第七章——花药和花粉组织培养

预处理方法：
• 1.高低温处理 • 低温预处理：指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时
间后再接种。 • 应用较多。处理温度一般在1-14℃，时间从几小时至几十天不
等；不同作物所用的预处理温度及时间差异较大；不同的处理 温度需要不同的时间。
• 例子: • 小麦穗子培养前4℃预处理几天，花药培养效率显著提高。 • 十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-
小孢子分裂数次形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成花粉植株。此途 径产生的植株会出现变异且倍性复杂。
三、花粉植株形态发生方式
• 体细胞胚：植物组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为 与合子发育成的胚（具胚根、胚芽、胚轴等结构）非常相似的 结构，称作体细胞胚或胚状体。
• 花粉胚：植物组织培养过程中，某些单倍体性细胞在形态上转 变为与合子发育成的胚非常相似的结构，称作花粉胚或胚状体。
第七章 花药和花粉培养
植物花药和花粉培养的概念
• 花药：植物花的雄性器官，包括二倍性的组织和单倍性的雄性 性细胞。药壁和药隔组织 （2n）；花粉粒 （n）。
植物花药和花粉培养的概念
• 花粉：由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞。
花粉粒的形成
花药和花粉培养
• 花药和花粉培养指在合成培养基上，改变花粉的正常发育途径， 使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育 成完整植株。
移栽驯化
• 同组培快繁。
白化苗现象
白化苗产生的原因及机理
1.白化苗产生的原因： 内因：供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。 外因：预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组 织转分化时间等。 2.白化苗产生的机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外，无性系变异也 可能是原因之一。
胚状体发育途径举例：烟草
胚状体发育途径举例：烟草
芸苔属小孢子培养胚状体发育途径
胚状体发育途径举例：水稻
胚状体发育途径举例：水稻
花药和花粉培养方法
一、花药培养 1. 取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。 2. 消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸钠 溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，无 菌水冲洗3-5次。
不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。 在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高。 在番茄花药培养中需要量高达14％。 其原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故，即高浓度 的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。 较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织； 较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。
• （二）物种进化研究 可探索亲本染色体组的构成。 分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确 定染色体组内是否存在同源染色体。
花药和花粉培养的应用
（三）遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能
用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。 （四）构建连锁图谱
雄核发育启动机理
1. 雄核发育与P花粉的形成 胚性花粉粒特点： 核位于花粉粒中心； 醋酸洋红压片观察，花粉粒着色较浅； 有液泡和2个清晰着色的核。 P-花粉或E-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花 粉）或不染色花粉（NS-花粉）。
雄核发育启动机理
• 2. 雄核发育与饥饿处理 • 对花粉进行短期的饥饿处理，再供给发育所需营养，对花粉胚
单倍体植株鉴定
1、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。
2、间接鉴定 （1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少 到1cm2。 （2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数 目与倍性具有高度的相关性。
植物花药/花粉培养历史
• 80年代后期到90年代期间，花粉组培技术迅速发展。许多作 物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。
• 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养也相续成功 Konzak (1999) 。
花粉小孢子发育途径
花粉孢子体发育途径（雄核发育）： 胚性能力的获得→细胞分裂的诱导→胚状体的形成
双单倍体群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。 （五）用于遗传转化
能直接表达外源基因，不受显隐性影响。
植物花药/花粉培养历史
• Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养 • Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养）
Chu（1973）小麦花粉培养 （早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体， 能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）
（3）A-VG途径（E途径） 花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各 群的子细胞都类似其母细胞。 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成非单倍体植株。在获得 的花粉植株群体中，有二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等 非单倍体植株。
花粉小孢子发育途径
• （5）B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小 相近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株， 或者核融合形成多倍体植株
花药和花粉培养方法
• 3. 培养 • 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分
裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）； 后转入分化培养基培养，形成小植株。
花药和花粉培养方法
二，花粉的培养 (一)花粉的分离与纯化 1.自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集 培养。 2.挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。
胎发生是非常重要的。 • 饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。其
机制可能是使本来停止在G1期的营养核重新启动，开始DNA 的复制和进一步发育。
花粉植株形态发生方式
花粉植株的形态发生途径： （一）胚状体发育途径（直接发育途径）
小孢子经历合子胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 （二）愈伤组织发育途径（间接发育途径）
9℃处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产 量降为10.47个。
• 高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下 （30-35℃）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。
• 如烟草，32℃高温；小麦，33℃高温预处理显著地提高了小 孢子胚胎发生能力。
预处理方法：
2.化学物质处理 包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。 甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子 营养饥饿，从而使小孢子去分化。 3.其它 包括γ射线、离心、磁场等
3、激素 细胞分裂素可促进胚状体形成； 生长素可诱导愈伤组织形成； 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。
4、种间有差异，培养温度在25～28℃左右 2、光照 光暗交替培养，每天12～18h的光照，光照强度2000～10000lx。 3、植板密度
花粉小孢子发育途径
• 一、活体小孢子发育途径 • 花粉发育时期对诱导雄核发育极其重要。 • 花粉母细胞（PMC）减数分裂形成四分体，释放4个小孢子。
小孢子第一次分裂为不均等分裂形成营养核和生殖核；第二次 有丝分裂仅限于生殖核，形成两个精子。
花粉小孢子发育途径
二、离体小孢子发育途径 （一）雄核发育途径 最适宜诱导的时期是第一次有丝分裂或之前。 1. A途径-小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞 和生殖细胞
（四）预处理
• 预处理是小孢子培养成功的前提条件。 • 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子
从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜 力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。 • 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、 高温、化学物质、离心、射线等。
花药和花粉培养方法
(二)花粉培养方式 1.平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 2.液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3.双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养 基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。
4.看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 5.微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。 6.条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。 花药条件培养基、子房条件培养等。
花粉小孢子发育途径
（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成多细胞花粉（或多核花粉）；生殖细胞以 游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一至数次存在于多核花 粉的一侧，有的甚至到球形胚形成时仍存在。 （2）A-G途径 生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞不分裂或者仅分裂数 次形成胚柄结构。
花粉小孢子发育途径
• 一）作物育种 • 1，缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养
仅需一年。
花药和花粉培养的应用
• 2. 提高了目标基因型的选择效率
花药和花粉培养的应用
• 3.诱变育种中的作用 • 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变
个体，加倍后成为稳定的纯系。
花药和花粉培养的应用
5，花药花粉培养基
1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基。 如H培养基（适于烟草）、C17培养基（适于小麦）、马铃署-Ⅱ培 养基（适于马铃署）。 高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。 铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育。
2.碳源 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。 不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双 子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖 为最好的碳源。
植板密度与花培效率有很大的相关性。5×103到2×104／ml密度均能 有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小 孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。
7，花药壁因素
• 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但 花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。
（三）花粉发育时期
• 一般而言，单核期（第一次有丝 分裂前）对诱导反应最敏感，为 最佳培养期。
• 形成双核后，在合适的条件，主 要由营养细胞分裂产生胚状体。
花粉发育时期的确定
• 对不同发育阶段的花药进行培养 测试
• 确定最佳小孢子发育时期的形态 特征
• 注意形态特征会因品种、发育状 态、环境条件的变化而发生变化
• 该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。
花粉和花药培养的异同点：
共同点
• 培养目的相同： • 均获得单倍体植株
不同点
• 花药培养属于器官培养；而花粉 培养属于细胞培养。
• 花粉培养没有药壁组织干扰；可 计数小孢子产胚率；可观察雄核 发育的全过程；单倍体产量高， 但技术更复杂。
花药和花粉培养的应用
花药和花粉培养方法
二，花粉的培养 (一)花粉的分离与纯化 3.机械游离 （1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来； （2）超速旋切法 （此法应用最广） 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来。 4. 小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢
影响雄核发育和花粉花药培养的因素
（一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物
种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。 如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。
（二）供体植株生长条件和生理状态
1.植株生长条件 光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较 好，但物种间存在差异。 2.植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。 3.P花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量 。