金标层析法与金标渗滤法

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胶体金检测试纸生产工艺

胶体金检测试纸生产工艺本项目主要从事犬、猫传染病抗体胶体金检测试纸的生产，以微孔滤膜为固相载体，膜上包被已知抗体，待加入检测样本后，经毛细管虹吸作用或微孔滤膜的渗滤作用，使标本中的抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再通过胶体金标记物与复合物反应，可形成肉眼可见的红色产物。

目前应用最为广泛的胶体金免疫技术有侧向横流模式，又称金标免疫层析法（ImmUnOgoIdChrOmatograPhyASsay,GICA ）O金标免疫层析法试纸条主要是通过毛细管虹吸作用反应,它由以下几部分组成:样品垫、胶体金垫、NC 膜（硝酸纤维素膜）、吸水滤纸、以及PVC 底板，NC 膜（硝酸纤维素膜）上包括一条检测线（T 线）和一条质控线（C 线）一次层叠起来，如下图所示：图3 金标免疫层析法示意图在吸水材料的牵引下，待测抗原在试条上向上走，首先与金标抗体结合成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物上行到检测线时，被测抗原的另一结合位点与包被在此处的单抗结合，形成两个抗体结合一个抗原（双抗体夹心）的金标复合物，因有金颗粒在此沉积，故T 线显红色。

未结合抗原的金标抗体上行到C 线时，与“抗金标抗体”结合，所以C 线也显红色。

检测结果判定：T 线与C 线均显线，表明检测结果为阳性；C 线显线，T 线不显，表明结果为阴性。

若C 线不显线，则检测结果无效。

工艺流程如下所示：NC«（跚咬纤假素膜）PVC 底板测试线（TtK 1）M 析方向样品稀释液噪声：N ；一般固体废物：不合格品(S1)；废防粘纸(S2)；边角料(S3)；废包装物(S4)；危险废物：废一次性滴管(S5)玻璃器具清洗废水(S6)；玻璃器具淋洗废水(S7)；超声波清洗废水(S8)、超声波冲洗废水(S9)o图4胶体金检测试纸生产过程示意图工艺流程简述： (1)检测：外购硝酸纤维素膜、金结合垫、吸水垫、样品垫均人工目视进行检验。

①硝酸纤维素膜：人工目视干燥后的包被膜表面应洁净、无污染、破损等，如有，需用笔标出。

金标渗滤法快速检测曼氏裂头蚴病患者血清IgG

金标渗滤法快速检测曼氏裂头蚴病患者血清ＩＧ＊ｇ
王越，汤益干小仙 ”，
摘
要：目的探索简易、快速的人曼氏裂头蚴病血清学免疫诊断方法。方法将曼氏裂头蚴可溶性抗原点样于硝酸纤
维素膜上，以胶体金一Ｐ为检测标记物，用垂直流渗滤装置检测病人血清中曼氏裂头蚴特异性ＩＧ抗体。结果曼氏裂ＳＡ采ｇ头蚴病病人血清阳性检出率为９．（３２）健康人群血清假阳性率为２Ｏ（／０）与囊虫病、吸虫病、吸虫病、２０２／５，．２１０；肺血华支睾吸虫病、毛虫病病人血清的交叉反应率分别为４．（６４）５．（３２）１．（／０、．（／５、．（／旋００１／０、２０１／５、３３４３）８Ｏ２２）６７２３）未发现与广州管圆线虫病、核病病人血清有交叉反应；ＥＩＡ平行检测７０，结与ＬＳ４人份血清，种方法检测结果的一致性有两极显著性意义（Ｋ一０８１Ｐ００１。结论金标渗滤法检测曼氏裂头蚴病病人血清中特异性ＩＧ，仅简易、速而且检．７，＜．０）ｇ不快
中图分类号：３３３文献标识码：Ｒ８．５Ａ
ＲａｄｄｅｅｔｏｆｓｃｆｃＩＧｎｓｒｆｐａｉｎｔｔｎｆｃｉｎｐｉｔｃｉｎｏｐｅｉｉｇｉｅａｏｔｅｓｗｉｈｉｅｔｏｏｆＳｐａｒｎｇａｕｍａｓｎｉｂｏｍｍｕ－ｏｄｆｌｒｔｏｓａｍｎｏｙｄｔｉｎｏｇｌｉｔａｉｎａｓｙ

实验室常用检测方法原理

实验室常用检测方法原理临床检测常用反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量，血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱酯酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。

一般每毫升含皮克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。

用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性），而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。

目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质，这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。

一级反应的反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量（如测定血糖、总甘油三酯、总胆固醇等）。

从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。

现介绍临床检验常用检测方法原理及检测方法解释。

一、细胞计数原理血细胞悬浮在电解液中，用一定的电流通过传感器的内外两个电极，由于血细胞电阻抗很大，当血细胞通过两个电极时，电极间阻抗瞬间增大，形成幅度与血细胞体积成正比的电脉冲，根据脉冲的大小可测出细胞的体积。

二、尿液分析仪的检测原理将吸附有尿液的试剂带放在仪器比色槽内，试剂带上已产生化学反应的各种试剂垫被光源照射，其反射光被球面积分仪接收，球面积分仪的光电管被反射的双波长光（通过滤片的测定光和一束参考光）照射，各波长的选择由检测项目决定。

三、尿液试剂带的反应原理1.pH值测定：采用pH指示剂原理，常用甲基红和溴麝香草酚蓝组成的复合型指示剂，呈色范围从pH4.5～pH9，颜色由橘黄色、绿色变为蓝色，由此反映尿液的pH值。

2.尿蛋白质测定：利用pH指示剂蛋白质误差的原理。

3.尿葡萄糖测定：当前有两种完全不同的检测尿糖的方法，一种是基于葡萄糖氧化酶法原理，能特异地检出尿中的葡萄糖；另一种是基于铜还原法的原理，能检测葡萄糖和其他还原性物质。

胶体金法的定义和分类

胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。

近年已在各种生物学研究中广泛使用。

在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。

同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。

1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。

目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Do t-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。

免疫胶体金技术的基本原理：胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。

胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA 等。

根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。

吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。

用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。

这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

免疫胶体金层析法

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免疫胶体金层析法
——金标记免疫法测HCG
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原理
• 采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反应后根据在膜上的颜色判断结果。
• 以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析
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← HCG分子 ← 鼠抗人HCG单抗 ← 胶体金颗粒
←胶体金标记鼠抗人HCG单抗
←羊抗鼠IgG
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positive
HCG 阳性标本
MAX
尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物随层析作用向上移动,至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗(IgG)随着尿液上行,到达质控线与羊抗鼠IgG(二抗)结合而显色，作为质. 控对照。
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方法学评价
• 该法为定性检测尿中HCG，不能确定其浓度 • 因为该法是用单抗来测定HCG，特异性较高，黄
疸、蛋白、血细胞和浑浊度对结果观察都无影响。、 • 晨尿中一般含有最高的HCG值，检出率较高。 • 检测时间：HCG一般在受精卵着床后几天才出现在尿液中，而且要达到一定的量才能被检出，因此，对于平时月经正常的妇女需在月经推迟后才可能在尿中检出，二月经周期长或排卵异常的妇女有可能在停经40-44天才能检出 • 尿液稀释：如果喝水过多使尿液稀释可能会导致假阴性结果。
金标鼠抗人IgG单抗随层析作用向上移动，到达质控线，无羊抗鼠IgG( 二抗)或破坏失效，不结合而不显色，作为质控对照。
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大便隐血
MAX
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注意事项
• 1. 将试条有标志线的下端浸入尿液标本中，深度不可超过标志线（若超过，可能会出现假阳性）

HCG金标免疫试验方法及注意事项

HCG金标免疫试验方法及注意事项1．金标免疫试验的原理将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金)标记抗体，(或金黄色葡萄球菌A蛋白SPA)。

金标为一种催化剂，经还原剂(如对苯二酸)处理，将显影剂中的银离子还原成不溶性金属银，沉淀在每个金颗粒的周围，银沉淀在光镜下可清楚地显示。

滴金免疫实验原理同一般免疫斑点实验，也是用已知抗原或抗体包被硝酸纤维素膜，再用金标记抗体或抗原进行快速测定。

临床应用的有两种方法：金标一步法(层析法)和金标二步法(斑点渗漏法)。

具体讲即用两个人HCG—β单克隆抗体，一个抗体吸附于硝酸纤维素薄膜(NC膜)上，另一抗体结合于金溶胶颗粒表面。

尿中HCG先与NC膜上的抗体-结合，然后再与金标单抗溶液反应，形成抗体一HCG一金标抗体的加心式复合物．红色的金斑点．胶体金溶液的制备是依所需胶体金颗粒的直径配制A液及B 液，见表4—7。

预热至6 0℃并保持此温度，磁力棒搅拌混合A液及B液，加热至沸，溶液由蓝紫变成橙红色，表明胶体金颗粒形成。

冷后补加重蒸馏水至100ml。

免疫金银染色法用5mm直径胶体金，滴金免疫技术用15mm胶体金。

2．金标免疫试验的方法(1)金标二步法(斑点渗漏法)：中心圆点为一株单抗(金一Ab—Abl一薄膜的红色斑点)，边上小点为抗鼠二抗(金一Ab—Ab2一薄膜的质控点)。

试剂盒包括：渗滤盒和金标记抗HCG一β亚单位单抗体。

渗滤盒为30mm长，6mm厚的正方形塑料盒，中央有8mm直径的圆孔。

盒内紧塞多层吸水填料，填料上为孔径0．45nm的硝酸纤维素薄膜，膜上包被有抗HCG的抗体。

操作方法为先用小吸管向检测盒圆孔中央滴3滴待检尿液。

待渗入；然后加金标记抗HCG—β亚单位单抗液(A试剂)两滴，待渗入后取出滤器；最后加B试剂(PBS)两滴，待干。

结果判断：阳性为小孔中央出现红色斑点，质控点呈蓝色，提示含有HCG。

阴性为小孔中央无红色斑点，仅质控点呈蓝色，提示不含HCG。

胶体金免疫层析试验须注意的几个问题

胶体金免疫层析试验须注意的几个问题1971年，Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。

1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。

此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快[1]。

目前在医学检验中的应用主要是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay GICA）和胶体金免疫渗滤法（gold immunofiltration assay GIFA）。

1990年Beggs[2]和Osikowicz[3]等相继建立了免疫层析试验。

胶体金免疫层析试验是将各种反应试剂分点固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上移行并与膜上另一种试剂接触，标本中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。

层析过程中免疫复合物被聚集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。

而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。

其特点是单份测定、简单、快速，除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。

目前已在临床检测中获得广泛应用，极大地简化了检验步骤，同时，也给试纸条制备者带来了一定的难度。

胶体金免疫层析试纸条有十几种原材料及辅助材料组成，要想达到临床要求需作大量的试验，根据我们多年的工作经验，现就胶体金免疫层析试验过程中必须注意的几个关键问题作以介绍。

1 胶体金颗粒大小的选择胶体金颗粒的大小与产品的灵敏度及特异性有关。

我们制备了如下胶体金液体各100ml，0.01％氯金酸水溶液中加入1％柠檬酸三钠的量分别为：①1.0ml；②1.5ml；③2.0ml；④2.5ml。

各取其50ml，调PH值为6.9进行抗HBsAg抗体标记,分别做灵敏度及特异性实验,结果见表1。

由表1可看出：胶体金颗粒越大，灵敏度越高，但特异性越差。

几种胶体金技术详解

胶体金免疫分析技术详解随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。

前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来.这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一.它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA.本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。

金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术,是于1971年建立的一种信号显示技术.此技术最初用于免疫电镜检查,由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。

此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。

近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用.胶体金是指金微小粒子（0—100nm)分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶,用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处,显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时,可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。

与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。

HIV抗体检测方法有哪些？

上海维斯塔生物科技有限公司HIV抗体检测方法有哪些？HIV抗体是常规使用的HIV病原学诊断的方法。

HIV抗体检测方法有初筛试验和确认试验组成。

初筛检测的方法有间接酶联免疫吸附试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）和金标法（SPOT），确认检测的方法为蛋白印迹试验（WB）。

酶联免疫吸附试验（ELISA）用缓冲去垢剂溶解HIV感染的细胞来提取病毒抗原，以梯度离心将抗原纯化后固定于微孔板上，然后同标本和对照物反应。

目前，国际上普遍采用的是第三代合成的HIV抗原，就是采用目前国际上最先进的第三代合成抗原包被板。

AIDS患者血清中的抗—HIV能与其抗原结合，清洗后加酶联抗人Ig，使其与抗—HIV结合，清洗后加入底物，产生有色反应即为阳性。

还需用Western蛋白印迹法(WB)，免疫荧光法(IFA)或放射免疫沉淀试验(RIPA)进行复证。

目前应用的ELISA法有8种之多。

它们的特异性和敏感性超过99%。

用该法普查正常人群约有0.6—2.7的阳性，因而在正常人群中的阳性结果约为97%为假阳性，对高危人群的检测，其假阳性可降至70%。

颗粒凝集法（PA）PA为快速、简便的一种筛选方法。

其基本原理是将HIV裂解产物或DNA重组的HIV多肽包被到明胶颗粒上，使成致敏颗粒，如被测血清中含有特异抗体，可因抗体的桥连作用使致敏颗粒发生凝集。

如属阳性，应经WB证实。

PA不需任何特殊仪器，其结果用肉眼可判别。

全过程仅需5分钟。

缺点有假阳性。

金标法（SPOT）金标法，又叫“胶体金法”，医学上的名字叫“斑点免疫金渗滤试验”，针对HIV 的检查还有个名字“间接免疫荧光试验（IFA）。

采用双抗原夹心法免疫测定原理，选择经纯化的基因工程制备的抗原，分别作为包被抗原和胶体金结合抗原。

当待检标本中含有HIV抗体时，先上海维斯塔生物科技有限公司和金标记抗原结合，由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成Ag-Ab-Ag-Au复合物富集在包被线上，形成红色沉淀线。

免疫学诊断技术

免疫学诊断技术 —酶标，金标简介
目录
术简介
一体外诊断试剂
1.1 定义
体外诊断（IVD，In Vitro Diagnosis）试剂，包括可单独使用或与仪器、器具、设备或系统组合使用，在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中，在人体之外通过对人体的样本（如血液、体液、组织等）进行检测而获取临床诊断信息的产品和服务，包括仪器、试剂、校准品、质控品等。原理是通过试剂和体内物质在体外的反应强度或速度来判断体内物质的性质和数量，通过和标准品的比较来判断人体的生理状态。
胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结合，形成胶体金标记物。
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。
AJQ3000:1ul/cm 划线精密度 BJQ3000:±1%
AJQ3000: ±2%
切条机
• 仪器参数: • 进料宽度：≤100 mm • 进料长度：不限,可连续进料切割 • 切割宽度：≥1 mm, 宽度连续可调 • 切割宽度设定位数：0.01 mm • 切割精度：±0.1 mm • 切割速度：230次/分钟, 速度连续可调 • 切条计数：单次工作和总工作分别计数 • 刀片: 日本进口, 耐磨高碳钢材料 • 抗静电装置：建议选配 • 电源：220VAC • 重量：20KG • 尺寸：430(L)×330(W)×260(H) mm
• 功能检测试剂：血凝试剂，看凝血状态是否正常，常用于手术前或治疗心肌梗塞，血栓等，凝血时间缩短常见于血栓性疾病：如心肌梗死、不稳定型心绞痛、脑血管病变、糖尿病伴血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成、妊娠高血压综合征和肾病综合征等；凝血时间延长见于先天性凝血因子缺乏：如各型血友病等。

免疫胶体金标技术

免疫胶体金标技术胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，这种金颗粒呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。

典型的测定方法为斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。

胶体金技术具有简便、快速等优点，目前已广泛应用于临床实验室诊断。

一、斑点免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay，DIFA）以双抗体夹心法检测尿液绒毛膜促性腺激素（HCG）为例。

预先在硝酸纤维素膜的中央滴加已知的纯化抗体，为膜所吸附。

当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中所含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等则滤出膜片。

其后加入的胶体金标记的抗体也在渗滤中与已结合在膜上的抗原结合。

因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央呈现红色斑点。

【材料】HCG金标反应板（已预先吸附已知抗HCG抗体）、抗HCG金标抗体、洗涤液、待测尿液等。

【方法】1．将反应板平放于实验台上，在小孔内滴加待测尿液1～2滴，待其完全渗入。

2．于小孔内滴加抗HCG金标抗体1～2滴，待其完全渗入。

3．在小孔内滴加2～3滴洗涤液，待其完全渗入。

4．判断结果。

【结果】在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示为阳性反应，反之为阴性反应。

斑点成色的深浅相应地提示阳性强度。

二、斑点免疫层析试验（dot immunochromatographic assay，DICA）斑点免疫层析试验简称免疫层析试验（ICA），它也以硝酸纤维膜为载体，将多个试剂组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为单一试剂条（如图4-3），试剂条上端（A）和下端（B）分别为粘贴吸水材料，金标抗体干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维膜条。

硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异性抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。

测定时将试纸下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条移动。

临床免疫学检验-第十一章固相膜免疫测定

DOT-ELISA优点
• 吸附蛋白能力强，微量抗原吸附完全，灵敏度高
• 试剂用量少 • 不需特殊设备 • 结果可长期保存。
DOT-ELISA局限性
• 仅为能定性实验 • 非特异性吸附 • BUBBLE FORMATION导致试剂不均结
果模糊
免疫印迹法
（immunoblottingtest，IBT）
第一节免疫金标记技术
• 金标记免疫分析技术是一种以抗原抗体特异性反应为基础,以金颗粒示踪的新的标记免疫技术.
胶体金及其制备
• 胶体金也称金溶胶,是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液.也称金溶胶。
枸橼酸三钠还原法制备金溶胶
• 加热0.01%氯金酸水溶液适量至沸腾，搅动下加入1%枸橼酸三钠水溶液适量，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后加蒸馏水至原体积即可。金溶胶的呈色与溶胶颗粒的大小密切相关，而金溶胶颗粒的直径与制备时加入的枸橼酸三钠量密切相关，改变枸橼酸三钠量可制得不同粒径和颜色的金溶胶。
临床免疫学检验第十一章
固相膜免疫分析技术
技术原理
• 固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金等。常用固相膜为硝酸纤维素（NC）膜。
技术分类
免疫渗滤试验：穿流形式免疫层析试验：横流形式
斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA）免疫印迹法 (Western blot)
: probed with Ab & then radiolabeled or enzyme-linked 2nd Ab.
FIGURE 6-12
: a position is visualized by means of an ELISA reaction.

儿童肺炎支原体四种血清学检测方法的比较

仪。于效期内按试剂盒说明书进行操作和判断结果。２４荧光定量ＰＲ法ＭＰ核酸扩增荧光检测试剂盒购自．Ｃ深圳市匹基生物工程股份有限公司，仪器：大和Ｌｎ— ｅｅ荧ｉＧｎｅ
光定量ＰＲ检测仪。样本处理：Ｃ取样本１０ｌ入１０ｌ０加０ＤＡ提取液，Ｎ振荡混匀。１０ｍ离心１ｉ，３００ｒｐ５ｒｎ吸弃上清液ａ（尽量不碰沉淀物）。加入５ｌＤＡ提取液２振荡混匀。０Ｎ，１００ ℃干浴１ｉ，３０ｍ离心１ｎ保留上清液备用。０ｒｎ１００ｒａｐ０ｍｉ，ＰＲ反应体系：ＰＣＣＭＰＲ反应液３．ｌａ５６＋Ｔｑ酶０４ｌＮ．＋ＵＧ００ｌ．６＋样品裂解物４ｌ。循环条件：７５ｒｎ９ ℃ １３ ℃ ｉ，４ａａ，５，０ｒｎ９ ℃ ５ｓ６ ℃ ４，０个循环，应体系设４ｌｉ０ｓ４反ｏ。每次试验均有阴性对照与阳性对照；按说明书操作；试剂有效期内使用。
为阳性，示感染。提
以气溶胶微粒的形式传播，感染后引起ＭＰ肺炎，每隔３ａ一５ａ出现一次地区性流行，占各类肺炎总数的１％一２％，００它不但可引起原发性非典型性肺炎，而且可引起全身器官的病变。
目前，实验室诊断方法主要依靠血清学。本文对３５例ｄＪ９ｘＬ肺炎患者进行了冷凝集、酶联免疫法与金标渗滤法查ＭＡ — ＰｂＩＭ、ｇ荧光定量ＰＲ法检测Ｍ — ＮＣＰＤＡ的检测比较，结果如下。

胶体金法的定义和分类

胶体金是一‎种常用的标‎记技术，是以胶体金‎作为示踪标‎志物应用于‎抗原抗体的‎一种新型的‎免疫标记技‎术，有其独特的‎优点。

近年已在各‎种生物学研‎究中广泛使‎用。

在临床使用‎的免疫印迹‎技术几乎都‎使用其标记‎。

同时在流式‎、电镜、免疫、分子生物学‎以至生物芯‎片中都可能‎例用到。

1971年‎F aulk‎和Tayt‎o r将胶体‎金引入免疫‎化学，此后免疫胶‎体金技术作‎为一种新的‎免疫学方法‎，在生物医学‎各领域得到‎了日益广泛‎的应用。

目前在医学‎检验中的应‎用主要是免‎疫层析法(immun‎o chro‎m atog‎r a-phy)和快速免疫‎金渗滤法(Dot-immuo‎g old filtr‎a tion‎assay‎DIGFA‎)，用于检测 HBsAg‎、HCG 和抗双链Ｄ‎ＮＡ抗体等‎，具有简单、快速、准确和无污‎染等优点。

免疫胶体金‎技术的基本‎原理：胶体金是由‎氯金酸(HAuCl‎4)在还原剂如‎白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用‎下，可聚合成一‎定大小的金‎颗粒，并由于静电‎作用成为一‎种稳定的胶‎体状态，形成带负电‎的疏水胶溶‎液，由于静电作‎用而成为稳‎定的胶体状‎态，故称胶体金‎。

胶体金在弱‎碱环境下带‎负电荷，可与蛋白质‎分子的正电‎荷基团形成‎牢固的结合‎，由于这种结‎合是静电结‎合，所以不影响‎蛋白质的生‎物特性。

胶体金除了‎与蛋白质结‎合以外，还可以与许‎多其它生物‎大分子结合‎，如SPA、PHA、ConA 等‎。

根据胶体金‎的一些物理‎性状，如高电子密‎度、颗粒大小、形状及颜色‎反应，加上结合物‎的免疫和生‎物学特性，因而使胶体‎金广泛地应‎用于免疫学‎、组织学、病理学和细‎胞生物学等‎领域。

胶体金标记‎，实质上是蛋‎白质等高分‎子被吸附到‎胶体金颗粒‎表面的包被‎过程。

吸附机理可‎能是胶体金‎颗粒表面负‎电荷，与蛋白质的‎正电荷基团‎因静电吸附‎而形成牢固‎结合。

胶体金标记技术

胶体金标记技术胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反映的一种新型免疫标记技术。

由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还能够作双重乃最多重标记，使定位加倍精准。

因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术以后的一种新型标记技术。

现已普遍应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。

用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。

1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。

近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。

由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。

近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。

尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。

从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。

制备方式在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界限十分清楚。

金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中维持稳固状态，形成稳固的胶体，因此称其为胶体金。

胶体金的制作方式有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。

通过改变反映体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可取得所需不同直径的金颗粒。

但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。

1．Frens标准方法：1)取%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液。

2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色，3)继续煮沸约5分钟后结束反应。

4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。

5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。