第6章植物基因工程

孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞 ，实现基因的转移。
• 优点：
• 操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于
各种动植物；
• 对受体细胞生命活动影响小； • 受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化
•
二 基因枪法（微弹轰击法）
• 工作原理：
• 将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然
后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或 组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到 植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因 的转化。
等浆果中，被认为具有降低癌症、心脏病和某些神经系统疾病 风险的作用。
•
• 这种蓝玫瑰是转基因玫瑰，被植入
三色紫罗兰所含一种能刺激蓝色素 产生的基因，花瓣因而自然呈现蓝 色。
• 蓝玫瑰由日本三得利公司澳大利亚
分支机构研究培育。完成蓝玫瑰在 自然环境中的生长实验和研究后， 三得利公司计划明年秋季把蓝玫瑰 推向市场，预计市场规模可达数百 亿日元。
质粒。
•
• Ti 质粒的结构与功能
Ti 质粒的图谱 整个质粒 160 - 240 kb 其中 T-DNA 12 - 24 kb
tms 的编码产物负责：
合成吲哚乙酸
tmr 的编码产物负责：
合成植物分裂素
tmt 的编码产物负责：
合成氨基酸衍生物 冠瘿碱
•
• Ti 质粒的结构与功能 • Ti 质粒致瘤的分子机制 • 损伤的植物根部会分泌出乙酰
• 该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记
基因
• 它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。
• 该选择系统目前也有一定的应用，例如矮
牛、烟草和番茄。
•
3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）
• 潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植
物都有很强的毒性。
• 潮霉素林酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其
失活。
• 它应该不依赖于外界选择压力的存在，这一点
也是它与选择基因的区别之处。
•
• 理想报告基因的基本要求：
• 1、受体细胞不粗在相应的内源等位基因的活性
。
• 2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。 • 3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的
检测特性。
•
• 目前最常用的报告基因有： • ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus） • 氯霉素乙酰转移酶基因 • 3.荧光素酶基因
•
1 Ti质粒的改造策略
• Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体
，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工 程载体存在着学多障碍：
• （1） 质粒过大，造作困难 • （2）大型的Ti质粒有多个酶切位点 • （3）植物激素类的影响 • （4） Ti质粒中存在不起作用的序列 • （5） Ti质粒的局限性
•
• Ti 质粒的改造
一、植物基因工程中的选择基因
• 植物基因工程中的基因主要是一类编码可
使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因
• 最常用的有
• 新霉素抗性基因（neor） • 庆大霉素抗性基因（gentr） • 潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt） • 以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等
•
1、新霉素抗性基因（neor）
•
4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）
• 膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，
从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积 。
• 膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）是从吸水链
霉菌中克隆的一种基因
•
二、报告基因
• 报告基因是指其编码产物能够被快速测定
、常用于判断外源基因是够成功地导入体 细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基 因。
第6章植物基因工程
2020年7月24日星期五
第六章 植物基因工程
第一节 植物基因工程的发展 现状
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植物基因工程
• 植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作 • 即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、
遗传转化（根癌农杆菌Ti质粒介导 法、基因枪 法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培 养技术
• 将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中
分子机理
• 6个步骤：
• 1）农杆菌对受体的影响 • （2）农杆菌附着到植物受体细胞 • （3）诱导启动毒性区基因表达 • （4）类似接合孔复合体的合成和装配 • （5）T-DNA的加工和转运 • （6）T-DNA的整合
•
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 3. T-DNA转移的影响因素
• （1）农杆菌菌株 • （2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期 • （3）基因活化的诱导物 • （4）外植体的类型和生理状态 • （5）外植体的预培养 • （6）外植体的接种及共培养
丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它
们能诱导Ti质粒上的vir基因以
及根瘤菌染色体上的一个操纵
子表达。vir基因产物将Ti质粒
上的T-DNA单链切下，而根瘤 菌染色体上的操纵子表达产物 则与单链T-DNA结合形成复合 物，后者转化植物根部细胞。
•
• Ti 质粒的结构与功能 • T-DNA的染色体整合机制
•
• Ti 质粒的结构与功能 • T-DNA的染色体整合机制
质或细胞核，从而实现外源基因的转移。
• 优点：
• 方法简单、转化率高； • 纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性
；
• 对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育； • 培养过程无需特殊选择系统。
•
５激光微束介导的基因转化
• 原理：
• 将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照
射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小
，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗 传，
• 从而使受体获得新性状的技术体系。
•
转基因植物的理论前景和意义
• 通过将目的基因导入农作物、园艺作物中
，改变它们的遗传特性，
• 使植物免受病虫的危害， • 或获得抗除草剂的特性， • 或改变种子中淀粉、蛋白质的含量和组成、 • 或改变花的形状和颜色， • 或改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的
• 特点：
• 转化率高 • 操作繁琐 • 技术性高
•
3 电激法介导基因转化
• 原理：
• 利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿
孔“，形成可逆的瞬间通道,从而促进 外源DNA 进入原生质体。
• 特点：
• 转化率高；操作简便 ；容易造成原生质体损伤
。
•
４显微注射介导的基因转化
• 原理：
• 利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞
• 以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外
源ＤＮＡ直接导入植物细胞的方法。
• 主要方法:
• 1) PEG介导的基因转化 • 2) 脂质体（liposome)介导的基因转化 • 3) 电激法 • 4) 激光导入法 • 5) 显微注射法
•
1 PEG介导的基因转化
• 原理：
• 利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细
但对植物受体细胞也产生一定的伤害.
• DNA纯度及浓度 • 微弹速度 • 植物材料内在因素
•
三、根癌杆菌介导法
• 根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植
物。
• 根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠
瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为
• 章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种类型 • 在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti
• 动力类型：
• 火药爆炸力；高压气体；高压放电
•
操作步骤
• （1）制备DNA微弹； • （2）准备靶外植体材料； • （3） DNA微弹轰击； • （4） 培养轰击后的外植体．
•
转化率影响因素
• 金属微粒
• 金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵.
• DNA沉淀辅助剂
• 这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用,
能抑制非转化细胞生长的有毒物质如抗生素、除草 剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除 培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只 有转化细胞才能生长繁殖；
• 另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选
择性培养基中不能生殖，而选择基因可以补偿这种 缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。
•
•
基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较
• (1)基因枪法——多拷贝整合概率高，外源基因默
表达
农杆菌介导——低拷贝整合（多为单拷贝整合） 转化效率较高。
• (2)基因枪法——纯物理转化，不存在物种的限制
。
农杆菌介导——存在宿主范围的局限性。
• (3)基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研
究。
•
第六章 植物基因工程
第三节 转化子细胞的筛选
•
• 当采用某种转基因方法处理外植体后，通
常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转 化
• 只有采取有效的转化方法，才能提高准确地选
择到转化细胞。
• 一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外
，大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使 用。
•
• 转化筛选细胞的方法主要有两种
• 一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入
• 新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分
离的
• 其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418 • 卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制
蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能 而阻断真核细胞中的蛋白质合成
• 新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。
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2.庆大霉素抗性基因（gentr）
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• 向小麦插入一种来自烟曲
霉（Aspergillus fumigatus）的肌醇六磷酸 酶基因，这种小麦的肌醇 六磷酸酶最高可以在89摄 氏度的时候保持稳定。