SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告(参考资料)
实验一 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
3.浓缩胶的制备 按下表配制浓缩胶, 按下表配制浓缩胶,将浓缩胶混 匀后直接灌注在已聚合的分离胶 立即插入梳子, 上,立即插入梳子,将凝胶垂直 放于室温下聚合。 放于室温下聚合。
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 2小滴 小滴 0.05 5ml
4.样品预处理: 样品预处理: 取样品液与等体积样品缓冲液 混合,100℃加热1 分钟。 混合,100℃加热1~2分钟。 5.待浓缩胶聚合完全后,小心移出 待浓缩胶聚合完全后, 梳子, 梳子,然后将胶板固定于电泳装置 上下槽各加入电极缓冲液。 上,上下槽各加入电极缓冲液。 6.加样: 加样: 用微量进样器加样。 用微量进样器加样。 每个样品孔加入20ul样品 样品。 每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。 同时加一个标准品。
分离胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 分离胶缓冲液(pH8.8) 分离胶缓冲液(pH8.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 10%(ml) 10 10 7.5 0.3 1滴 滴 0.1 30ml
将分离胶混匀后立即灌注于玻板间 隙中,上层小心覆盖一层正丁醇。 隙中,上层小心覆盖一层正丁醇。 将胶板垂直放于室温下, 将胶板垂直放于室温下,待分离胶 聚合完全后, 聚合完全后,倾去正丁醇并用滤纸 吸干。 吸干。
操作步骤 1.安装制胶模具 A 、要用琼脂进行封边,防止 要用琼脂进行封边, 凝胶泄露, 凝胶泄露,尤其注意边角的 地方。 地方。 B、安装时,要将螺丝拧紧, 安装时,要将螺丝拧紧, 也是为了防止泄露。 也是为了防止泄露。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告:SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定蛋白质相对分子质量,了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白质的结合性质,将蛋白质变性并带负电荷,使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量,而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质,可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材:SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等;器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品:选择已知相对分子质量的标准蛋白样品,将其与G250染料混合,煮沸变性,冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品:将待测蛋白质样品与G250染料混合,加入适量SDS-PAGE缓冲液,煮沸变性,冷却后作为待测样品。
4.制胶:将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合,倒入制胶板中,插入样品梳子,静置凝固。
5.电泳:将凝胶放入电泳槽中,加入适量电泳液,将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源,调整电流和电压,开始电泳。
6.染色和脱色:电泳结束后,将凝胶取出,用G250染料进行染色,然后进行脱色处理,以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定:通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品,可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验,我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱,并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较,发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外,我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异,表明它们具有不同的相对分子质量。
5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量一、目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。
二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开,是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故,如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度,这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS是十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)的简称,它是一种阴离子去污剂,它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物,其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷,也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别,这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素,就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。
本实验用目前常用的垂直平板电泳,样品的起点一致,便于比较。
三、试剂和器材(一)试剂1. 凝胶贮备液:丙烯酰胺(Acr)29.2g和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)0.8g重蒸水溶解后,定容至100ml,棕色试剂瓶4℃保存,30天内使用。
2. 分离胶缓冲液:1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8。
18.15 Tris(三羟甲基氨基甲烷),少许重蒸水溶解,用1M HCl调pH8.8,重蒸水定容至100ml,4℃保存。
3. 浓缩胶缓冲液:0.5mol/LHCl,pH6.8。
6gTris,少许重蒸水溶解,用1M HCl调pH6.8,重蒸水定容至100ml,4℃保存。
4. 10%SDS,室温保存。
5. 两类样品缓冲液:2倍还原缓冲液(2×reducing buffer)0.5mol/L HCl,pH6.8 2.5 ml甘油 2.0 ml质量浓度10%SDS 4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇 1.0 ml总体积10 ml6. 电极缓冲液,pH8.3。
Tris3g,甘氨酸14.4g,SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml,4℃保存。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量一、实验目的:1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
2、学习并掌握SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
二、实验原理:SDS-PAGE电泳法,即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法,。
1.在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
2.在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),SDS 是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
三、仪器、原料和试剂1、仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅,染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。
2、原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液,也可配成混合蛋白质标准液。
3、试剂:(1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH8.9):取1mol/L盐酸48mL,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
(2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH6.7):取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
(3)30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同,称丙烯酰胺(Acr)30g 及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g,溶于重蒸水中,最后定容至100ml,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃保存。
(4)10%浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis 0.5g,溶于重蒸水中,最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃贮存。
蛋白质sdspage电泳实验报告
蛋白质sdspage电泳实验报告蛋白质SDS-PAGE电泳实验报告引言:蛋白质是生命体中最基本的分子之一,它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。
为了研究蛋白质的性质和功能,科学家们开发了许多技术和方法。
其中,SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析方法,它通过电泳的方式将蛋白质按照其分子量大小进行分离和定量。
实验目的:本实验旨在通过SDS-PAGE电泳技术对不同来源的蛋白质进行分析,了解其分子量和纯度,并探讨其应用于蛋白质研究中的意义。
实验步骤:1. 样品制备:收集不同来源的蛋白质样品,如乳清蛋白、鸡蛋清蛋白等。
将样品加入SDS-PAGE样品缓冲液中,加热至100摄氏度,使蛋白质完全变性。
2. 准备电泳胶:根据实验需要,配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶,加入TEMED和过硫酸铵使其聚合。
3. 装载样品:将变性后的蛋白质样品注入电泳胶槽中,注意不要产生气泡。
4. 电泳:将电泳胶槽连接至电源,设置合适的电压和时间,进行电泳分离。
5. 凝胶染色:将电泳胶取出,用凝胶染色剂染色,使蛋白质带可见。
6. 图像分析:使用分子量标准品作为参照,通过图像分析软件测量蛋白质带的迁移距离,计算其分子量。
实验结果:通过SDS-PAGE电泳实验,我们成功地将不同来源的蛋白质样品分离出来,并得到了清晰的蛋白质带。
根据分子量标准品的迁移距离,我们计算出了各个蛋白质样品的分子量。
讨论:1. 分子量测定:通过SDS-PAGE电泳实验,我们可以准确地测定蛋白质的分子量。
这对于研究蛋白质的结构和功能非常重要,因为不同分子量的蛋白质可能具有不同的生物活性和相互作用方式。
2. 纯度分析:通过观察电泳胶上的蛋白质带的清晰度和数量,我们可以初步评估样品的纯度。
纯度高的样品通常只有一个清晰的蛋白质带,而纯度低的样品则可能有多个模糊的带。
因此,SDS-PAGE电泳可以帮助我们选择纯度较高的蛋白质样品进行后续实验。
3. 应用前景:SDS-PAGE电泳技术在生物医学研究中有着广泛的应用前景。
SDS-PAGE实验报告
生化实验总结报告实验名称:SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者:田景辉(201306230114)专业:生物工程指导教师:许培雅日期:2015.12.30组员:杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。
2.实验背景在实验一中,用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS(十二烷基苯磺酸钠)法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取,得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。
最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。
实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化,得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。
实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化,得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠), SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“-”极向“+” 极移动,从浓缩胶进入分离 胶,速度变慢,堆积浓缩。
缓冲液 样品 浓缩胶
分离胶
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“-”极向“+” 极移动,从浓缩胶进入分离 胶,速度变慢,堆积浓缩。
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂, 它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
3、蛋白质样品的处理
1)标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl样品溶解液中,沸水浴中加热35min后上样。
4、加样
用移液器分别取10 l样品液,小心将样品加到凝胶 凹形样品槽底部。并做好标记。
5、电泳 将电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接,打开 电泳仪开关,开始时电流为10 mA,待样品进入分离 胶后,将电流调至20-30 mA,当溴酚蓝染料距硅胶框 1cm时,停止电泳,关闭电源。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Staking gel Separating gel
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
SDS-PAGE测定蛋白质
缓冲液
浓缩胶 分离胶
分子筛效应
分离胶的孔径小, 分离胶的孔径小,各分子由 于大小和形状不同, 于大小和形状不同,所受阻 力不同, 力不同,表现出不同的泳动 速度,即分子筛作用。 速度,即分子筛作用。分子 量小, 量小,形状为球形的泳动速 度最快。 度最快。
分离胶 浓缩胶 缓冲液
【操作方法】 操作方法】
【实验原理】 实验原理】
电泳 带电颗粒在电场作用下, 带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电
极移动的现象。 极移动的现象。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(Acr) 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(Acr) 单体丙烯酰胺 和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 甲叉双丙烯酰胺(Bis) (TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成 TEMED) 催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成 过硫酸铵 的三维网状结构的凝胶。 的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳 称为PAGE PAGE具有电泳和分子筛的双重作用 PAGE。 具有电泳和分子筛的双重作用。 称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。
4、加样 用移液器分别取10 样品液, 用移液器分别取 µl样品液,小心将样品加到凝 胶凹形样品槽底部。 做好标记。 胶凹形样品槽底部。并做好标记。 5、电泳 将电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接, 将电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接,打开 电泳仪开关,开始时电流为10 mA, 电泳仪开关,开始时电流为10 mA,待样品进入分离胶 后,将电流调至20-30 mA,当溴酚蓝染料距硅胶框1cm 将电流调至20mA,当溴酚蓝染料距硅胶框1cm 20 时,停止电泳,关闭电源。 停止电泳,关闭电源。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
• 聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种: • (1)化学聚合:通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂, 四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在TEMED 催化下,过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、 活化形成自由基丙烯酰胺,从而引发聚合作用。 • (2)光聚合:通常采用核黄素作催化剂,核黄素 在光照下光解成无色基,后者再被氧化成自由基 而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大,而且 随时间延长而逐渐变小,不太稳定。化学聚合的 凝胶孔径较小,且各次制备的重复性好。故一般 采用化学聚合。
四 电泳
• 将上槽接负极,下槽接正极,打开电源, 开始时将电流控制在15~20 mA,待样品进 入分离胶后,改为30~50 mA。待蓝色染 料迁移至下端约1~1.5 cm时,停止电泳, 约需1~2小时。
五 剥胶
取下凝胶模子,将凝胶片取出,滑入一白 瓷盘或大培养皿内,在染料区带的中心插 入细铜丝作为标志。
六 染色和脱色
染色 用一块胶,另一块胶用于转膜。 加入染色液,染色45分钟。 脱色 染色完毕,倾出染色液,加入脱色液。 20~30min换一次脱色液,2~3次后可初步 观察电泳条带,然后脱色过夜,直至背景 清晰。
七 Mr的计算
• 通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁 移率的计算方法如下:用直尺分别量出样品区带 中心及铜丝与凝胶顶端的距离,按下式计算: • 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)/染料 迁移距离(cm)。 • 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率 作图,得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移 率,从标准曲线上查出其相对分子质量
牛血清 样品2 样品1 蛋白 样品1 marker 样品2 牛血清
第一组加样
第二组加样
第二块胶加样顺序与第一块胶相同
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告:SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的:通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。
二、实验原理:SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。
在该技术中,蛋白质样品与SDS(十二烷基硫酸钠)和还原剂混合后,加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合,形成具有负电荷的复合物。
这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。
蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶,即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶,蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散,形成连续的蛋白质稜。
然后,电泳阶段开始,电场通过凝胶,带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。
三、实验步骤:1.准备SDS-电泳胶液:根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液,即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。
2. 准备样品:取相应的蛋白质样品,如细胞裂解液,将其与试剂R (含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺)和Laemmli试剂混合,以加热破坏蛋白质的二级结构。
3.堆胶:将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中,留出足够的空间来注入分离胶液。
4.加载样品:在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。
5.电泳:将电泳槽连接到电源,调节电压,使电流保持稳定。
首先进行堆胶阶段,然后切换到电泳阶段,直至蛋白质移动到凝胶底部。
6. 凝胶染色:取下凝胶,用凝胶染色剂对凝胶进行染色。
一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。
四、实验结果:根据实验步骤描述的方法进行实验后,我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带,每条条带代表一个蛋白质。
条带的颜色越深,表示其含量越多。
通过与分子量标记的对照,可以确定蛋白质的相对分子质量。
五、实验讨论与分析:根据实验结果,我们可以推断蛋白质的相对分子质量。
相对分子质量可以通过标准曲线法来计算,即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。
通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点:能够同时分离多个蛋白质;能够对蛋白质进行集中分析;精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。
sds-page
一、实验目的:1.1理解SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的基本原理。
1.2掌握分子电泳的基本步骤,掌握计算蛋白质相对分子质量的方法。
二、实验内容和原理:2.1电泳(electrophoresis):是指带电颗粒在电场中向着与它电性相反的电极移动的现象。
许多重要的生物分子都含有可电离基团(如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等),在非等电点条件下可解离成带有电荷分子,在电场力的作用下,它们向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异,在电场中的迁移速度不同,从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。
可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。
2.2影响带电粒子在电场中泳动的因素:①生物分子的性质:待分离生物大分子所带电荷的多少、性质、分子大小和形状都会对电泳产生明显影响。
②缓冲液:缓冲液pH值直接影响生物分子的解离程度和带电性质。
溶液pH值距离等电点愈远,生物分子所带净电荷就越多,电泳时速度就越快。
当缓冲液pH大于等电点时,生物分子带负电荷,电泳时向正极移动;当缓冲液pH小于等电点时,生物分子带正电荷,电泳时向负极移动。
③电场强度:电场强度指每单位介质长度的电位梯度(又称电位差或电位降)。
一般而言,电场强度越大,电泳速度越快。
但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大,从而造成电泳过程产生的热量增多,最终导致介质温度升高。
降低电流强度,可以减少产热,但会延长电泳时间,引起生物分子扩散增加,同样影响分离效果。
所以电泳实验中要选择适当的电场强度。
④电渗:液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。
由于支持介质表面存在一些带电基团,如滤纸表面含有羧基,琼脂含有硫酸基等。
这些基团电离后使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动。
当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度;当电渗方向与电泳方向相反时,则降低电泳速度。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂,在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原;SDS能使蛋白质的非共价键(氢键、疏水键)打开,并 结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质),形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷,当它与蛋白质结合时,所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
7.5
10% SDS
0.3
TEMED 10%过硫酸铵
总体积
0.03 0.1 30ml
二、凝胶的制备
1、分离胶的制备 将所配制的凝胶溶液沿着凝胶的长玻璃片的内 面用细长头的滴管加至长、短玻璃片的窄缝内, 加胶高度距样品槽模板下缘约2 cm。用滴管沿玻 璃片内壁加一层蒸馏水(用于隔绝空气,使胶面 平整),约30-60 min凝胶完全聚合,用滴管吸去 分离胶胶面的水封层,并用无毛边的滤纸片吸去 残留的水液。
五、电泳
将上槽接负极,下槽接正极,打开电源,开 始时将电流调为20 mA,待样品进入分离胶后,改 为50 mA。待蓝色染料迁移至下端约2 cm时,停止 电泳,约需3-4 h。
浓缩胶浓缩 示意图
六、剥胶和固定
取下凝胶模子,将凝胶片取出,滑入一大培 养皿内,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在 两侧溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿 标记。加入固定液(应没过凝胶片),固定2 h或 过夜。
以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图, 得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率,从标准曲线 上查出其相对分子质量。标准蛋白质相对分子质量从大到 小依次为116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 KDa。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
6 、染色与脱色 电泳结束后,取下玻板,在自来水下用特制板撬开短 玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在两侧溴 酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。加入染 色液染色60 mins,再用脱色液脱色,直至蛋白质区带 清晰,即可计算相对迁移率。
7、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mR:
有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的,它们在 SDS和巯基乙醇作用下,解离成亚基或单条肽链,因此 这一类蛋白质,测定的只是亚基或单条肽链的MW。
蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴 酚兰的作用分别是什么?
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的 作用是什么?
3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂, 它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
轻轻插入梳齿至浓缩胶内,避免带入气泡。约 30min后凝胶聚合。
3、蛋白质样品的处理
1)标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
SDS-PAGE测定蛋白质
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“-”极向“+” 极移动,从浓缩胶进入分离 胶,速度变慢,堆积浓缩。
缓冲液 样品 浓缩胶
分离胶
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“-”极向“+” 极移动,从浓缩胶进入分离 胶,速度变慢,堆积浓缩。
6 、染色与脱色 电泳结束后,取下凝胶模,卸下硅胶框,用不锈钢药 铲撬开短玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记, 在两侧溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。 加入染色液染色1-2 h,再用脱色液脱色,直至蛋白质 区带清晰,即可计算相对迁移率。
7、 结果处理
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mR:
【思考题】
1、在样品溶解液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴酚兰的作 用分别是什么?
2、电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3、在SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和
AP,试述其作用? 4、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
SDS-PAGE过程有浓缩效应和分子筛效 应浓缩效应
浓缩胶(大孔胶)
浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl, 电极缓冲液pH8.3 Tris-Gly
解离度 :Cl> 蛋> Gly mcl cl>m蛋 蛋>mGly Gly
凝胶中Cl-为快离子, Gly-为 慢离子,蛋白质样品被夹在中 间。
缓冲液 样品 浓缩胶
3、蛋白质样品的处理
1)标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl样品溶解液中,沸水浴中加热35min后上样。
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SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
一、前言
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、
pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后,HCl解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。
此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。
它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。
二、实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
三、实验原理
1.电泳
带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。
在一定的电场强度下,分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。
2.PAGE
聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。
PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。
PAG机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。
连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
3.SDS-PAGE基本原理
SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。
使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。
解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。
蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。
而与其所带电荷的
性质无关。
当蛋白质的分子量在17,000~165,000之间时,蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系:
lgMW = K - bm
将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁移率对分子量的对数作图,即可得到一条标准曲线。
只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率,就能根据标准曲线求得其分子量。
四、实验器材和材料试剂
仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅,染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。
原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5-1mgml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液,也可配成混合蛋白质标准液。
试剂:(1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH8.9):取 1mol/L盐酸48mL,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至 100mL;
(2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH6.7):取 1mol/L盐酸48mL,Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至 100mL;
(3)30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同,称丙烯酰胺(Acr) 30g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g,溶于重蒸水中,最后定容至100ml,过滤后置棕色试剂瓶中,4保存;
(4)10%浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis 0.5g,溶于重蒸水中,最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中,4贮存;。