２９(２):１３５Ｇ１４０．摘㊀要:生物信息学分析表明,稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶M o S p１在水稻中的互作蛋白O s Z f p１,为含有环指结构域的C３H C４型锌指蛋白.对稻瘟病菌侵染过程中O s Z F P１基因的表达动态分析表明,O s Z F P１基因表达水平在稻瘟病菌G u y１１孢子悬浮液接种水稻后缓慢升高,接种后１８h达到最高峰,约为３．８倍,这表明该基因响应稻瘟病菌的侵染.利用改进的农杆菌介导的转基因技术成功获得O s Z F P１基因的过表达植株.抗性分析表明O s Z F P１过表达植株的整体抗稻瘟病能力得到显著提高.说明O s Z F P１基因在水稻抵抗稻瘟病菌侵染过程中扮演着十分重要的角色.关键词:稻瘟病菌;锌指蛋白;转基因水稻中图分类号:Q７５５;S４３５ １１１ ４＋１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀文章编号:１００１Ｇ７２１６(２０１５)０２Ｇ０１３５Ｇ０６㊀㊀稻瘟病作为水稻的主要病害每年给全球水稻产业带来巨大损失,如何持久高效地防治稻瘟病成为目前的研究热点[１].稻瘟病菌主要以分生孢子在水稻组织表面萌发㊁分化产生附着胞,随后附着胞产生侵染栓侵入水稻角质层和表皮细胞,继而在水稻组织内部扩展生长[２,３].有研究表明,丝氨酸蛋白酶在细胞分化和病原侵入等过程中发挥重要的作用[４].部分丝氨酸蛋白酶基因被干扰后,稻瘟菌突变体气生菌丝减少,致病性降低,这说明丝氨酸蛋白酶可能参与稻瘟菌的生长发育等过程外,还与稻瘟菌的致病性相关[５].锌指蛋白是一类具有 手指状 结构域的转录因子,能够与Z n２＋结合形成稳定的 手指 型结构.锌指蛋白主要通过与核酸的相互作用如促进转录㊁抑制转录㊁单链D N A/R N A结合等进而影响整个生命过程[６].对植物锌指蛋白的研究主要集中在植物抗旱㊁耐盐㊁抗冻以及抗病等方面.有研究表明,水稻锌指蛋白基因O s Z F P和O s Z F１９的表达受到干旱胁迫的强烈诱导.据目前的研究结果,多数锌指蛋白是逆境响应的正调节物[７Ｇ９].收稿日期:２０１４Ｇ０６Ｇ０３;修改稿收到日期:２０１４Ｇ０６Ｇ３０.基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(２０１１３５１５１１０００２);国家科技支撑计划资助项目(２０１２B A D１９B０３).５３１中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i),２０１５,２９(２):１３５－１４０h t t p://w w w．r i c e s c i．c nD O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００１Ｇ７２１６．２０１５．０２．００４㊀㊀刘丽华[１０]和林玲[１１]利用酵母双杂交系统以稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶M o S p１作为诱饵蛋白,从水稻中筛选出一个互作蛋白O s Z f p１,生物信息学分析表明,O s Z f p１蛋白中含有环指结构域,为蛋白质家族z fＧC３H C４[１０,１１].本研究拟通过农杆菌介导的转基因技术获得O s Z F P１基因过表达水稻并检测其抗病性,通过荧光定量P C R技术分析在稻瘟病菌侵染水稻期间O s Z F P１基因的表达动态,进一步探索O s Z F P１基因的功能.研究结果对于进一步揭示植物的抗病机理,拓展水稻抗病育种的空间具有重要的意义.１㊀材料与方法１．１㊀实验材料供试材料包括大肠杆菌菌株D H５α,根癌农杆菌菌株E H A１０５,稻瘟菌菌株G u y１１.植物表达载体p C X D R(美国俄亥俄州立大学王国梁实验室惠赠),T A克隆载体p M D１８ＧT购自T a K a R a公司.水稻品种K i t t a k e和C o３９由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室提供.１．２㊀实验方法１．２．１㊀过表达载体的构建P C R扩增获得O s Z F P１基因片段,加A尾后,连入p C X D R载体(用X c m I预切出T黏性末端,图１),转化大肠杆菌D H５α感受态,用载体上游引物V e c t o rＧF与基因下游引物O s Z F P１ＧR筛选正向插入片段,验证无误后提取质粒D N A,转化农杆菌E HA１０５感受态,目标基因上下游引物菌液P C R验证阳性菌落[１２].１．２．２㊀农杆菌介导的水稻转基因技术播种.选用早熟粳稻品种K i t t a k e种子,用７５％酒精和２．５％~３．０％次氯酸钠溶液消毒处理,无菌水洗涤晾干后转移至N B培养基,３２ħ高温持续光照,约７d后获得愈伤组织.转化.将愈伤组织与农杆菌混合侵染后转移到N６DＧ共培培养基上,避光２６ħ培养２d.加入等体积羧苄水(终浓度５００m g/L)洗涤除去残余农杆菌.筛选.转移愈伤至筛选培养基中,３２ħ光照培养１０d,抗性愈伤呈亮黄色松散颗粒状.复筛培养约１０d,抗性愈伤大量生长呈堆状.分化.将堆状抗性愈伤整体转移至分化培养基上,２９．５ħ㊁１６h光照/８h黑暗培养约１０d.生根.将长有绿色小苗的愈伤组织整体转移到生根培养基上,２５ħ~２８ħ㊁１６h光照/８h黑暗培养７d左右便有大量须根长出[１３Ｇ１７].１．２．３㊀转基因水稻的筛选、接种调查挑选饱满的转基因水稻T１代种子,每个株系３０粒,清水浸泡至露白后用５０μg/m L的潮霉素溶液处理２d.对照组为常规稻品种K i t t a k e,分为两份,一份清水处理,一份５０μg/m L的潮霉素溶液处理.经潮霉素处理后,正常生长的初步鉴定为转基因水稻阳性植株.由于T１代转基因水稻出现性状分离,每一粒种子都需要单独验证,采用７２孔黑色穴盘种植筛选过的转基因水稻,每穴种植１株.待转基因水稻长至３叶１心期时进行稻瘟菌孢子悬浮液接种,将接种后的水稻置于２５ħ黑暗保湿２４h,移出后放到温度为２５ħ~２８ħ的温室中培养７d左右进行病情调查并统计发病结果.叶瘟病情分级指标参照稻瘟病测报调查规范(G B/T１５７９０－２００９).１．２．４㊀荧光定量P C R检测样品的制备用稻瘟病菌株G u y１１的孢子悬浮液喷雾接种水稻感病品种C o３９的植株,对照组为０．０２％吐温溶液喷雾接种的水稻C o３９植株,分别在０㊁６㊁１２㊁１８㊁２４㊁３６㊁４８h等７个时间点对实验组和对照组取样,每份样品约１０株,剪除根部和茎部,只取用３叶L B－左边界;R B－右边界;h t pⅡ－潮霉素磷酸转移酶基因Ⅱ;C a M V３５S－花椰菜花叶病毒３５S启动子;D s R e d－红色荧光蛋白;c c d B－致死基因;N o s T－胭脂碱合成酶基因终止子.L B,L e f t b o r d e r;R B,R i g h t b o r d e r;h t pⅡ,H y g r o m y c i n p h o s p h o t r a n s f e r a s eⅡ;C a M V３５S,C a u l i f l o w e rm o s a i c v i r u s３５S p r o m o t e r;D s R e d, D i s c o s o m a r e d f l u o r e s c e n t p r o t e i n;c c d B,C o n t r o l o f c e l l d e a t h;N o s T,N o p a l i n e s y n t h a s e t e r m i n a t o r．图１㊀表达载体p C X D RTＧD N A区结构F i g．１．S t r u c t u r e o f TＧD N Ao f p C X D R．６３１中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２９卷第２期(２０１５年３月)以上部分,滤纸吸干叶片表面水珠后剪成约５c m 长,迅速用干净的锡箔纸包裹后置于液氮中速冻保存.取样完毕后提取水稻叶片总R N A .采用分光光度计法检测R N A 浓度和纯度,根据所测浓度调整反转录c D N A 时所加R N A 模板量,确保R N A 模板总量为５００n g.加样时将c D N A 稀释１０倍后,每２０μL 体系加１μLc D N A 模板(５n g /μL ).１．２．５㊀荧光定量P C R 实验设计本实验室采用水稻O s A c t i n 基因作为内参,利用P r i m e r ５．０软件设计所需引物.每一批样品同时包括对照组和实验组;每一组样品分为扩增其内参基因和目的基因两份;每一份样品包含３个重复.１．２．６㊀荧光定量P C R 数据处理方法采用２－ΔΔC t 法[１８]检测基因表达量.２㊀结果与分析２．１㊀O s Z F P １基因的同源比对分析在水稻基因组数据库中获得O s Z F P １基因的蛋白序列,对其蛋白序列进行分析可知,蛋白编码有一个保守的环指结构域.利用C l u s t a l X 软件将此蛋白编码序列与已报道的环指蛋白序列进行同源比对分析(图２).O s Z F P １与水稻(O r yz as a t i v a )的锌指蛋白O s ０２g ０６３９８００(N P _００１０４７５４２),辣椒(C a p s i c u m a n n u u m )C a R m a １H １(Q ６R ５６７),拟南芥(A r a b i Ｇd o p s i s t h a l i a n a )A t R m a １(N P _１９２２６０)㊁A t R m a ２(N P _１９４５５６,A t ４g２８２７０)和A t R m a ３(N P _１９４４７７,A t ４g ２７４７０),人类(H o m os a pi e n s )的锌指蛋白Hm R a m １(N P _００１０５４６８３)以及O s A P I P ６(N P _００１０５４６８３)与O s C O I N (N P _００１０４１７６２)的同源率分别为４９％㊁３６％㊁３５％㊁３２％㊁３７％㊁４０％㊁２５％和４０％.通过进一步的分析可知在这些蛋白中均含有保守的环指域.环指域在不同生物体的不同蛋白中其氨基酸序列具有高度一致性,从而说明该结构域可能在生物体中具有重要的保守的生物学功能.２．２㊀O s Z F P １基因在稻瘟病菌接种后的表达动态O s Z F P １基因的表达水平在稻瘟病菌G u y １１孢子悬浮液接种水稻后缓慢升高,接种后１８h 达到最高峰(约为３．８倍),随后迅速降低,低于对照组该基因的基础表达水平(图３).接种后１８h ~２４h 为稻瘟病菌附着胞形成㊁侵染期,作为稻瘟病菌潜在致病因子的丝氨酸蛋白酶在此期间被大量分泌,O s ＧZ f p １作为丝氨酸蛋白酶M o S p １的互作蛋白及时响应稻瘟病菌的侵染,很可能参与水稻体内免疫反应过程.２．３㊀O s Z F P １基因过表达载体的构建及农杆菌介导水稻转化以O s Z F P １ＧF 和O s Z F P １ＧR为引物验证重组质方框表示锌指蛋白结构域C ＧX ２ＧC ＧX (９Ｇ３９)ＧC ＧX (１Ｇ３)ＧH ＧX (２Ｇ３)ＧC ＧX ２ＧC ＧX (４Ｇ８)ＧC ＧX ２ＧC ,其中,黑色部分为保守的半胱氨酸(C ys ,C )和缬氨酸(V a l ,V )氨基酸残基,红色部分保守性次之.R e c t a n g u l a r b o x e s i n d i c a t e z i n c f i n ge r p r o t e i nd o m a i nC ＧX ２ＧC ＧX (９Ｇ３９)ＧC ＧX (１Ｇ３)ＧH ＧX (２Ｇ３)ＧC ＧX ２ＧC ＧX (４Ｇ８)ＧC ＧX ２ＧC ．T h e b l a c k a m i n o a c i d s a r e t h em o s t c o n s e r v a t i v e c y s t e i n e a n dv a l i n e r e s i d u e s ,f o l l o w e db y th e r e d a m i n o a c i d s ．图２㊀环指蛋白序列的同源比对分析F i g ．２．S e q u e n c e h o m o l o g y a n a l y s i s o fR I N Gf i n ge r p r o t e i n ．７３１李贺等:水稻锌指蛋白基因O s Z F P １的功能分析图３㊀O s Z F P１基因在G u y１１接种水稻后的表达情况F i g．３．T r a n s c r i p t i o n a l l e v e l o f O s Z F P１g e n e i nt h er i c e l e a v e su n d e rr i c e b l a s t c h a l l e n g e．粒中是否有O s Z F P１基因插入(图４ＧA);然后以载体上游引物V e c t o rＧF与O s Z F P１ＧR为引物验证重组质粒中O s Z F P１基因插入方向是否正确,反向插入无条带扩出(图４ＧB).将验证无误的重组质粒导入农杆菌感受态细胞,并采用农杆菌介导的转基因技术转化水稻愈伤组织(图５).本实验室以粳稻早熟品种K i t t a k e成熟胚为材料建立了一套高效快速的转基因水稻培育体系,将农杆菌介导的转基因水稻培育周期缩短至５０d左图４㊀重组质粒中O s Z F P１基因的P C R检测F i g．４．D e t e c t i o no f O s Z F P１g e n e i n r e c o m b i n a n t p l a s m i d．右.２．４㊀转基因水稻植株的检测C T A B法提取T１代转基因水稻叶片基因组D N A,P C R扩增潮霉素抗性基因片段,片段大小约５００b p,检测结果证明T１代转基因水稻均携带潮霉素抗性基因片段.２．５㊀O s Z F P１基因过表达水稻植株的抗病鉴定O s Z F P１基因过表达水稻共１３个株系,每个株系挑选３０粒T１代种子,清水浸泡至露白后３７ħ催芽,２４h后将萌发的种子浸入５０m g/L的潮霉素B 水溶液中,经潮霉素B水溶液处理２d后统计成活A－水稻愈伤组织的培养;B－愈伤组织诱导分化;C－生根.A,R i c e c a l l u s i n d u c t i o n;B,D i f f e r e n t i a t i o no f r e s i s t a n t c a l l u s;C,S e e d l i n g r o o t i n g．图５㊀农杆菌介导的转基因水稻培育过程F i g．５．A g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o no f r i c e．８３１中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２９卷第２期(２０１５年３月)图６㊀O s Z F P１基因过表达水稻植株病情指数分布F i g．６．I n f e c t i o u s d e g r e e o f O s Z F P１o v e r e x p r e s s e d r i c e．率.㊀㊀实验结果表明,清水对照组K i t t a k e全部成活,潮霉素对照组K i t t a k e全部死亡.共得到潮霉素抗性植株１５８株,１３个株系３９０粒种子经潮霉素筛选总成活率为４０．５１％,其中７４株表现出明显的潮霉素抗性,长势与清水对照组相当,存活８６株,占筛选总数的２２．０５％.转基因水稻不同株系T１种子经潮霉素筛选成活率相差较大,可能与种子活力㊁潮霉素抗性基因的表达强度等因素有关.经潮霉素筛选后长至３叶１心期时用G u y１１孢子悬浮液接种,７d后调查发病情况(图６).㊀㊀经潮霉素筛选后成活的T２代O s Z F P１基因过表达水稻有８６株,由于接种期间死亡或植株过于弱小无法接种等原因,最终统计的发病指数数据中O sＧZ F P１基因过表达水稻有６４株.O s Z F P１基因过表达水稻中有２６株为０级病斑,占总数的４０．６３％,其平均发病指数１．２５,而对照组野生型水稻(WT)平均发病指数为３．５６.实验结果表明O s Z F P１基因过表达水稻植株对稻瘟病菌G u y１１的抗性显著增强.值得注意的是,有１．５６％的O s Z F P１基因过表达水稻植株发病指数高于对照组平均发病指数,可能由于基因插入位点不同导致水稻中其他抗病相关基因的功能发生改变.２．６㊀O s Z F P１基因过表达植株中目的基因相对表达量的检测选取O s Z F P１基因过表达水稻T２代植株共３个株系的２２单株提取R N A进行做荧光定量P C R,检测目的基因相对表达量.在荧光定量P C R检测的２２株O s Z F P１基因过表达植株样品中,O s Z F P１基因相对表达量在１倍以下的有６株,１~５倍的有１４株,５~１０倍的有２株,目的基因相对的表达量最低为内参基因的３２％,最高为其７．４８倍.实验证明获得的大多数O s Z F P１基因过表达植株中目的基因相对表达量大幅提高.３㊀讨论本研究通过生物学信息比对分析锌指蛋白O sＧZ F P１与其他已报道的植物锌指蛋白的同源性,发现O s Z F P１编码有环指保守结构域,通过构建过表达载体,对该基因进行水稻愈伤组织转化,并对O s Z F P１基因过表达植株后代进行稻瘟病菌的抗性分析.在转基因水稻的培育过程中,经过反复实验摸索,针对早熟粳稻品种K i t t a k e,本实验室利用高效快速的转基因水稻培育体系对O s Z F P１基因进行过表达转化,在显著缩短试验周期的同时水稻愈伤组织的转化效率.在O s Z F P１基因过表达植株后代对稻瘟病菌的抗性分析中,我们发现转基因水稻的整体抗稻瘟病能力得到显著提高.在对稻瘟病菌侵染过程中O sＧZ F P１基因的表达动态分析中,我们发现O s Z F P１基因响应稻瘟病菌的侵染,很可能参与水稻体内免疫反应过程.实验结果表明O s Z F P１基因在水稻抵抗稻瘟病菌侵染的过程中扮演者十分重要的角色,由此我们得出一个推论:稻瘟病菌中的丝氨酸蛋白酶作为一种病原分子相关模式刺激水稻产生免疫反应,丝氨酸蛋白酶在附着胞形成及侵入水稻组织期间被大量分泌,诱导水稻O s Z F P１基因的大量表达.随着侵入过程的结束,稻瘟菌在水稻组织中扩展阶段,丝氨酸蛋白酶的分泌量减少,水稻O s Z F P１基因的表达量也迅速降低.本研究通过农杆菌介导的转基因技术使水稻自身的抗病基因O s Z F P１持续㊁过量表达从而使水稻有效地抵御稻瘟病菌的侵染,这为水稻的抗病育种提供了一个新的思路.参考文献:[１]㊀刘国权,孟昭河,任艳军,等．水稻抗稻瘟病研究进展与对策．中国农学通报,２００４,２０(１):２１１Ｇ２１４．[２]㊀邱福林,王大为．稻瘟病菌致病机理的研究进展．垦殖与稻作,２００４,３:２６Ｇ２８．[３]㊀李扬,王耀雯,王育荣,等．水稻稻瘟病研究进展．广西农业科学,２０１０,４１(８):７８９Ｇ７９２．[４]㊀汪世华,王文勇,黄益洲,等．丝氨酸蛋白酶研究进展．福建农业学报,２００７,２２(４):４５３Ｇ４５６．[５]㊀陈立群．稻瘟菌中部分丝氨酸蛋白酶的功能研究．福州:福建农９３１李贺等:水稻锌指蛋白基因O s Z F P１的功能分析林大学,２００９．[６]㊀L a i t y JH,L e eB M,W r i g h t PE．Z i n c f i n g e r p r o t e i n s:N e w i nＧs i g h t s i n t o s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l d i v e r s i t y．C u r rO p i nS t r u cB i o l,２００１,１１(１):３９Ｇ４６．[７]㊀W o l f e S A,N e k l u d o v a L,P a b o C O．D N A r e c o g n i t i o n b yC y s２H i s２z i n cf i n g e r p r o t e i n s．A n n R e v B i o p h y s B i o m o l e cS t r u c,２０００,２９(１):１８３Ｇ２１２．[８]㊀向建华,李灵之,陈信波．植物非生物逆境相关锌指蛋白基因的研究进展．核农学报,２０１２,２６(４):６６６Ｇ６７２．[９]㊀陈昌冬,牛向丽,刘永胜．水稻锌指蛋白基因O s W I P６的克隆,表达及R N A 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