液相常见问题及解决

1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？关于漂移问题：

①温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定

②流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

③柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡

关于快速变化问题

①流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定

②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？

①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。

②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子

③可能柱超载，减少进样量。

3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

①样品量不足，解决办法为增加样品量

②样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

③样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

④检测器衰减太多。调整衰减即可。

⑤检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

⑥检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

⑦检测池中有气泡。解决办法为排气。

⑧记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。

⑨流动相流量不合适。调整流速即可。

⑩检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？

①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；

②比例阀失效，更换比例阀即可；

③泵密封垫损坏，更换密封垫即可；

④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；

⑤系统检漏，找出漏点，密封即可；

⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

5.我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？

这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。如分离情况可以，系统稳定，达到系统适用性要求，就不必保留时间的重现。

6.我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

①拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

②把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；

③将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；只用于使用过的柱子。

④更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

7.色谱双峰产生的可能及判断和处理

HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下（不包括梯度），峰型应对称而尖锐。但是，在对样品了解程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合理下，会出现各种意想不到的问题，而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此。下面根据本人几年工作的体会，提出一些看法，向同仁指教。色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。

1色谱柱

如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会减少），尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题－柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，

不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。

2溶剂极性及进样量

许多HPLC分析者对此可能不以为然，一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容，而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样品进样量大，如定量管为20ul，此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一样），且拖尾，保留时间会提前(相对进样量少而言)，将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色谱柱问题）。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。

3样品的特性有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC－MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，例如我分析过的农药啶虫眯（吡虫清）。