糖化血红蛋白实验室检测基础及标准化进展

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HbA1c 的主要检测方法的特点
方法 酶法 原理 使用特别作用于氨基酸末端 糖化的缬氨酸的酶检测 HbA1c 优势 不受变异体的分析干 扰 挑战 不能发现血红蛋白变 异体
免疫法
使用针对糖化的β链氨基酸 末端的抗体检测HbA1c
在使用新一代的试剂 盒时分析不受大多数 常见变异体的干扰
最小的Hb变异体分析 干扰
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Sebia 糖化产品概览

Capillarys 2 with Flex Piercing 是Sebia糖化系统中的唯一有 CFDA证的，8个通道同时使用时，1.6分钟/检测。
蛋白）检测被
广泛应用，但 当时结果可比 性很差
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糖化和非糖化的血红蛋白
Hb
血红蛋白
成人血红蛋白分三种， HbA为主要成人Hb
HbA (ß ß )
HbA2 ()
HbF ()
95%
1-3.5% HbA1
6-8%
<2% 糖化Hb
HbA1a: ß链NH2端与其它糖成 分结合的产物 HbA1b: HbA1c进一步代谢的产 物 HbA1c: ß链NH2端与葡萄糖结 合的产物
在第59届美国糖尿病学会年会上，HbA1c监测的重 大影响与胰岛素问世相提并论，并将前者作为血糖 控制的金标准
2014年ADA指南推荐：对于治疗达标（血糖控制稳 定）的患者，每年应该至少进行两次HbA1c检测。对 更改治疗方案或血糖控制未达标患者，应每年进行 四次HbA1c检测
在临床上，无论用什么方法反映血糖的变化，最终 都要以HbA1c的变化作为最终评价一种药物或一个 治疗方案在血糖控制上是否有效的指标
不能发现血红蛋白变 异体，新一代的试剂盒 依然会受到少见变异 体的分析干扰
检测的是总糖化血红 蛋白，而不是 HbA1c, 不能发现血红蛋白变 异体 变异体被共洗脱时易 被干扰 工作流程
硼酸亲和层析法
糖化的血红蛋白被绑定在硼 酸基团树脂时，非糖化的血 红蛋白组分直接流出分析柱 基于电荷分离血红蛋白组分
糖化血红蛋白实验室检测及 标准化新进展
Hannah Yao
Sep 10, 2014 青岛
HbA1c实验室检测
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糖化血红蛋白的发展历史概述
1958年，Allen
报告，在离子交 换层析上的的 人血红蛋白可 以分离出三个 小组分，他们较 HbA的负电荷 更强，被命名为 HbA1a,HbA1b,H bA1c。
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国内上市的硼酸亲和色谱法的主要厂家平台
厂家 仪器
Primus
Hb9210
PDQ Plus Ultra2
Bio-Rad Alere In2it Afinion NycoCard
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免疫分析法检测原理-抗原抗体反应

A: 在没有HbA1c时，polyhaptens（包含多个HbA1c表位的合成分 子）与绑定在微粒上的抗HbA1c抗体反应，形成不溶性抗体polyhapten复合物。这导致显著的光散射（浊度增加）
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Diabetes Care Volume 37, Supplement 1, January 2014 “中国糖化血红蛋白教育计划”教材
HbA1c检测用于糖尿病筛查诊断的全球现状
HbA1c有早期提示的价值，可作为糖尿病的诊断指标
2010年ADA率先正
式推荐HbA1c诊断 DM, 推荐原因之一
用推荐
糖尿病。 但对于采用标准化检测方法，并有严格质量控制，正常参
考值在4.0%~6.0%的医院，HbA1c≥6.5%可作为诊断糖尿病的 参考。
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中华糖尿病杂志2014年7月第6卷第7期
HbA1c 用于糖尿病监测和筛查诊断的必备条件
实验室指标
参与临床评估、作为诊断标准，除了检测指标固有的 先天优势外，具有符合要求的
离子交换HPLC 毛细管电泳法
能够发现常见的血红 蛋白变异体 能够发现血红蛋白变 异体
基于电荷分离血红蛋白组分
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糖化血红蛋白的重要地位

全国总代理-广州执信 价格： 30元/测试（到代理商） 今年在全国主要地区推广力度强，特别在南方两广地区是该公司传 统重要市场
MiniCAP 12
Capillary 2
*(Capillary2 with Flex Piercing 为Capillary2
Capillary2 with Flex Piercing 的升级版，只多了可采原始样本管，其他参数一致) with Flex

图E是一种简化的色谱图（蓝线），显示了非糖化和糖
化血红蛋白组分的分离。
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硼酸亲和色谱法特点
硼酸亲和色谱法直接检测的是总糖化血红蛋白，报告结果是 计算出来的 HbA1c。 硼酸亲和色谱法不能分离出血红蛋白变异体
非糖化Hb
HbA0
87-89%
HbA1a
<1%
4
HbA1b
<1%
HbA1c
4%-6%
胎儿血红蛋白HbF在胎儿及出生6个月以内的新生儿体内为高浓度，6 个月后基本降为成人水平
HbA1c是血红蛋白HbA的糖基化产物
1.
葡萄糖与血红蛋白HbA
发生糖化反应
2.
两步反应：
先快速生成不稳定A1c,
后缓慢生成稳定的A1c。 3. 血红蛋白HbA糖化后，负
6.11 - 6.89 5.85 – 7.15
7.0% A1C
6.72 - 7.28
6.58 - 7.42 6.3 – 7.7
2
3 5
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正常人和病人 无法区分
血糖控制好坏无 法区分
HbA1c分析中偏倚大对临床判断的影响
小的偏倚将导致很大人群的误诊
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Copyright © 2010 American Association for Clinical Chemistry
标准化的目的和意义
目的:实现检验结果的可比性--保证检验质量
意义（益处）
可以建立起普遍接受（可用）的参考区间 可以合并分析、比较不同医学中心的研究资料


促进医学研究和研究成果的转化
能够有效地应用循证医学和检验医学实践指南
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HbA1c实验室检测的标准化进展
1969年Rahbar 使用琼脂电泳，
1970年代中期， 弄清楚了是葡
1980年中期， GHb(糖化血红
DCCT研究发 表后，1996年 起，美国正式 启动了NGSP 项目，推动糖 化血红蛋白检 测的标准化。 2010年达成了 全球标准化共 识
报告糖尿病患
者的这些小血 红蛋白组升高
萄糖对血红蛋
白HbA的非遗 传修饰，产生 了HbA1c
准确性
精密度（CV）
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正确度（Bias）
HbA1c分析中的CV对临床判断的影响
0.5%HbA1c是一个“临床上显著变化”的指标
不同室内CV对 A1C 分析的影响（95%的可信区间）
CV %
6.0% A1C
5.76-6.24
5.64-6.36 5.4-6.6
6.5% A1C
6.24 - 6.76
2011年WHO推荐有
条件的地方采用 HbA1c 诊断糖尿病
中国？？？
就是在美国HbA1c
已高度标准化
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最新2013版中国2型糖尿病防治指南
HbA1c临床应
鉴于HbA1c检测在我国尚不普遍，检测方法的标准化程度 不高，测定HbA1c的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿 病的诊断的要求。本指南仍不推荐在我国采用HbA1c诊断
电荷会增加
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HbA1c 的主要检测方法
基于电荷 • 离子交换高压液相色谱法（HPLC） • 电泳法 • 毛细管电泳
基于结构
• 硼酸亲和层析法 • 酶法 • 免疫法
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各检测方法的分析物
HbA (2b2)
HbA1 HbA1a HbA1b HbA1c HbA0 非糖化成分 糖化成分
硼酸亲和色谱检测物
硼酸亲和色谱法的原理
A：患者的红细胞裂解液注入到含有结合了硼酸基团 的树脂的分析柱中。

B：在pH高于8.0时，血红蛋白被糖化后产生一个特殊 的顺式二糖醇基团与硼酸基团发生反应

C：糖化的血红蛋白被绑定在分析柱中，而非糖化的血 红蛋白组分直接流出

D酸性缓冲液被使用，使得糖化的血红蛋白从分析柱 内释放出来
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国内免疫分析法/酶法厂家仪器平台及试剂盒
厂家 Roche 仪器 Cobas生化系列机型 Hitachi生化系列机型 Siemens Dimension等生化系列机型 ADVIA生化分析系统 DCA Vantage（POCT） Beckman AU生化系列机型 Beckman其他生化系列 Abbott Randox(朗道） 德国胡曼 JEOL Ltd（希森美 康代理） Sekisui（积水） Medical Audit Diagnostics （北京欧迪代理） 国产厂商 国产生化分析系统 ARCHITECT生化仪系列 糖化血红蛋白测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法) 血红蛋白A1c检测试剂盒(乳胶增强免疫比浊法) 糖化血红蛋白(HbA1c)测定试剂盒 糖化血红蛋白检测试剂盒(酶法) 糖化血红蛋白检测试剂盒(酶法) 糖化血红蛋白测定试剂盒(直接法) 国产生化试剂 试剂盒 糖化血红蛋白检测试剂盒(免疫比浊法)Tina-quant系列试剂盒 开放或罗氏试剂 糖化血红蛋白测定试剂盒(免疫比浊法) 糖化血红蛋白A测定试剂盒(乳胶凝集法) 糖化血红蛋白检测试剂盒(免疫乳胶凝集抑制法) 糖化血红蛋白检测试剂盒(比色法)
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国内上市的LPLC方法的主要厂家平台
厂家 深圳普门 Drew Scientific
仪器 GH-900 HbA1c Analyzer Drew DS5 Diastat
江苏奥迪康
AC660
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毛细管电泳法的检测原理

毛细管电泳分离血红蛋白组分是基于电荷等决定的电泳迁移率 一种高压电源产生电场，使分子通过毛细管从阳极迁移到阴极。 患者红细胞裂解液中带正电荷的血红蛋白组分将首先被检测到，其 次是中性物质，最后由带负电荷的血红蛋白组份。电泳图谱显示 HbA1c与HBA0分离。
酶法检测原理

A： 图示是糖化的HbA的β链的前8个氨基酸，
患者的红细胞裂解液在蛋白酶存在的情况下，
氨基酸和小段肽链被释放, 包括HbA1c的氨基 酸末端糖化的缬氨酸


B： 糖化缬氨酸的酶促去糖化反应
C：缬氨酸去糖化过程产生H2O2.H2O2的形成 可以用比色法测定. 产生的信号与样本中的 HbA1c成正比
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国内上市的IE-HPLC方法的主要厂家平台
厂家 Bio-Rad 仪器 VARIANT II Turbo HbA1c Kit-1.0/2.0 VARIANT II HbA1c Program D-10 Hemoglobin A1c Program Tosoh G7 G8 GX Arkray 上海惠中 8160 8180 MQ2000 MQ2000PT

B: 患者红细胞裂解液中的HbA1c与抗HbA1c抗体结合，形成可溶
性抗原抗体复合物，从而减少光散射（浊度降低）。通过比浊测定可
检测出该样本中的HbA1c的量
源自文库
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离子交换色谱和免疫法检测物
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离子交换HPLC检测原理
A:患者红细胞裂解物被注入到带有 负电荷的分析柱中
B, C:因为与带负电荷树脂间的离 子相互作用，带正电荷的血红蛋白 分子的移动速度比带负电荷的慢
D:因为HbA1c比HbA0所带负电荷强， 所以首先被洗脱.
E:离子交换HPLC方法能分离并鉴 定其他种类Hb及一些血红蛋白变 异体，在色谱图上将出现相应的分 离峰