py第五章 植物花药和花粉培养

•单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使 花粉发育成一个完整的植株。
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2、花粉和花药培意义
诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育 种周期； 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。 获得无病毒个体。
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•我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进， 研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大 幅度提高。N6培养基的特点是铵离子浓度较低。 •随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物 素，研制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦 的花药出愈率。 •马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广 泛地应用于小麦花药培养，效果良好。
剥去旗鞘， 取出稻穗
10％漂白粉10 min， 无菌水洗一次。
70％酒精 手洗两遍
用接种环接种 到培养基上
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培养5天后，花药变黑褐色，20天花 药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织， 先形成芽，后长出根，形成幼苗。
选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝 的花蕾发育良好，数量大，发育同步。
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大大缩短育种周期
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5、花药培养技术
确定取材时间
选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期 和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此 利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确 定花粉发育的准确时期。
单倍体植株的二倍化
花粉植株染色体可自发加倍；人工措施染色
体加倍。 传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋 水仙素溶液处理单倍体植株，时间为24-96 h。
浸泡试管苗方法、处理芽方法、浸根方法
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花药培养脱毒
•1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； •花药采取时期 单核期：花蕾4-6mm，花药1mm •花药诱导愈伤组织培养基 MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L •增殖培养基 MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L •生根培养基 1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L
各种植物要求预处理的温度和时间不同。
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培养温度是影响花药反应的一个重要因素。
小麦要求先高温培养64天之后，再转入28-30℃ 下培养。一直高温培养效果并不好。
较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织， 但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培养 温度仍是减少白化苗的一个有效措施。
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作业：
• 1、试论述花药培养的意义。
• 2、详细论述花药培养方法。
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6、影响花药诱导频率的因素
1） 花粉发育时期是影响培养效果的重要因素。
在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径 发育成花粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育 时期不同，对多数植物来说，单核中期或晚期的花 粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。
如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次 有丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大 麦)或单核中期(玉米、小麦)反应最好，番茄在减数 分裂中期时更适宜。
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2）花药供体植株的生长条件对花药培养反 应的影响是很大的。
水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗 比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提 高。同步化程度高。
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3） 培养基是花粉启动和再分化的重要条件
3、花药培养发展简史
1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成 胚； 1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；
1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株； 目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导 成植株。
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花粉培养过程
低温预处理
消毒
取下花蕾（镜检） 选幼年树花蕾 接种
取花药
预培养数天
分离 花粉 过滤离心 再生
药壁向花粉提供营养物质； 通过药壁吸收、贮存和转化 培养基中的外源物质
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① 培养基中的植物生长物质种类会影响花粉 发育的途径 • 一般在禾本科植物中，常用1-5mg/L 2,4-D或 NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转 移至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物 质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植 株形成。
第五章 植物花药和花粉培养
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• 本章内容提要：
一、概念 二、花粉和花药培养技术 三、花粉和花药培养应用
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1、概念
•单倍体细胞(haploid cell)：植物的花粉是花粉母细 胞经减数分裂形成的，其染色体数只有体细胞的一半。 •花粉和花药的培养(pollen and anther culture)： 指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精 而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技 术。
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② 糖种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响。
• 朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以 0.21 mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖， 小麦花粉胚的诱导频率可增加2-10倍。 • 一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对 花粉的生长无妨碍。 • 烟草的最适蔗糖浓度为3％，水稻为3％-6％，玉米 则为12％-15％。
4.花药培养与单倍体育种
花药培养的主要目的：
• 培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为 育种材料的来源。
• 利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基 因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出 有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者 直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。 • 构建永久性分离群体－双单倍体系（Doubled haploid)，用于基因定位。
③ 在培养基中加入活性炭能促进花药培养
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4） 低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率
以1-5℃预低温处理小麦幼穗，能提高花粉 愈伤组织的产量。在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预 处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温 对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。
操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤， 则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二 倍体的愈伤组织。
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花药培养的条件： 光照(12~18h，5,000~10,000 lx，28℃)
黑暗(12-16h，22℃)周期交替进行。
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在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较 为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm，颖片 淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。
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水稻花药培养操作过程
Baidu Nhomakorabea旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍
左手持穗，右 手用镊子取出 花药，无菌培 养皿中
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7、 图示花药培养过程
花药材料的选取
关键选取处于合适发育期的花 药，离体培养后才能启动花粉发育。 实践表明，从减数分裂期至双核期 的花药，均有可能诱导离体孤雄发 育。 大多数园艺植物的花药培养，成 功率最高的时期为单核期，或单核 中晚期。