实验一 爪蟾人工繁殖、受精和胚胎发育

实验二爪蟾人工繁殖、受精和胚胎发育

一、实验目的：了解爪蟾的生活和繁殖习性，掌握爪蟾人工繁殖技术；通过对爪蟾从受精卵经卵裂、囊胚、原肠胚到神经胚的系列发育过程的观察，了解其胚胎早期发育过程和形态模式形成的特征。

二、爪蟾的生活和繁殖习性

非洲爪蟾（Xenopus laevis）原产非洲南部的一种水生蛙类，又名光滑爪蟾，属于两栖纲（Amphibia）、无尾目（Anura）、负子蟾科（Pipidae）、爪蟾属（Xenopus）。其头部及身体扁平，没有外耳或舌头，其后脚上3趾有短爪。雌性成蛙体长9-14cm，在身体尾端的泄殖腔上方有分列左右的两瓣膜。雄性成蛙体长7-11cm，性成熟的雄蛙前肢有黑色婚垫，便于交配，泄殖腔上方无瓣膜。

图2-1 非洲爪蟾和热带爪蟾成体形态

非洲爪蟾产卵量很大，为多次产卵类型的蛙类。在25℃养殖条件下可以不受季节限制而常年产卵。其卵子和胚胎体积较大，便于进行实验胚胎学操作，如显微注射、胚胎切割和移植等。受精后胚胎发育很快，在24℃下受精后2天左右就可以孵化成可以游动的蝌蚪。非洲爪蟾蝌蚪在早期是透明的，能够看清楚它内部的结构。因此，非洲爪蟾长期以来被作为实验胚胎学和脊椎动物胚胎形体模式形成的模式动物。但由于其基因组是在进化上二倍体化了的四倍体，多数基因存在四个拷贝，很难进行遗传突变实验。因此，近年来非洲爪蟾的近亲——二倍体的热带爪蟾Xenopus tropicalis被引入发育生物学的研究中。热带爪蟾其外型与非洲爪蟾类似，但体型较小（图2-1）。几乎所有使用在非洲爪蟾的研

究技术都可在热带爪蟾上应用，而且热带爪蟾的基因组测序计划已在2010年基本完成。因此，热带爪蟾成为了功能基因组学和发育生物学研究的优良的实验动物模型。

三、实验器材和材料

爪蟾养殖系统，小型塑料整理箱（直径约58cm）两个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管，0.5ml (U-40)注射器、绒毛膜促性腺激素（HCG），曝气水10L，琼脂糖，0.1×MMR, 半胱氨酸(L-Cysteine Free Base),性成熟雌、雄性热带爪蟾。

四、实验内容和程序

1、爪蟾的选取：在实验前一天的晚上，用小型塑料盆盛1/3的干净曝气水，调节水温至25℃（尤其是冬天时，水温较低，一定要注意水的温度，以防止爪蟾在冷水里不适应出现休克等现象）为催产用。然后挑选用于进行催产的性成熟雌蛙和雄蛙。雌、雄蛙按照上述性别特征进行鉴别：个体较大、腹部大，泄殖腔上方有瓣膜，前爪没有明显黑色线的为雌蛙；个体较小、泄殖腔上方无瓣膜，前爪内侧有明显的黑色线条为性成熟的雄蛙。

2、爪蟾的预处理：用酒精消过毒的U-40注射器吸取配好的HCG溶液，按照预处理注射的HCG含量（20国际单位），从爪蟾后端背部注射到皮下。将处理好的雌蛙和雄蛙分别放入准备好的水盆中后置于25℃培养箱中，培养过夜。

3、爪蟾的催产：取出预处理雌蛙和雄蛙，雌蛙注射200国际单位的HCG、雄蛙注射150单位单位，将注射好的雌雄蛙放于同一塑料盆中，避光置于25°恒温培养箱中，等待爪蟾抱对产卵。

4、抱对产卵：在注射HCG 2-3h 之后，雄雌蛙会抱对产卵。在此过程中，不要惊扰抱对的雄雌蛙，待产卵结束后，将爪蟾转移到另一塑料盆，用胶头滴管受精卵吸出。

5、胶膜去除和胚胎观察：将受精卵放入2%半胱氨酸，0.1×MMR（PH=8.0，溶液配制见本节附录）溶液中，在玻璃烧杯中轻轻旋转，约5分钟后，胶膜脱离，再用0.1×MMR漂洗3-5次，然后将卵放入有1%琼脂糖（0.1×MMR）铺底的装有0.1×MMR培养皿中，于25℃进行胚胎培养。随时观察和记录受精卵的变化和胚胎发育的变化过程和时序。

五、热带爪蟾胚胎发育的观察的基本内容和作业

爪蟾的卵属于中黄卵(mesolecithal egg),进行辐射式的完全卵裂。通过观察爪蟾从受精卵发育成具有自主生活能力的个体的过程，解蛙卵受精后的变化过程、形态模式形成的特点和过程。具体内容包括观察、作图并记录下述发育过程和时序：

1、受精卵的变化和卵裂的特点；

2、多细胞胚胎——囊胚的形成；

3、原肠形态发生运动过程中细胞运动的方式和特点，形成的原肠胚特点及各胚层的分布；

4、神经胚时期的特点及神经板，神经管的形成；

5、器官发生——脑部、眼睛、耳朵、骨骼、肌肉、消化系统、循环系统等主要

器官的形成。

附录一：爪蟾生活史（引自Lewis Wolpert等，2001）

附录二：爪蟾胚胎发育图谱和时序（引自Nieuwkoop and Faber，1994）

参考文献：

1. Lewis Wolpert et al., Principles of Development. OUP Oxford; 2 edition (13 Dec 2001), ISBN-10: 0198792913 ISBN-13: 978-0198792918.

2. Nieuwkoop and Faber (1994). Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Garland Publishing Inc, New York ISBN 0-8153-1896-0.

附录三：试剂配方

1、10X MMR溶液:

1 M NaCl

20 mM KCl;

10 mM MgCl2;

20 mM CaCl2;

50 mM HEPES, pH 7.5。

高温高压灭菌后放于室温。

2、2% Cysteine溶液：

L-Cysteine 2g

0.1X MMR 100ml

用NaOH调PH至8.0，用时新鲜配制。