DNA复制、引物、酶及蛋白质

DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质、DNA复制过程一、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质DNA复制起始一共涉及到DnaA（复制起始因子，识别OriC序列）、DnaB（DNA解链酶）、DnaC（召唤DnaB到复制叉）、HU（结合DNA使之弯曲）、引物合成酶、单链DNA结合蛋白、RNA聚合酶、DNA旋转酶、Dam甲基化酶，一共是9种重要的酶或蛋白质，其中DnaA、DnaB、引物合成酶、单链DNA结合蛋白、Dam甲基化酶非常重要。

DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。

对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点，一直合成下去。

对于后随链，引发过程较为复杂，需要多种蛋白质和酶参与。

后随链的引发过程由引发体来完成。

引发体由6种蛋白质构成，预引体或引体前体把这6种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体。

引发体似火车头一样在后随链分叉的方向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。

由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 将缺口补齐，再由DNA连接酶将每两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA.。

1.解链酶(helicase,unwinding enzyme)复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程。

在DNA不连续复制过程中，结合于复制叉前面，在起始点处解开双链，反应是在解链酶的催化下进行的。

解链酶有ATP酶活性的酶，两种活性相互偶联，通过水解ATP提供解链的能量。

解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。

解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。

如果双链DNA中有单链末端或切口，则DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。

复制时，大部分DNA解旋酶可沿滞后模板的5’—〉3’方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着3’—〉5’方向移动的。

故推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA 的两条母链上协同作用以解开双链DNA。

大肠杆菌中DnaB蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿5′→3′方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。

2.单链结合蛋白(single strand binding proteins,SSBP)ssbDNA蛋白是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质。

原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：若第1个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1，第2个的结合能力可高达103；真核生物细胞中的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应。

ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制后才脱下来，重新循环。

所以，ssbDNA蛋白只保持单链的存在，不起解旋作用。

ssbDNA蛋白稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。

它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用(图)。

SSBP与DNA单链结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。

在E.coli中SSB为四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲和力。

它们与DNA结合时有协同作用。

图大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图3、DNA旋转酶(DNA gyrase )是一个由两个GraA和两个GraB亚基构成的四聚体蛋白，DNA旋转酶以其可以利用ATP结合和水解的能量来介导负超螺旋到松弛的共价闭合DNA而闻名于所有拓扑异构酶。

它是DNA拓扑异构酶Ⅱ中的一种亚类，其主要功能为引入负超螺旋，在DNA 复制中起十分重要的作用。

迄今为止，只有在原核生物中才发现DNA旋转酶。

作用机理： DNA复制时解链产生正螺旋，阻碍复制体的前进，DNA旋转酶通过引起瞬间DNA双链的断裂和重新连接，以改变DNA的拓扑状态，引入负超螺旋。

4.引发体的形成：DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。

由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。

大肠杆菌的引发前体由Dna B. Dna C和单链结合蛋白组成。

(1)引物酶(primase)它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。

这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。

RNA引物的3′桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。

催化RNA引物合成的酶叫引发酶（primerase）。

引发酶识别DNA 单链模板特异序列，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸，产生3′-OH，为DNA聚合酶起始磷酸二酯键提供条件。

引物与典型的RNA不同，他们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。

实验表明，在细菌中，前导链的引物和滞后链中前体片断的引物在合成时需要不同的条件。

滞后链前体片断引物的合成是由引发酶催化的，而引发酶对利福平（rifampicin）不敏感，因此不受利福平抑制；前导链引物的合成是由RNA聚合酶催化的，而RNA聚合酶对利福平十分敏感，所以受利福平强烈抑制。

(2)引发体(primosome)高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。

5、DNA聚合酶1）DNA聚合酶IDNA聚合酶I最初由Kornberg于1955年在大肠杆菌中发现的，纯化的酶是一条相对分子量为109KD的多肽链。

用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。

较大的C末端片断分子量为68KD，叫klenow片断，常用做体外合成DNA 的工具酶；具有5′→3′的聚合酶活性，可以将脱氧核苷三磷酸加到DNA链的3′-OH上，形成3′，5′-磷酸二酯键，这个活性需要DNA模板和引物的存在。

klenow片断还具有3′→5′的外切酶活性，可以从3′端将DNA链水解。

当正确的核苷三磷酸进入正在合成的链的末端，酶就向前移动，一旦发生错误，酶就退回，将错误的碱基切除，这是一种校对（proofreading）功能。

较小的N末端片断分子量为35 KD，具有5′→3′的外切酶活性，在体内功能是切除小的DNA片断，包括切除RNA引物。

尽管DNA聚合酶I活性很高，但它们的主要功能是用于修复体内DNA双螺旋区中的单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下的。

DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nick translation）。

在DNA复制中，RNA引物的切除实际上就是切口平移；DNA的损伤修复中也存在切口平移。

在体外，可以用切口平移来制备高放射性活性的DNA 探针。

2）DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅲ全酶以异源复合体发挥功能。

α亚基、ε亚基和θ亚基相连组成核心酶（core enzyme），每种亚基两个，形成两个催化合成DNA的活性中心。

α亚基具有5′→3′的聚合酶活性，并具有5′→3′的外切酶活性；ε亚基具有3′→5′的外切酶活性，这对校正功能十分重要。

核心酶在τ亚基存在下，形成二聚体。

其他亚基的添加促进二聚化和增强了酶活性（τ亚基起着促使核心酶二聚化的作用）。

DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力，β亚基在二聚体形成中发挥重要的作用。

β亚基的功能犹如夹子、两个β亚基夹住DNA分子并可以向前滑动，使聚合酶在完成复制前不再脱离DNA，从而提高了酶的持续合成能力（通过它形成一个环使DNA聚合酶Ⅲ的核心酶附着在DNA模板上，并可以沿单链DNA滑动而使DNA的复制过程程序化）。

β亚基的定位能防止核心酶在DNA复制过程中从模板上掉下来，如果没有β亚基，核心酶只能合成大约20个核苷酸就要脱离模板。

除了β亚基以外，γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶，两个γ亚基与另4个亚基（δ亚基、δ′亚基、χ亚基、ψ亚基）构成γ复合物，其主要功能时帮助β亚基夹住DNA，故称夹子装置器（clamp loader）。

β亚基在DNA上定位和解离都需要γ复合物介导。

完整全酶为不对称二聚体结构。

当聚合酶遇到逆向模板上前面合成的冈崎片断时，γ复合物的存在允许β亚基从模板上解离。

这样当核心酶合成了冈崎片断，将从后滞链的全酶中释放出来，与下一个由DNA引发酶提供的模板引物的起始前复合物结合。

在半不连续复制过程重，同一个DNA聚合酶Ⅲ分子可以同时合成前导链和滞后链。

更确切地讲，在前导链和滞后链的生长点，核苷酸的增加同时进行。

如前所述，DNA聚合酶Ⅲ有两个DNA合成催化中心，很可能前导链和滞后链各利用一个催化中心合成DNA。

滞后链的模板链围绕一个催化中心折叠成环状结构，使滞后链的方向颠倒(生化方向不变)。

6、DNA连接酶DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口的3′-OH与5′- P酰基形成磷酸酯键。

酶的活化? NAD+或ATP中的腺苷酰基（AMP）与酶活性中心的赖氨酸残基的ε-NH2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶- AMP；腺苷酰化DNA? 酶- AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处的5′磷酰基团，以焦磷酸的形式活化，形成AMP-P-DNA。

亲核攻击完成DNA连接? 通过相邻DNA的3′-OH对活化的P原子进行亲核攻击，生成3′，5′-磷酸二酯键，同时释放出AMP。

二、DNA复制过程真核、原核的复制大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNA复制的终止三个阶段。

起始：DNA解旋酶在局部展开双螺旋结构的DNA分子为单链，引物酶辨认起始位点，以解开的一段DNA为模板，按照5'到3'方向合成RNA短链。

形成RNA引物。

DNA片段的生成：在引物提供了3'-OH末端的基础上，DNA聚合酶催化DNA的两条链同时进行复制过程，由于复制过程只能由5'->3'方向合成，因此一条链能够连续合成，另一条链分段合成，其中每一段短链成为冈崎片段（Okazaki fragments）(由日本冈崎夫妇发现并命名)。