非洲爪蟾相关问题及解答

非洲爪蟾相关问题及解答
一、非洲爪蟾（Xenopus laevis）作为模式生物的优势与缺陷
从20世纪50年代以来，非洲爪蟾已经成为胚胎学、发育生物学、细胞生物学、功能基因组学等研究的重要模式生物（Caroline W Beck, Slack J M. An amphibian with ambition: A new role for Xenopus in the 21st century. Genome Biology, 2001, 2: 1029-1029）。

爪蟾作为模式生物，适合建立多种人类疾病模型进行疾病发病机制和治疗等相关研究"还可以结合生物信息学分析进行高通量药物筛选及药物开发等研究"另外在发育生物学和基因功能研究方面也发挥重要作用（来松涛，于全，邓洪新等. 模式生物—爪蟾在生物医学上的应用[J]. 自然科学进展. 第16第9期2006年9月. ）
爪蟾成为重要的模式生物主要有如下优点：
（1）爪蟾是脊椎动物，比果蝇、线虫等更适合于作为人类疾病的模式生物开展研究；
（2）产卵量很大，体外受精，胚胎体外分化很快，整个器官发育过程都可以体外观察；
（3）卵较大，适合显微操作和胚层分割移植；
（4）利用Morhpolino oligonucleotide（MO）微注射技术可以特异性抑制特定基因的表达；
（5）养殖本低，通过注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）可以一年四季产卵，适合于大量繁殖；（6）许多重要基因与人类之间有同源性，如骨形成蛋白（BMP）这为人类基因功能研究奠定了坚实的基础（Brown D D. A tribute to the Xenopus laevis oocyte and egg. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(44): 45291-45299）。

非洲爪蟾作为模式生物存在的缺陷：
难以进行遗传学研究，主要由于其生命周期过长，从受精发育至成熟具有升值能力的成蛙需要一年时间。

同时非洲爪蟾是异源四倍体，多数基因都存在四个拷贝，很难进行遗传突变试验。

（毛炳宇. 非洲爪蟾：模式生物里的青蛙王子. 生命世界，60-63）
二、热带爪蟾（Xenopus tropicalis）—爪蟾模式生物的另一选择
由于非洲爪蟾作为模式生物存在着一些
缺陷。

而非洲爪蟾的近缘品种—热带爪蟾，其
外型与非洲爪蟾类似，但体型却只有一半，且
发育周期只需半年。

具备非洲爪蟾作为模式生
物的优势。

最重要的是，其基因特性与其它的
模式动物一样为双倍体(diploid)。

而新的研究
报告也证明几乎所有使用在非洲爪蟾的研究
技术，包括原位杂交、一次抗体、核酸探针等，都可轻易的应用于热带爪蟾。

并且热带爪蟾完整的基因组已经测序完成，有利于扩充应用其在功能性基因组的研究。

非洲爪蟾和热带爪蟾的生物特性比较见表1（来松涛，于全，邓洪新等. 模式生物—爪蟾在生物医学上的应用[J]. 自然科学进展. 第16第9期2006年9月.）。

三、非洲爪蟾的发育图谱
四、爪蟾蛙卵结构与消化优劣区分
右图所示为爪蟾蛙卵的结构图。

蛙卵由外向内分别为内层卵
巢上皮细胞（Inner ovarian epithelium）、外壁细胞（theca cell）、
卵泡细胞（follicle cell）、卵膜（vitelline envelope）、蛙卵细胞膜
（oocyte plasma membrane）、蛙卵原生质。

而蛙卵又被均分为两
个部分，一半为动物极（animal pole），一半为植物极（vegetal pole）。

动物极中包括细胞核。

手术采集的蛙卵用胶原酶消化后，选取良好的蛙卵。

良好的
蛙卵通常体积较大，深棕色动物极，黄白色的植物极。

在动物极
端没有白色的斑块，在植物极端没有深色的斑块。

消化后蛙卵外
层没有破损。

五、蛙卵的动物极与植物极
动物卵细胞富含原生质的一端。

动物的卵多呈球形，由于卵内所含细胞质、细胞器、核糖体、卵黄、色素粒及糖原颗粒等物质的不均匀分布而表现出极性，分为动物极和植物极。

营养物质较少、卵
极相对的一端含有较多的卵黄颗粒或卵黄小板，卵裂速度较慢
的一极称为植物极。

由于卵黄相较其他细胞成分的比重大，植
物极总是向下。

从动物极到植物极的中轴线称为卵轴，卵内各
种物质往往沿卵轴形成梯度分布。

动物极与植物极的区分主要表现在形成原肠胚的方法，动
物极形成外胚层，植物极形成内胚层。

一般的三种方式：
1、内陷：囊胚期植物极细胞向内陷入，形成两层细胞。

外层的
为外胚层，内陷的一层为内胚层，内胚层包围的腔为原肠腔，
原肠腔与外界相通的孔为胚孔，中胚层由胚孔向内卷入，介入
内外胚层间。

2、内移：囊胚一部分细胞移入内部形成内胚层。

3、外包：动物极细胞分裂快，植物极细胞卵黄多，分裂慢，其结果是动物极细胞逐渐向下包围植物极，形成外胚层，被包围的植物极成为内胚层。

六、胶原酶对蛙卵外层膜的消化
胶原是胞外基质最基本的成分之一，是胞外基质中最主要的水不溶性纤维蛋白，也是动物体内含量最丰富的蛋白。

胶原蛋白首先在糙面内质网结合的核糖体上起始合成前链，并在内质网切除信号肽，通过内质网和高尔基体的加工、修饰和组装，形成三股螺旋的前胶原并分泌到胞外，形成原胶原，最后组装成胶原原纤维和胶原纤维。

（翟中和，王喜忠，丁明孝. 细胞生物学[M]，第三版，北京，2007，524-527）
胶原在细胞外基质中含量最高，刚性及抗张力强度最大，构成细胞外基质的骨架结构，细胞外基质中的其他组分通过与胶原结合形成结构与功能的复合体。

而胶原可被胶原酶特异降解。

故可利用胶原酶消化非洲爪蟾蛙卵外层包膜。

使用胶原酶消化非洲爪蟾蛙卵实际上即将蛙卵外层的内层卵巢上皮细胞（Inner ovarian epithelium）、外壁细胞（theca cell）和卵泡细胞（follicle cell）。

消化完全后良好的蛙卵包括卵膜（vitelline envelope）、蛙卵细胞膜（oocyte plasma membrane）及被它们包裹的蛙卵原生质部分。

七、卵母细胞表达系统
两栖类动物的卵母细胞是生理学中常用的基因表达系统（Koltchine VV, Anantharam V, Bayley H.
Alternative splic ing of the NMDARI subunit affeits modulation by calcium [J]. Moleculer Brain Res, 1996,
39( 1- 2) : 99~ 108）。

自Gurdon（Gurdon JB, Lane CD, Wood HR et al. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells[J]. Nature, 1971, 233: 177~ 182）首先在非洲爪蟾(Xenopus Laevis) 的卵母细胞表达了珠蛋白的基因后，这一方法在神经生物学已得到广泛应用。

卵母细胞能有效地表达外源性mRNA编码的受体蛋白，进一步将蛋白前体分子加工为成熟蛋白，并最终以正确的方向组装在卵母细胞表面，形成有功能的受体蛋白，与源组织的天然受体具有相同的生理生化特性（Dumont JW. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin), Stage of oocyte development in laboratory maintained animals [J]. J Morphol, 1972, 136: 153~ 180）。

利用这种方式, 可以成功地将神经系统中难以用普通电生理方法研究的受体和离子通道分子从胞体较小而且突触前后相互作用十分复杂的神经元移植到体积较大、情况较为简单、易培养的卵母细胞中，使之成为“卵里的突触”（陈宜张. 分子神经生物学[M]. 北京: 人民军医出版社, 1995. 115）。

八、人绒毛膜促性腺激素（hCG）对爪蟾产卵的影响
非洲爪蟾通过注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）可以一年四季产卵。

人绒毛膜促性腺激素由人类胎盘绒毛膜的合胞体滋养层细胞合成和分泌。

人绒毛膜促性腺激素是一种糖蛋白激素，由亚基和
亚基组成。

亚基在人绒毛膜促性腺激素与受体结合中起重要作用，但和亚基形成完整的人绒毛膜促性腺激素分子是其与受体专一性结合的重要前提。

亚基决定激素的特异性。

人绒毛膜促性腺激素的生物学作用与促黄体素（LH）相似。

在孕妇体内，其主要功能可能是维持妊娠黄体。

而用人绒毛膜促性腺激素处理动物时，它可以促进卵泡成熟和排卵并形成黄体。

促卵泡素（FSH）通常用于动物的超数排卵。

此外，在诱发排卵、卵泡发育停滞和持久黄体等方面也有应用。

促黄体素常用于诱导排卵，治疗黄体发育不全和卵巢囊肿等。

一般先用孕马血清促性腺激素（PMSG）或促卵泡素促进卵泡发育，然后注射促黄体素（LH）或人绒毛膜促性腺激素（hCG）促进排卵。

九、胚胎分割（embryo splitting）
胚胎分割（embryo splitting）即采用机械方法用特制的显微刀片或玻璃微针将早期胚胎分割为2等分、4等分、8等分，从而获得同卵双生、四生或八生的一项技术。

由于来自同一枚胚胎的分割胚发育成的个体具有相同的遗传物质。

其理论依据是早期胚胎的卵裂球具有全能性，每个卵裂球都有独立发育成一个新个体的潜力。

在实验生物学或医学中，利用胚胎分割技术产生的后代作为试验材料，可消除遗传差异，提高实验结果的准确性。

胚胎分割存在的问题：
1、出生重低。

在牛胚胎分割移植试验中发现，有些发育到囊胚阶段的分割胚与正常胚胎相比，细胞数明显减少，移植后代的体重也相应降低。

这可能与早期胚胎细胞的分化和定位有关，但具体发育机制还有待研究。

2、遗传一致性问题。

来自同一胚胎分割胚的后代，理论上遗传性状应该完全一致，但事实并非如此。

这可能与胚胎细胞的分化有密切关系。

3、异常与畸形。

4、同卵多胎的局限性。

从目前的研究结果看，由一枚胚胎通过胚胎分割技术获得的后代数量有限。

分割胚的正常发育能力存在一定的局限性。

十、细胞核移植（nuclear transfer，nuclear transplantation）
细胞核移植是通过显微操作的方
法，将供体细胞的细胞核放入预先去核
的卵母细胞或早期合子内，形成一个新
的核质重组胚，移入的核在受体胞质中
的作用下，发生发育程序重编程
（reprogramming），使得核质重组胚与
正常受精卵一样，经细胞分裂、分化并
在母体内发育成一个新的个体。

依据供
体细胞来源不同，细胞核移植分为胚胎
细胞核移植、胚胎干细胞核移植、体细胞核移植（周欢敏. 动物细胞工程学[M]. 北京：中国农业出版社，2009. 336）。

克隆动物最早是在非洲爪蟾中获得成功的。

1962年英国牛津大学的生物学家戈登利用非洲爪蟾进行了一系列核移植试验，当时的主要目的是研究不同发育时期胚胎细胞核的发育能力。

他先用紫外线照射爪蟾卵细胞，破坏其细胞核，然后取爪蟾蝌蚪的肠上皮细胞、肝细胞、肾细胞等的细胞核，植入上述处理过的卵细胞内，其中一小部分卵会开始分裂并可发育到一定时期。

利用爪蟾蝌蚪的肠上皮细胞作为核供体，通过连续核移植的方法，戈登成功获得少量蝌蚪，其中有几只成功发育成爪蟾（毛炳宇. 非洲爪蟾：模式生物里的青蛙王子. 生命世界，60-63）。