抗体工程概述

“小型化抗体”（单链抗体）
组合抗体库技术
噬菌体抗体库技术 Ig基因转基因小鼠 抗体真核表达技术
多克隆抗体
多克隆抗体（polyclonal antibody）
指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决
定簇的多种抗体混合物。
如:免疫血清（含多种特异性抗体）。
实际意义：
（1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等 副作用：超敏反应 （2）临床诊断，如：肥达氏反应 -- 伤寒、副伤寒 缺点：特异性差。
抗 原
31 2 4
BA L B /c
免 疫
1
2
3
4
脾 脏 淋巴結 B 細胞
31 2 4
传统抗血清
所有抗体混合
传统抗血清的交叉反应
专一性反应
交叉反应
沒有反應
2 1 2 3 2
1
2 Ag A
3 1’
2 Ag A’
0x
y Ag B
z
+
?
-
单克隆抗体
可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞融合，则形成稳定而可培 养的细胞株。
抗体攻击病毒
凝 集 细 菌
抗 SARS 的单抗 SARS-CoV
抗体 是对其抗原有极强专一性 的 魔弹 或 巡航导弹
研 究 医 疗 检 验
以免疫转印法检测 特定抗原 以毒素连结抗体攻击 病变細胞 以 ELISA 侦测特定 病原体
抗体药物销售趋势图
表 已批准上市的治疗性单抗 抗体名称
OKT3 Panorex ReoPr o Zenapax Rituxan Simulect Remicade Herceptin Synagis Thymogloblin Mylotarg
Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区 基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过 短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组 嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链
抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反
子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特
适应症
移植排斥 大肠癌 冠心病 移植排斥 淋巴瘤 移植排斥 炎症性肠病类 风湿关节炎 乳腺癌 RSV感染 移植排斥 淋巴瘤
批准日期
1986 1995 1994 1997 1997 1998 1998 1999 1998 1998 1998 2000
Campath
CD52
淋巴瘤
2001
生物技术
生物技术制药
定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗 体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方 法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序 列，然后表达出改型抗体。
研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR 替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建 时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框 架序列进行操作。
基因工程药物（蛋白类药物）
人源化治疗性单克隆抗体药物
基因治疗技术 现代中药
● 至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物 有76种，其中抗体药物有15种。 ● 2003年治疗用单抗销售总额已超过52亿美元。 ● 2006年预计50-60个治疗性单抗上市。 ● 2010年预计单抗销售额200亿美元。 ● 美国已占全球单抗市场90%—一支独秀。 ● 完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段
PCR技术; 免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达; 噬菌体表面展示文库技术。
初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA， 反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建 立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。
噬菌体抗体库技术
它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。
异性抗体。
所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,
除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中
的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应
细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是
肿瘤治疗的新突破。
5
抗体库技术
抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的 全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核 载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。
3 小分子抗体
小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最 小识别单位等几种。 小分子抗体有很多优点:
可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或 酶标抗体等。
Fab
(3)单域抗体
即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构 域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所 降低，但仍保持着原单抗的特异性。
Baidu Nhomakorabea
VH
(4)最小识别单位
约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR 构成，它也保持着抗体的特异性。
CDR
4 双特异抗体和多价抗体
双链抗体 （Diabody）一词最早由Hollinger等于
B
1
抗原決定基
● 若有许多抗原決定基，则需许多株 B 細胞分別生产许多抗体。
B
B B
2
3 4 3
1
抗 原
Y
Y
2 4
Y Y
Y Y Y
Y
1 2
3 4 1
m m
m m
取出脾細胞
+ 癌細胞
2 3 4
细胞融合
1
2
3
4
单抗
各抗体分开
1 2
3
4
m
m
m m
2 3 4
1
Y
Y
Y Y Y Y Y Y
Y
TK-
m
m
HGPRT-
单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全
人工合成法;
在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点 突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合 成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中; 如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方 法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。
单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种 方式: 一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高， 可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性， 使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性; 二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗 体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔 和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产 量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产 量仅在数毫克左右。
1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。
双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是 指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关 抗原。另1种为对应效应成分。 即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效 应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟 天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效 应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。
Epitope, Antigenic determinant
抗原決定基
● 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基
● 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体
● 蛋白质性 抗原決定基 含有六个以上氨基酸
整体水平抗体生成技术
多克隆抗体（抗血清）
细胞工程抗体生成技术
单克隆抗体
嵌合抗体、改形抗体
基因工程抗体生成技术
其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌
体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助
噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体
分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端
或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子
进行筛选。
噬菌体表面展示系统(phage
surface display system
抗体种类
鼠单抗 鼠单抗 人-鼠嵌合Fab 人源化抗体 人-鼠嵌合抗体 人-鼠嵌合抗体 人-鼠嵌合抗体 人源化抗体 人源化抗体 兔多抗 人源化抗体化 疗药物交联物 人源化抗体
靶向抗原
CD3 17-1A 血小板受体 ⅡbⅢa CD25 CD20 CD25 TNF-α HER-2 RSV F蛋白 CD33
单区抗体
最小识别单位
Fv
ScFv
(1)Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下 Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的 活性。
(2)Fv 或 ScFv
Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
Fv
ScFv
连接肽
Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故 Fv不稳定。 在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一 条单链，得到ScFv，即单链抗体。 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长 或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特 点。常用的连接肽是(GGGGS)3。
2 鼠单抗可变区的人源化
尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时 它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗 体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的 可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗 体，也就是人源化抗体。
经过CDR移植，抗体的免疫原性极低， 而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原 及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改 形抗体都已有报道，到现在已有数百种人 源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性 单抗中多数是改型抗体）
)
1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系
统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3
的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利
用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基
因的筛选工作带来了革命性的变革。
Y
Y 癌细胞
可培养生长
Y Y Y Y Y Y
Y
细 胞 融 合
融合瘤
Hybridoma
Y Y Y Y Y Y Y Y Y
浆细胞 B cell 可分泌抗体 一個 B cell 只 产生一种抗体
两组染色体混在一起
也可以培养生長 产生专一性抗体
● 一个 B 细胞只能生产一种抗体，对付某一 抗原決定基。
B
亲和力成熟
人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。
全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的 CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链 分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的 粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火， 然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中， 进一步即可用于构建和表达改形抗体。
核酸
核酸补救合成
TK HGPRT
核酸从头合成 (-)
次黄嘌呤(H)\胸苷(T)
氨甲喋呤(A)
免疫前要先 把抗原作 成乳剂
抗原
a
b
抗原通常有多个抗原決定基
Ag X
约在两月內 注射五到八次
抗原決定基
b c
d
脾脏产生各种 B 細胞
免疫
X
BALB/c 免疫后 的脾脏
-a
-b
-c
-d
采血后可得传统抗血清
抗体
人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒 定区融合而得到的抗体。
构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可 变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因 及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择 标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤 细胞、CHO细胞)中表达。
构建重组表达载体
克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分 离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会 带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产 生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效 应。 人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降 低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种 抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。
廖振林
Tel：68914
Email：602581821@qq.com
食品学院微生物教研室
概 述
讲述内容
• • • • • • • 1 抗原 2 抗体 3 多克隆抗体 4 细胞工程抗体 5 基因工程抗体 6 抗体的分离纯化与鉴定 7 抗体的应用及免疫学检验技术
抗体基本结构
免疫球蛋白的基本结构
已建立之小鼠 骨髓癌细胞株
-a
-b
-c
-d
由脾脏收集 B 細胞
传统抗体 (抗血清) 是所有抗体的混和
骨 髓 癌 细 胞
NS-1
B cell
-b -a
-c -d
脾 细 胞
传统抗体 (抗血清)
细胞融合
PEG HAT -a -b Cell fusion
分株培养筛选
对 抗 原 的 反 应
a b c d
+ + + +
-c
-d ELISA
Ag X
无 法 分 辨
a b c d’
+ + + -
Hybridoma cells
融合瘤细胞
（Subcloning）
筛选
-d
d d
-d
旧有抗原
+
d’ X d’
完 全 不 同
Ag X’
新的抗原
-
(确定只有一种细胞)
试验专一性
单抗
基因工程抗体
1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies)