痰标本直接涂片镜检标准规程
肺结核痰涂片检查工作规范
肺结核痰涂片检查工作规范--------------------------------------------------------------------------------痰涂片检查是肺结核病人诊断与鉴别诊断、制定化疗方案、疗效考核的主要方法或手段。
为贯彻落实市卫生局《关于在全市一级以上医疗单位中开展传染性肺结核筛查工作的通知》的精神,加强传染性肺结核病人发现力度,特制定本规范。
一、痰检的对象和要求(一)对象1.咳嗽、咳痰≥3周或有咯血或血痰症状以及胸片异常者。
2.进行疗效考核的病人:凡已确诊、登记、治疗的肺结核病人,在化疗期间应按规定定期作痰菌复查。
1)初治涂阳病人(含重症涂阴病人)在疗程满2、5、6个月时,复治涂阳病人在疗程满2、5、8个月时,各查痰一次。
2)初、复治涂阳病人在疗程满2个月时,痰菌仍为阳性者,应在治疗满 3个月时增加查痰一次。
3)确诊、登记的涂阴肺结核病人,即使病人因故未接受治疗,也应在登记后满2和6个月时进行痰菌检查。
(二)要求1.初诊病人应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)。
如无夜间痰,在留清晨痰后2~3小时再留取一份痰标本;或在送痰时,留取两份即时痰。
治疗中或复诊随访病人按期每次送检两份痰(清晨痰和夜间痰)。
2.痰标本采集:即时痰为病人就诊时咳出的痰液。
清晨痰为清晨深咳出的痰液。
夜间痰为就诊前一天晚睡前咳出的痰液。
痰标本应以脓样、干酪样或脓性粘液样性质的痰液为合格标本,痰量应为3~5毫升。
应由检验人员或专人验收痰标本,痰液不合格者,要求重新送检。
难以获得合格标本时,也应进行细菌学检查,但应注明标本性状以供分析结果时参考。
痰标本的容器,应采用国家参比实验室推荐的国际通用痰瓶或采用直径4厘米、高2厘米的塑料或涂蜡纸密闭盒。
留痰容器上应注明病人姓名、编号(门诊序号或病人登记号)及日期。
13.痰标本的保存和输送:痰标本容器密封,勿倒置,严防痰液外溢。
不能立即作涂片检查的痰标本,须置4℃冰箱保存,防止痰液干涸或污染。
痰检标准操作程序
痰检室标准操作程序一、进入实验室工作前，穿戴工作衣、口罩、帽子、手套。
二、痰标本分类：1、即时痰；2、夜间痰；3、次日晨痰。
三、痰标本性状分类：A、干酪痰；B、血痰；C、黏液痰；D、唾液痰。
标本量一般3—5ml。
四、标本采集：（一）初诊患者应收集3份痰液标本（1.即时痰；2.夜间痰；3.次日晨痰）；（二）治疗中或者随访患者按期留取2份标本（1.晨痰；2.夜痰）。
注：若当日未能检查的标本，应放入4℃冰箱保存，避免干固或污染。
五、标本处理：（一）收集痰标本后，首先将病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、痰标本序号和性状作登记。
（二）用铅笔在有磨砂面的新玻片上注明实验序号及标本序号。
注：确保玻片上的编号与痰盒上的编号一致（三）小心打开痰标本容器，使用折断的竹签挑取痰标本中可疑部分，于玻片正面均匀涂抹成10㎜×20㎜的卵圆形痰膜。
注：取样、染色必须在通风柜中进行。
（四）待痰涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距离10㎜以上，酒精灯5秒钟内将玻片经过火焰加热4次固定。
（五）染色：1、滴加石炭酸复红初染液盖满玻片，加热出现蒸汽，染色5分钟。
2、用流水自玻片一端轻缓冲洗，沥干水，滴加脱色液，脱色1分钟。
3、用流水自玻片一端轻缓冲洗，沥干水，滴加亚甲蓝复染液，染色30秒。
4、流水自玻片一端轻缓冲洗，沥干水，待玻片干燥后镜检。
（六）镜检：1、取染色干燥的玻片，痰膜向上放置在显微镜台上并固定。
2、先用10倍目镜调节成像清晰后，在玻片上滴1—2滴专用镜油，使用100倍油镜进行细致观察。
六、结果判定：阅片时，从头开始，以“弓”形移动读片，在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色杆状，其他细胞呈现蓝色。
1、观察300视野未见抗酸杆菌为阴性；2、1-8条/300视野以条数报告；3、3-9条/100视野为1+；4、1-9条/10视野为2+；5、1-9条/每视野为3+；6、≥10条/每视野为4+。
七、使用完显微镜后，立即用镜头纸将油镜擦净，关闭显微镜电源。
痰检实验室操作规程
痰检实验室操作规程一、检查程序（一）痰标本收集：在三个痰标本盒上注明病人的姓名、编号、检查日期和容器序号。
病人首次留痰前应指导病人，留取“即时痰”、“夜间痰”、“晨痰”合格的痰标本，对所送不合格痰标本除常规检查外，应要求患者重新送检，合格的痰标本包括干酪痰、血痰、粘液痰。
唾液或口水用于病人确诊时为不合格痰标本，标本量一般在3～5 ml。
（二）痰涂片制作：1、检查前对新的玻片用95%的乙醇擦拭脱脂，经干燥、清洁、检查无油污、无划痕后作为合格的玻片备用。
在已经准备的痰玻片背面左端的1/3处注明编号，挑取痰标本中可疑部分约0.05～0.1 ml，于玻片正面右侧2/3处，均匀涂抹成10×20 mm的卵圆形痰膜。
2、痰膜朝上静置自然干燥后(一般约需要30分钟)进行染色镜检。
当气温低，痰膜不易干燥时，严禁将玻片直接在火焰上烘拷，以防产生气溶胶或痰膜脱落。
一张载玻片上只能涂抹一份痰标本，一张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于痰涂片染色检查。
3、涂抹完毕后的痰标本，在检查结果报告前，应暂时保留。
以备涂片、染色不合格影响镜检结果时，重新涂片和染色之用。
4、萋－尼氏染色油镜检查.（三）实验室登记：按照年度病人序号和痰标本序号在实验室登记本上进行登记，并以同样的号码在痰涂片检查单上进行标记。
检验单的病人姓名应与实验室登记本一致。
（四）痰涂片检查结果登记与报告：及时在登记本上登记痰涂片检查结果。
当病人的三次痰涂片检查完成后，发现有阳性痰涂片，应在规定时间内报医院防保科，县级结核病防治机构再对痰涂片进行确认。
（六）痰涂片的保存：每个查痰点镜检后的全部痰涂片应按实验室登记本序号连续排列，分别存放在各点固定的玻片盒中，供上级实验室复核确认。
（七）痰检质量控制：每个痰涂片检查点均按照中国结核病防治规划《痰涂片镜检质量保证手册》的要求，作为一个独立的被质控单位接受室间质量评估和检查工作。
二、萋－尼氏染色1、涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持在10 mm以上的距离；火焰固定(在5秒钟内将玻片置于火焰上来回烘烤4次)。
痰涂片标准化操作
普仁医疗集团 无锡市第五人民医院检验科 刘君
主要内容
标本收集与运送
抗酸菌涂片 Ziehl-Neelsen 染色 显微镜读片检查 结果登记与玻片保存 抗酸菌涂片检查假阳性及假阴性的可能因素
标本收集与运送
提纲
标本容器 标本编号 收集方法与运送注意事项 标本的质量评价
假阴性的原因
1）观察涂片的视野数量不足 2）镜检技术能力差 3）染色操作不规范（抗酸杆菌颜色 暗淡、背景太淡或过深） 4）显微镜存在问题 5）染液质量差
假阴性导致的结果
结核病人没有得到正确诊断和治疗， 向其他人传播疾病，或者死亡 随访病人缩短了应有的治疗时间
AFB假阴性结果的预防措施
确认标本是痰、而非唾液。 确认每份标本至少有1 ml。 选择脓样、干酪样、粘液痰涂抹制备玻片。 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。 使用高质量染料、按照配方配制染液。
次日清晨留取的痰
*如果规划指南有所调整，请依据指南调整
用于疗效监测的随访标本
随访标本 (在治疗期间和结束的时候收 集)
晨痰 另外一份标本依据 NTP 指南进行收
集
标本收集
安全意识: 患者比标本有危险!
如果有实验员指导监督病人留痰，那么 他面临的危险要远高于其他实验员
痰标本收集的生物安全
2. 痰标本来源：根据患者做痰检查时的情况，选 择1栏填写。初诊患者填写门诊序号，随访患者填 写患者登记号。
3. 性状：标本性状按照国家实验室质量控制新标 准，分为干酪痰（A）、血痰(B)、粘液痰(C)和唾 液(D)，分别按A、B、C、D分类登记。
填写说明：
4. 结果：涂片阳性者使用红笔记录为“数字+”， 如“1+、2+、3+”，300个视野内仅见1～8条抗酸 杆菌者填写“条数”；阴性结果填为“阴性”， 不能记录为“-”或“（-）”。
痰涂片镜检操作规范
玻片的保存
使用显微镜附带的镜油，或者是购 买的镜油（immersion oil）,而不 是香柏油（cedar oil）,则不需使 用二甲苯，直接使用镜头纸擦拭即 可 干燥后的玻片，按实验室序号及涂 片编号放置在玻片盒中，存放在阴 凉干燥环境中。处于潮湿炎热的环 境中抗酸菌易于褪色。
痰细菌学检查工作经常被忽视
标本性状的控制加强于医生沟通3份痰标本1即时痰2夜间痰3晨间痰痰标本保存不能当日检查的保存于冰箱防液化染液控制用之前过滤一下一周一次如何进行痰涂片质量控制室内质控抽查复检当日10的涂片自查或互查选取结果可疑的涂片复查尤其是只看到一条的或只在一处视野看到细菌选择痰阳病人有阴性结果的涂片记录结果18条涂片玻片的保存使用显微镜附带的镜油或者是购买的镜油immersionoil而不是香柏油cedaroil则不需使用二甲苯直接使用镜头纸擦拭即干燥后的玻片按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中存放在阴阴凉干燥凉干燥环境中
痰涂片镜检操作规范
宁波市疾病预防控制中心 平国华
一、标本的来源与收集
初诊时留取标本数量 以三份标本的阳性检出例数作为 100％，留取一份标本的阳性检出 例数占全部阳性例数的80％，留取 两份标本的阳性检出例数占全部阳 性检出例数的95％。
不同痰液涂片阳性率表 （仅供示例）
性质 干酪样痰 血性痰 粘液性痰 水样痰 例数 55 46 529 92 阳性数 36 16 56 7 阳性率 65.5% 34.8% 10.6% 7.6%
附件（仅 供参考）
六、评价痰涂片 位置 大小（10mm×20mm） 厚薄（刚好透过报纸的5号字体，镜下每个视 野20个左右细胞） 染色（肉眼看天蓝色,无红/紫色斑块） 脱落（＜10%痰膜面积）
单一的抗酸菌
“V”- 字形
痰涂片标本合格的判定标准
痰涂片的标准操作规程跟取痰的方法途径有很大关系，如果取痰不当可以受到口腔的污染，而导致标本结果判断会不正确。
因此一般取痰主要是以什么样的方式取痰要做一个标明，如果是自然咳痰或者是诱导痰，或者是经鼻腔和口腔吸痰，经人工气道吸痰，经支气管镜采样，支气管肺泡首先要换洗。
然而痰涂片的痰标本取材后2小时以内进行处理，如果时间不足可将标本放置在二到八摄氏度里温度保存。
痰涂片要给与详细的一些记录，所有的痰标本必须进行涂片，必要时在生物安全内进行操作，必须戴乳胶手套，必须打开风吹。
痰涂片选择标本脓性和血性部分涂片，均匀薄片，进行咳痰标本量判断显微镜下细菌型观察痰涂片。
痰涂片标本的质量判断在低倍镜下观察记录，平均每低倍镜视野白细胞和鳞状上皮细胞数，合格的上皮细胞是小于十个，不合格的上皮细胞是大于或等于十个。
如果发现有许多加抹的也可以进行一些排练，可能是肺炎链球菌感染。
痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册
痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册一、操作流程1. 准备工作在进行痰涂片镜检之前，首先要做好准备工作。
包括整理工作台、准备所需试剂和材料、带好个人防护用具等。
确保环境整洁，避免外界污染。
2. 采集标本需要采集患者的痰液标本。
在采集时，要注意不要污染标本，并且采集的标本应该足够用于镜检。
3. 制作涂片将采集的痰液标本滴于载玻片上，用另一块载玻片将其涂开，制作成薄膜。
这一步需要技术娴熟，避免产生气泡或过厚的制片。
4. 干燥固定将制作好的涂片进行干燥固定，以保证镜检时的清晰度和稳定性。
通常可以用自然风干或特殊设备进行干燥。
5. 着色染色将干燥固定的涂片进行染色处理，使细胞和微生物更易于观察和分辨。
6. 镜检操作进行镜检操作。
在显微镜下观察涂片，分析痰液中的细胞、细菌和真菌等微生物结构和形态，及时记录观察结果。
二、质量保证手册1. 质量控制制定痰涂片镜检的质量控制标准，包括操作流程、质量评价标准、设备维护等方面，确保每一项操作都符合标准要求。
2. 培训与考核对进行痰涂片镜检的人员进行专业培训，包括操作技巧、细胞和微生物识别能力提升培训等，并定期进行考核，确保技能和认识的稳定性。
3. 质量评价建立定期的内部质量评价机制，对镜检结果进行复核、比对等，在发现问题时及时采取纠正措施。
4. 设备维护对显微镜等设备进行定期的维护保养，确保设备的正常使用和观察质量。
三、个人观点痰涂片镜检在临床诊断和疾病监测中扮演着重要的角色，标准化操作和质量保证手册则是保证检测结果准确性和稳定性的基础。
通过规范的操作流程和严格的质量控制，可以减少操作误差和结果偏差，提高痰涂片镜检的准确度和可靠性。
培训检验人员和定期的质量评价不仅可以提升检验人员的技术水平，还可以及时发现和解决问题，保证实验室检测的质量和可靠性。
总结回顾通过本文对痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册的介绍，我们了解到了其重要性和必要性。
良好的操作流程和质量保证手册是保证痰涂片镜检准确性和可靠性的关键步骤，对于临床诊断和疾病监测具有重要的意义。
痰液及下呼吸道分泌物培养简易操作规程
.痰液及下呼吸道分泌物培养标准操作流程1 观察标本合格后操作。
一般为晨痰，再留取痰之前刷牙、反复漱口，应从气管深部咳出痰，吐进无菌容器内送检。
涂片白细胞小于10，上皮细胞大于25为不合格痰，相反白细胞大于25，上皮细胞小于10-25为合格痰标本。
2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3 接种环灭菌—待冷却后—取痰液—接种到血平板、中国兰平板（或麦康凯平板上）。
平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二三区依次用接种环划线。
（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线应接触上一区域的接种线2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。
（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板的底部向上）于35°C培养18-24小时。
4观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还是杆菌后鉴定种属。
5 做药敏试验-------报告结果。
便培养标准操作流程1.收取有粘液或脓血、稀水粪便标本。
2.点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3.接种环灭菌—待冷却后—取粪便—接种到血平板、SS平板、中国兰平板（或麦康凯平板上）。
平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二三区依次用接种环划线。
（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线应接触上一区域的接种线2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。
（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板的底部向上）于35°C培养。
4培养18-24小时后观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还是杆菌后鉴定种属。
5 做药敏试验-------报告结果。
尿培养标准操作流程1 收取晨尿第一泡清洁中段尿。
（把外阴用肥皂清洗一遍，再用清水清洗两遍，待干或用干净布擦干）用导尿管的病号需新换导尿管后取标本2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3 接种环灭菌—待冷却后将标本混匀，用定量接种环取尿液1ul(大约一接种环）—接种到血平板，接种环灭菌---待冷后取标本接种到中国兰平板（或麦康凯平板上）。
肺结核痰涂片检查工作规范
肺结核痰涂片检查工作规范--------------------------------------------------------------------------------痰涂片检查是肺结核病人诊断与鉴别诊断、制定化疗方案、疗效考核的主要方法或手段。
为贯彻落实市卫生局《关于在全市一级以上医疗单位中开展传染性肺结核筛查工作的通知》的精神，加强传染性肺结核病人发现力度，特制定本规范。
一、痰检的对象和要求（一）对象1．咳嗽、咳痰≥3周或有咯血或血痰症状以及胸片异常者。
2．进行疗效考核的病人：凡已确诊、登记、治疗的肺结核病人，在化疗期间应按规定定期作痰菌复查。
1）初治涂阳病人（含重症涂阴病人）在疗程满2、5、6个月时，复治涂阳病人在疗程满2、5、8个月时，各查痰一次。
2）初、复治涂阳病人在疗程满2个月时，痰菌仍为阳性者，应在治疗满 3个月时增加查痰一次。
3）确诊、登记的涂阴肺结核病人，即使病人因故未接受治疗，也应在登记后满2和6个月时进行痰菌检查。
（二）要求1．初诊病人应送3份痰标本（夜间痰、清晨痰和即时痰）。
如无夜间痰，在留清晨痰后2～3小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。
治疗中或复诊随访病人按期每次送检两份痰（清晨痰和夜间痰）。
2．痰标本采集：即时痰为病人就诊时咳出的痰液。
清晨痰为清晨深咳出的痰液。
夜间痰为就诊前一天晚睡前咳出的痰液。
痰标本应以脓样、干酪样或脓性粘液样性质的痰液为合格标本，痰量应为3～5毫升。
应由检验人员或专人验收痰标本，痰液不合格者，要求重新送检。
难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状以供分析结果时参考。
痰标本的容器，应采用国家参比实验室推荐的国际通用痰瓶或采用直径4厘米、高2厘米的塑料或涂蜡纸密闭盒。
留痰容器上应注明病人姓名、编号（门诊序号或病人登记号）及日期。
3．痰标本的保存和输送：痰标本容器密封，勿倒置，严防痰液外溢。
不能立即作涂片检查的痰标本，须置4℃冰箱保存，防止痰液干涸或污染。
合格痰涂片判断标准
合格痰涂片判断标准
痰涂片检查是诊断下呼吸道感染性疾病，并明确具体的病原体的常规检查之一。
痰片合格的标准，就是在低倍显微镜下进行观察，如果显微镜下鳞状上皮细胞每个低倍视野小于10个就判断为合格，说明痰液标本来自于下呼吸道的可能性非常大，而不是来自于口咽部。
如果显微镜下出现的纤毛柱状上皮细胞或者肺泡巨噬细胞，也可以认为是相对合格的标本，因为这两种细胞都提示来自以下呼吸道的可能性。
相反的，如果鳞状上皮细胞每个低倍视野大于10个，就是不合格的痰涂片标本，说明标本来自于口咽部的可能性非常大，应当重新采集，或者通过诱导痰试验、支气管灌洗来采集标本。
痰培养标准操作程序
SOP_15-9 痰培养标准操作程序一、痰培养标本采集和运送见本手册《病原微生物标本的采集运送和处原则》。
二、标本验收1.申请单验收：要求痰培养申请单除患者的基本信息以外还应包括标本收集时间、收集方式、是否已使用抗生素等，验收时应检查申请单是否填写完整。
2.标本验收：（1)制成涂片行革兰染色;(2)于显微镜低倍镜下检查(10×10),观察WBC及扁平上皮细胞存在情况,下表作为参考。
痰标本显微镜检查的分类分类※分类中1～3类不做培养,要求重新留取标本;4、5类为合格标本;第6类为气管穿刺液,※如未见到白细胞,而扁平上皮细胞>10/低倍视野,亦应重新留取标本。
（3）特殊要求则作特殊处理,如做抗酸染色查找抗酸菌等。
3.不合格标本处理：(1）对申请单信息不全者应设法与临床医师取得联系；(2）对标识不符、送检容器不合格，送检时间超过规定时间的标本应注明原因，退回，要求重新留取标本，并做记录。
三、实验室检查标本预处理：采用先用20ml生理盐水洗涤两次，经过10ml生理盐水稀释后，加入1%的PH7.6的胰蛋白酶溶液消化90min后接种。
并同时在洗涤后制作原始痰涂片，进行染色镜检。
分离培养:痰标本接种3种培养基,即血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基（嗜血杆菌专用）、麦康凯平板。
培养条件：置烛缸普通培养18-24h如无病菌生长时，应将所有培养基继续培养24h。
四、结果观察和报告1.结果观察和评价：2.阴性培养结果报告：无致病菌生长/上呼吸道正常菌群生长。
3.阳性培养结果报告：有意义的阳性培养结果报告：细菌种属名称及标准抗菌药物敏感性试验结果。
结核病防治规划 痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册10-22-2 新版EQA
中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册编委会名单主审肖东楼王文杰许绍发王黎霞主编赵雁林刘宇红姜广路夏辉尚美编者（以姓氏拼音为序）柴琦陈马秀陈田雄冯苗顾才宏贾卫蓝如束李定越李国刚李国明李辉李琳梁庆福刘洁柳正卫梅建尼玛彭多潘毓萱钱明司红艳苏云开谭云洪王进鸿王莉王庆王瑞王苏民杨修军杨丹丹袁薇张学志赵德福周杨前言为加强我国结核病实验室网络建设，提高各级痰涂片实验室工作质量，我国自2004年引入并全面推行了世界卫生组织（WHO）推荐的“结核病实验室痰涂片检查室间质量保证指南”，并出版印刷了第一版《中国结核病防治规划·痰涂片镜检质量保证手册》（以下简称“手册”）。
在使用新的痰涂片镜检质量保证方法的实践中，我们积累了经验，也发现了一些问题；同时，随着我国结核病控制一些新技术策略的出台，现行“手册”需要进行相应的修改和补充。
为此，我们广泛征求了各省专家意见，并进行多次讨论，为了更准确地描述本手册涵盖的内容，经2008年省级参比室工作会议决定，将本手册命名为《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》。
本手册包括了第一版的大部分内容：结核病痰涂片检查的标准化操作、我国结核病实验室网络中各级实验室在痰涂片镜检质量保证中的职责、实验室质量控制及评估的具体方法，并附有统一的表格，供各省（自治区、直辖市）、地市、县区、乡镇卫生院以及各医疗机构从事结核病痰涂片检查的实验室遵照执行。
本手册在修订和出版过程中，得到了香港跨国结核病参比实验室甘启文主任（Dr. KaiMan KAM）、WHO顾问金尚才教授（Dr. SangJae KIM）以及WHO驻中国代表处医学官员海妮女士（Dr. Cornelia Hennig）的大力支持和帮助，谨表谢意。
编委会2008年10月前言3第一章绪论6第二章痰涂片显微镜检查标准化操作7第一节痰涂片检查的目的及优势 (7)一、诊断传染性肺结核 (7)二、评价化疗效果 (7)三、为流行病学疫情评价服务 (7)第二节痰涂片检查对象 (8)一、确定诊断 (8)二、疗效评价 (8)第三节痰标本的采集 (9)一、采集痰标本的容器 (9)二、痰标本的采集时间和采集次数 (9)三、对就诊者的留痰宣传教育 (9)四、采集痰标本地点 (10)五、痰标本评价 (10)第四节直接涂片抗酸染色显微镜检查标准化操作程序 (11)一、萋尔原尼尔逊染色显微镜检查法（Ziehl-Neelson，简称萋尼染色法） (11)二、荧光染色显微镜检查法 (14)三、玻片的保存 (15)四、抗酸菌痰检注意事项 (15)第五节显微镜的使用、维护和保养 (17)一、一般原则 (17)二、日常维护 (18)三、维修和保养 (18)第六节试剂和材料 (19)第三章痰涂片显微镜检查质量保证20第一节实验室网络及职能 (20)一、结核病实验室网络 (20)二、质量保证体系中各级实验室职能 (21)第二节室内质量控制 (22)一、痰标本收集 (22)二、抗酸染色液制备 (23)三、涂片制备 (23)四、染色 (23)五、镜检 (24)六、登记报告 (24)七、痰涂片保存 (24)第三节室间质量评估 (25)一、现场评价 (25)二、盲法复检 (26)三、批量测试 (36)第四章报表39一、盲法复检结果上报 (39)二、实验室基本情况上报 (40)参考文献43附件45附件１、结核病细菌学实验室登记本 (45)附件２、痰涂片镜检检验 (47)附件３、染色剂配制、保存 (49)附件４、结核病实验室痰涂片镜检督导清单 (51)附件５、督导报告参考模式 (57)附件６、盲法复检涂片抽取举例 (59)附件７、术语注释 (62)第一章概论在结核病控制工作中，通过实验室细菌学检查诊断传染性肺结核是DOTS策略的重要要素之一，痰结核菌检查对于发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核疗效、评价防治效果具有重要意义。
痰标本留取标准操作规程
痰标本留取标准操作规程
1、咳痰标本留取
1.1 嘱病人用清水漱口三次，指导病人用力深咳嗽，从呼吸道深部咳出新鲜痰液于无菌容器中。
1.2 痰量极少者可用生理盐水雾化吸入导痰。
1.3 检查分支杆菌和卡氏肺包囊虫可用3%～10%高渗氯化钠溶液雾化吸入导痰。
2、痰标本送检
2.1 痰标本收集后应及时（30分钟内）送检。
2.2 不能及时送检者，可暂存4℃冰箱。
3、痰标本质量评价：
符合以下情况之一者为合格：
3.1 痰液直接涂片光镜检查每低倍视野鳞状上皮细胞＜10个、多核白细胞＞25个。
3.2 痰液直接涂片光镜检查每低倍视中，野鳞状上皮细胞：白细胞<1:2.5。
结核杆菌涂片镜检操作规程
结核杆菌痰涂片镜检操作规程一、涂片：取经95%乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片，于玻片的磨砂处编号，用接种环或折断的竹签，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分，于玻片正面的右侧处均匀涂抹成10 x20mm的卵圆形痰膜，自然干燥后待检。
二、染色步骤：1.固定：涂片自然干燥后，放置在染色架上，加热固定（在5秒钟内将玻片经过火焰加热4次）；2.初染：滴加石碳酸复红染液盖满痰膜，加热至出现蒸汽后，停止加热，保持染色5分钟。
染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液，切勿使染色液沸腾；3.水洗：流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水；4.脱色：自痰膜上端外缘滴加脱色液盖满玻片，脱色1分钟；如有必要，流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止；5.水洗：流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去标本上剩余的水；6.复染：滴加亚甲兰复染液，染色30秒；7.水洗：流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水；8.待玻片干燥后镜检。
三、镜检与报告：光学显微镜镜检（目镜1OX，油镜IOOX）染色痰片，在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。
按照下列标准报告所得结果：1）抗酸杆菌阴性：连续观察3个不同视野，未发现抗酸杆菌。
2）抗酸杆菌可疑（土）： 1 2条抗酸杆菌/ 3个视野。
3）抗酸杆菌阳性（1+）： 3 9条抗酸杆菌/1个视野。
4）抗酸杆菌阳性（2+）： 1 9条抗酸杆菌/10个视野。
5）抗酸杆菌阳性（3+）： 1 9条抗酸杆菌/每个视野。
6）抗酸杆菌阳性（4+）： >10条抗酸杆菌/每个视野。
阴性结果应填记阴性”不得以“（一）”表达。
3个视野内仅见1〜2条抗酸杆菌者，应在报告单上注明条数，医生可结合胸片进行判断。
必要时再取标本复查证实。
痰液细菌学检验的标准化操作程序
痰液细菌学检验的标准化操作程序卢先雷1前言众所周知，传统习气顺序的痰标本细菌学检验其临床契合率并不高,其缘由是多方面的。
除了痰标本采集不规范招致的不合格标本带来的培育结果与病人感染不相符外，还由于微生物和人体的相关性自身就具有复杂性：源自细菌的致病与条件致病的辨证性，如致病菌能够为正常携带，而细菌在肺通气功用异常病人的下呼吸道的可以发作单纯定植或感染，要证明培育结果与感染的相关性是医学微生物学所面临的难题，这也使得不时以来在关于痰培育的规范化停顿十分缓慢，以致在各版«全国临床检验操作规程»上也未提出相应详细可行的令全国同行公认的一致规范的规范化操作顺序〔SOP〕和完整的痰液培育的质量控制方法。
习气顺序的痰标本细菌学检验的缓慢也很不顺应临床诊断治疗的迫切性[1]。
故而，树立规范而快速的痰液细菌学检验的SOP关于提高呼吸系统感染病的诊治水平和控制抗生素的滥用等效果均有重要的作用痰培育阳性率普遍教低，临床契合率差的关键要素是痰标本采集不规范，不合格痰标本将直接招致病原菌被分别的时机降低，少量正常菌群也会抑制病原菌的生长或搅扰病原菌的检出，降低了临床契合率；再有就是操作顺序的不规范，不注重直接涂片，检验进程控制的不严密也是招致临床契合率低的重要缘由。
我们经过SOP的临床运用状况的剖析，痰培育阳性率和临床契合率均能够被提高，并且细菌散布统计结果显示本文与国外文献所报道的状况基本分歧[2]。
关于直接涂片的意义，在于判别标本中微生物有无、类型、染色特性、形状特征，标本的污染状况，还可对痰标本中能够的病原菌初步诊断(依据人体被病原菌感染后的炎性渗出包裹和白细胞吞噬反响)，判别能否存在双数菌感染，静态观察处于治疗进程中不同时期所送检的标本中病原菌状况的变化〔似乎种病原菌数量的增减，机体的免疫反响，菌群的交替〕。
甚至可以推断临床治疗疗效和病人病情的变化和转归，医院内感染的发作等，具有重要意义[3]。
痰涂片标本合格的判定标准
痰涂片标本合格的判定标准痰涂片是一种常见的细菌培养和药敏试验的方法，用于检测痰液中的病原体，帮助医生诊断和治疗呼吸道感染等疾病。
痰涂片的合格与否对于正确的诊断和治疗至关重要。
以下是痰涂片合格的判定标准的详细说明：1. 样本收集:- 痰涂片样本应该由经过专业训练的医务人员采集，保证样本的准确性和安全性。
- 痰液样本应该由患者完成咳痰后采集，采集时应该确保患者的嘴巴和痰盂是清洁的。
- 样本采集时应该避免过多的唾液混入痰液中，唾液的存在可能影响结果的准确性。
2. 样本准备:- 采集到的痰液样本应该进行处理，去除其中的一部分唾液和杂质。
- 首先，将痰液样本倒入干净的容器中，并用标本容器盖盖紧。
- 然后，将标本容器送到实验室进行后续处理，避免在送样过程中造成样本的损失或污染。
3. 样本标本:- 实验室技术人员应该及时处理痰液样本，避免样本失效或菌落过多。
- 实验室人员应该根据实验室的规范操作流程，按照正确的标本处理方法进行操作。
- 实验室人员应该注意保护自己的人身安全，避免在操作过程中与病原体直接接触。
4. 样本制片:- 为确保痰涂片制作的质量，实验室人员需要按照标准的制片流程进行操作。
- 首先，在清洁的玻片上滴加适量的痰液样本，然后用另一个玻片将痰液样本均匀涂布在玻片上。
- 制片的时候应该避免过量或过少样本的使用，过多的样本可能会导致制片不均匀，而过少的样本可能会导致结果不准确。
5. 样本染色:- 染色是痰涂片的重要步骤之一，实验室人员应该掌握正确的染色方法和操作技巧。
- 通常，格拉姆染色和酸镍染色是常用的染色方法，实验室人员应该根据所需的染色效果选择合适的染色方法。
- 染色完成后，实验室人员应该检查染色效果，确保染色结果清晰可见，便于后续的细菌鉴定。
6. 样本鉴定:- 细菌鉴定是痰涂片结果分析的关键步骤，实验室人员应该根据标准的鉴定流程和技术规范进行操作。
- 实验室人员应该准确鉴定痰涂片中存在的细菌，并进行记录和报告。
结核病痰涂片检查及质量保证
3、载玻片
（1）新载玻片应经95%乙醇脱脂，检查 无划痕后，方可使用。 （2）一张载玻片只能涂抹1份痰标本。 （3）载玻片只允许一次性使用，严禁清洗 后重复使用。 （4）载玻片只允许左侧1/3处标注实验室 序号。 （5）载玻片正面右侧2/3中央处均匀涂抹 成面积为10× 20mm的卵圆形痰膜。
1.对技术人员复训 2.对假阳性涂片重新染 色并复检
1.2.3.对技术人员复训 4.现场检查显微镜状态 5.重新购置质量合格的 染料并重新配制染液
1.2.3.对技术人员复训 4.现场检查显微镜工作 状态
(六)废弃标本和污染物的处理
废弃标本、痰盒和污染物均须经高压蒸汽 灭菌后方能丢弃或清洗； 如需焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。 焚化不彻底或暴露焚烧是危险的； 试验操作工作面应以3%石炭酸或其他可 靠的消毒液擦拭，再用紫外线灭菌灯照射 30分钟。
6、登记报告
（1）登记前应对检验单、标本盒、涂片上 的标注进行反复核对。 （2）检查后的第一张涂片结果，应按规定 准确记录在“结核病细菌学实验室登记本” 上。 （3）镜检结果报告应及时发出，以便尽早 为临床提供诊断依据。
7、痰涂片保存
（1）镜检后的涂片应及时用浸满二甲苯 （分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底祛除 涂片上的镜油。 （2）涂片脱去镜油后，必须再次核对实验 室登记本与每张涂片实验序号。 （3）涂片上严禁标记镜检的阴、阳性结果。 （4）全部涂片按实验室登记本序号连续排 列，存放于玻片盒中。
2、检查步骤：现场评价操作步骤 ①试剂 ②供应 ③实验室安全 ④显微镜 ⑤用于室间质量保证的玻片储存 ⑥涂片、染色和镜检 ⑦现场复检 ⑧督导小组检查和/或复检印象 ⑨盲法复检痰片抽样 ⑩现场评估概述
呼吸道标本细菌学检验标准操作规程
呼吸道标本细菌学检验标准操作规程1目的规范呼吸道标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2适用范围呼吸道标本培养和涂片检查。
3标本3.1标本类型：痰、咽拭子、支气管肺泡灌洗吸出液、支气管冲洗液或刷子、肺穿刺等。
3.2标本采集3.2.1采集时间：以晨痰为好；支气管扩张症病人，清晨起床后进行体位引流，可采集大量痰标本。
3.2.2自然咳法：在留取痰之前，用清水反复漱口，应从气管深处出痰，吐入无菌容器内。
3.2.3气管镜下采集法：在病灶附近用导管吸或用支气管刷直接取得标本。
3.2.4气管穿刺法：在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。
3.2.5棉拭采集法：用无菌棉拭子轻轻擦拭病人鼻咽部黏膜，留取标本，置无菌试管内送检。
3.3标本拒收标准3.3.1申请单姓名、科别、床号与标本的标签不符。
3.3.2痰标本呈水样或唾液样。
3.3.3痰涂片白细胞<10/低倍视野，上皮细胞>25/低倍视野。
3.3.4标本容器溢漏，无瓶盖。
3.3.5痰标本留取放置时间太长，超过2小时。
3.3.6未用指定的无菌容器作细菌培养。
3.4标本保存采集标本后立即送到实验室，放置时间不超过2小时。
4试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦康凯平板、相关生化试剂等。
4.2VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡、革兰阴性菌药敏卡、革兰阳性菌鉴定卡、革兰阳性菌药敏卡、药敏纸片等，有效期及储存条件参见试剂说明书。
培养箱4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2等。
5细菌鉴定和药敏监控参见《质量管理程序》。
6检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。
6.1肉眼观察：包括颜色、黏度、有无血丝或脓。
6.2涂片检查：可以确定标本是否适合做细菌培养，直接涂片镜检，依据低倍镜下观察白细胞和上皮细胞数目多少来评定。
并可初步判定是否有病原菌存在。
痰标本镜下分类分级白细胞（个）上皮细胞（个）A>25<10B>25<25C<10>25注：A、B两种情况的痰标本适合做培养，C不合格，应重新留标本。
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2.2.2.3滴加亚甲蓝复染液，染色30秒，流水从玻片一端轻缓冲洗，冲去
复染液，沥去玻片上剩余的水，待玻片干燥后镜检。
2.2.3待检涂片检查
2.2.
3.1染色合格的涂片，由于被亚甲蓝染色而呈均匀亮蓝色，且无红色
斑块；染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂布面积的10%
2.3镜检
2.3.1油镜下观察300个视野以上或者连续观察5分钟
2.3.2观察方法
2.3.2.1使用10×目镜双目显微镜读片；
2.3.2.2取染色完毕且已经干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡
尺固定；
2.3.2.3首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节
至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；
2.3.2.4移开40×物镜，在玻片上滴1-2滴镜油，使用100×油镜进行仔
细观察。
但应注意避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。
2.3.2.5读片时，首先应从左至右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一
端时，纵向向下转换一个视野，然后从右至左观察，以此类推；
2.3.2.6在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其他细菌和细胞呈蓝色。
2.3.2.7仔细观察完300各视野，一般需要5分钟；每个工作日，一位镜
检人员阅读玻片量不超过25张，且连续阅读10-12张玻片后应
休息20分钟左右。
2.4结果判断
2.4.1阴性：镜检300个视野以上或连续观察5分钟未发现抗酸杆菌
2.4.2阳性：阳性（300个视野内有1~8条抗酸杆菌）
阳性1+（100个视野内有3~9条抗酸杆菌）
阳性2+（10个视野内有1~9条抗酸杆菌）
阳性3+（每个视野内有1~9条抗酸杆菌）
阳性4+（每个视野内有9条以上抗酸杆菌）
2.5结果报告与记录
2.5.1将检测结果填写入申请单报告栏，报告格式如下:
涂片1：阴性（-）
镜检结果：涂片2：阴性（-）
涂片3：阴性（-）
2.5.2将检测结果记录于结合门诊检测登记册中：
涂片号标本性状检测结果
例： 1： D 阴性（-）
2： D 阴性（-）
3： D 阴性（-）
2.6痰涂片的保存
2.6.1阅读完毕后的涂片，应及时用擦镜纸轻轻在涂片上揭取数次，彻底
去除玻片上的镜油。
2.6.2经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中避光保存，以备复检或质控抽检。
3.质控
3.1质控周期
阅片人员更换或每批次阅片前
3.参考文献
3.1卫生部疾病预防控制局、中国疾病预防控制中心《痰涂片镜检标准化
操作及质量保证手册》200902第一版。