py第五章 植物花药和花粉培养
A细胞工程第4节—植物花粉和花药培养2 共79页PPT资料
例子：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb
的纯合单株
常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、 aAbb区分开。
AB
AB AABB aB aABB Ab AabB ab aAbB
aB
Ab
ab
AaBB aaBB AabB aabB
AABb aABb AAbb aAbb
一、花粉发育的阶段
花粉离体培养时，雄核发 育最适宜的时期一般是第 一次有分裂或之前。
二、雄核发育途径
1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂，形成营养 细胞和生殖细胞
（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独 立分裂，共同形成单倍体 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍 体植株
植物组织培养
第五章 花药和花粉培养
大 家 好 ！
第5章 花药和花粉培养
第五章 花药和花粉培养
本章主要内容：
花粉和花药培养的概念和应用 花粉小孢子发育途径 花粉和花药培养方法 单倍体植株鉴定和染色体加倍
第一节 花粉和花药培养的概念和应用
花粉和花药培养的概念 花药和花粉培养的历史 花粉和花药培养的应用
第5章 花药和花粉培养
一、概念
花粉和花药的培养(pollen and anther culture)
是指在人工合成培养基上，改变花粉的发育途径, 使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂\分化， 由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。
单倍体植物(haplobiont) 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的
花药和花粉培养课件
数据整理、统计、分析、解释
处理方法
数据清洗、数据挖掘、可视化呈现
06 相关法律法规与伦理问题
法律法规要求与遵守
法律法规要求
在进行花药和花粉培养实验时，必须遵 守国家和地方的相关法律法规，确保实 验活动的合法性。
VS
遵守要求
遵守实验室安全规定，确保实验操作符合 相关法规要求，避免任何违反法律法规的 行为。
气体控制 控制培养环境中的气体成分，如CO2浓度等，以 优化生长条件。
培养过程中的注意事项
防止污染
严格控制无菌条件，定期检查培 养基和培养环境是否有微生物污染。
观察与记录
定期观察花药和花粉的生长情况， 记录生长数据，以便及时调整培养 条件。
花药和花粉的保存
对于需要长期保存的花药和花粉， 应选择适宜的保存方法和条件。
应用领域拓展
花药和花粉培养技术的应用范围将进一步 拓展，不仅局限于育种领域，还可应用于
生物制药、生物能源等领域。
遗传稳定性研究
将深入研究遗传稳定性问题，寻求解决染 色体变异的有效方法，获得遗传一致的纯 种。
政策支持
随着科技的不断进步和社会对生物技术的 关注度提高，政府将出台更多政策支持花 药和花粉培养技术的发展和应用。
基因工程研究
花药和花粉培养产生的单倍体植株可用于基因工程研究，如 基因敲除、基因沉默等，以深入了解基因功能和植物生长发 育机制。
药物筛选
利用花药和花粉培养技术产生的单倍体细胞系可用于药物筛 选，如抗病、抗虫、抗除草剂等，为新药研发提供有力支持。
实际应用案例分析
水稻育种
通过花药和花粉培养技术，成功获得了大量单倍体植株，经过筛选得到了抗病、 抗虫、高产等优良性状的水稻新品种，为我国水稻生产提供了有力支持。
花药和花粉培养课件
如何选择适宜的植物材料进行花药和花粉培养？
答：选择适宜的植物材料是进行花药和花粉培养的关键，通常选择处 于适宜发育阶段的花蕾，以保证花药和花粉的质量和活性。
如何对植物材料进行预处理？
答：预处理包括对植物材料的低温、干燥、激素处理等，以促进花药 和花粉的萌发。
应用问题及解答
花药和花粉培养在育种中的应用有哪 些？
。
04
实验结果与分析
根据观察和记录的数据，分析 花药和花粉在培养基上的生长
情况。
比较不同植物的花药和花粉在 相同培养基上的生长表现，分
析其适应性。
根据实验结果，评估花药和花 粉培养在植物繁殖和育种中的 应用价值。
结合实验结果，提出改进和完 善花药和花粉培养技术的建议 。
06
问题与解答
常见问题及解答
调整培养基的pH值和渗透压，以 维持花药和花粉的正常生理状态 。
花药和花粉的采集与处理
采集时间
选择适宜的采集时间，以保证花药和花粉的活 力。
采集部位
选择健康的花朵，并确保采集的花药和花粉无 病虫害。
花药和花粉的分离与处理
将花药和花粉从花朵上分离下来，并进行适当的消毒处理。
培养方法与条件
培养方法
根据具体情况选择合适的培养方法，如单倍体育 种、基因转移等。
环境因素影响
温度、湿度、光照等因素可能影响 培养效果。
04
未来的发展方向
优化培养条件
通过研究，不断优化花药和花粉培养的条件 ，提高成功率。
基因编辑技术的应用
利用基因编辑技术，定向改造花药和花粉的 遗传性状。
高通量分析方法
开发高通量分析方法，实现大规模的花药和 花粉培养。
拓展应用领域
第5章花药和花粉培养
D途径：两个核共同分裂形成单倍体胚。
E途径：两个核融合后分裂形成纯合的二倍体。 P-花粉：具有潜在的胚胎发生功能，也称为小花粉 花粉（potential embryogenic pollen) 。
第五章 植物花药和花粉培养
三 单倍体植株形成途径
• 通过胚状体形成单倍体植株 • 通过器官发生（愈伤）形成单倍体植株
两者的异同点：
1、培养目的相同，均获得小孢子植株。
2、花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。
3、花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察
4、雄核发育的全过程；单倍体产量高，但技术更复杂。
再生植株途径有2种：
1、经由愈伤组织器官发生再生植株 2、经由胚状体再生植株
影响花药培养的因素：
养成功。我国1971年水稻花药培养并得到苗
第五章 植物花药和花粉培养
（二）花药培养的基本程序
外植体选择－外植体(花蕾)预处 理—外植体消毒—剥取花药—接种— 诱导培养—分化培养
第五章 植物花药和花粉培养
• 花药预处理（物理、化学）
花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的：
1. 引起花药内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒） 第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分 裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。 2. 引起小孢子的孤立化，花药壁细胞和绒毡层在低温预处 理过程中逐渐解体退化；从而切断与小孢子之间的联系 3. 使小孢子同步分裂，激发花粉产生原胚。 4.提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率
从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是 (1/2)n，而
从常规杂交 F2 代群体中，选择某一基因型的概率为 (1/2)2n ，故单倍
第五章花药和花粉培养
第五章花药和花粉培养一、概况1.概念花粉培养：指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉作为外植体培养，形成花粉胚或愈伤组织，最终发育成花粉植株（单倍体）的技术.花药培养:指应用植物组织培养技术，把花粉发育到一定时期的花药接种到人工培养基上，以改变花药内花粉的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体直接发育成植株或由愈伤组织分化形成植株的培养方式异同点区别: 花药培养属于器官培养范畴，花粉培养属于细胞培养范畴共同点:在培养过程中都是花粉发育，均可获得单倍体细胞系或单倍体植株2.发展概况1964年印度Gula和Maheshwari成功地从毛叶曼陀罗花药培养获得许多胚状体，并证明胚状体直接起源于花粉粒，最终从胚状体进一步发育得到单倍体植株日本、法国、丹麦、德国等相继开展花培研究工作，目前已有10个科，24个属、34个种、250多种高等植物的花药培养获得成功花粉培养始于50年代，Tulecke首先培养银杏的成熟花粉粒得到愈伤组织，随后人们进行了很多研究，在许多植物上进行花粉培养，同时随着培养技术的逐步完善（看护培养、条件培养…)，获得愈伤组织、胚状体、有的还获得单倍体植株我国花培发展概况始于70年代，将花培与传统育种手段相结合，先后培育出一大批具有研究和应用价值的品种。
如烟草、小麦、玉米、甜椒等花培新品系、品种1974年，中科院植物所与山东烟草研究所合作，成功育成烟草新品种，并大面积推广，这是世界上第一个用单倍体方法培养出来的新品种国际公认，我国的花培工作处于国际领先水平。
我国有30多种植物进行花培试验，20多种获得了花粉植株，有一大部分是我国首创，同时在花培方法，机理等方面作了深入研究德著名学者Melchers：“花药培养起始于印度，而首先却在中国广泛应用，就花药培养的单倍体育种的应用而言，中国在世界上处于领先地位”3.意义a.基础理论研究方面研究减数分裂，花粉生长机制的重要方法用来进行生理、生化、遗传等基础理论的研究花粉粒体积小，数量多，形状、内含物成份基本一致，是比较均一的起始材料，便于在人工控制条件下研究它们的生长、分化、遗传等变化过程b.遗传育种=单倍体育种中的意义可获得纯合二倍体，大大缩短育种周期具有选择效率高的优点用于远缘杂交育种，克服杂种不育性便于隐性突变体的筛选，大大提高突变育种的工作效率二、培养方法1.途径愈伤组织再分化形成植株(脱分化到再分化，变异率提高，混倍现象明显取决于培养基中激素的种类、浓度配比) 花粉植株通过胚状体形成植株花粉植株()2.花粉培养优点:不存在体细胞干扰，没有混倍现象缺点:培养技术难度大花粉分离自然散落法：机械挤压法：优点⏹操作简便⏹适于双子叶植株，不适于禾谷类，易损伤花粉粒缺点⏹花粉中易混有体细胞⏹悬浮液中花粉密度不易控制注意：液体培养基中加蔗糖或甘露醇，调节渗透压，避免花粉吸水胀裂三、影响花培成功的因素有些难培养植物诱导频率很低，有些植物（裸子植物）至今没有获得真正的花培植株花药培养虽然是一项成功的技术，但要获得良好的效果，还需克服许多困难诱导植株成功与否以及诱导频率受多种因素影响（一）供试材料1.材料的基因型材料的遗传背景不同，诱导难易程度不同茄科番茄、蔓陀罗、烟草易成功禾本科水稻优于小麦亚种水稻粳亚种(40-80%)优于籼米亚种(2%)花药培养力是可以遗传的，且为显性或超显性2.植株的生理状态和年龄年幼植株花培成功率高开花始期成功率高烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花粉植株烟草开花期第6天，诱导率最高与植株的营养和生长条件有关N饥饿>高N水稻高温，高N下，诱导率下降，白化苗提高3.花粉发育时期——是影响花培成败的最关键因素之一四分体时期单核期---早、中、晚期双核期三核期#不同植物最适诱导期不同曼陀罗、烟草属、水稻---单核早期、双核期均可诱导，以单核中、晚期效果最好小麦、玉米---只有单核中期才能诱导大麦---单核晚期最佳一般采用单核中-晚期的花粉培养不同植物花培的合适花粉发育时期处于单核期的花粉培养最有利于诱导成苗小孢子发育第三期是胚胎形成的临界期，超过了这一时期胚状体就不能形成在小孢子发育过程，花药内激素水平正在不断改变，由于花药的成熟使激素平衡变得不适合，或为花粉发育所必需的其他一些养分已经耗尽，从而影响了诱导率培养前应确定花粉发育时期镜检：醋酸-洋红、I-KI染色（禾本科、茄科）、焙花青-烙矾法（木本、番茄）利用相应的形态学指标对于花培没有成功的植物最好选取花粉发育各个时期的花粉进行培养，确定最佳时期4.材料的预处理——试验证明，有几种预处理方法能有效提高诱导率低温预处理烟草：7-9℃，7-14天番茄：6-8 ℃，8-12天水稻：10℃，2-14天小麦、黑麦：1-3 ℃，2-20天常温下N饥饿预处理乙烯、高糖、离心预处理（二）培养基1.基本培养基MS应用最多，N6、B5、Nitsch也有应用不同植物种类，适用的培养基不同双子叶：Nitsch、MS十字花科、豆科：B5水稻等禾谷类：N62.碳源蔗糖应用最广，既是最好的碳源，又起调节渗透压的作用不同植物种类、不同诱导时期最适碳源浓度不同，通常以2-5%为宜烟草：2%诱导胚状体小麦：8-10%愈伤；5-8%分化水稻：4-6%愈伤；2-3%分化玉米：12-15%愈伤3.激素关键决定于激素种类、浓度、配比实例小麦：2mg/L 2.4-D 愈伤；< 2mg/L 胚状体4.其它添加物有机附加物、水解乳蛋白、水解酪蛋白、酵母提取物、肌醇、谷氨酰胺等活性炭（0.5-1%)吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些杂质吸附了培养基高压灭菌蔗糖产生5-羟甲基糠醛吸附了激素，降低了激素水平（三）培养方法和培养条件1.材料的接种保证完全无菌条件、注意接种密度（104-105粒/ml为好），花药组织分泌的活性物质相互作用有利于诱导密度太高，养分消耗太快；密度太低，诱导率下降。
植物组织培养第五章 花药和花粉培养
殖，它的花粉给不育系授粉，能使不育系当代结实
并在F1代恢复育性正常的品系。是杂交种子的父本。
不育系（母本）×同型保持系（父本） ↓ 不育系（母本）×恢复系（父本） ↓
F1代种子—生产上杂交种子
1、克服后代分离、缩短育种年限 常规育种中，杂交F2代起会出现性状分离，到 F6代才开始选择，育成一个品种需8-10年。单倍 体育种将F1或F2代花药进行培养，对所获得的单 倍体植株进行加倍处理，获得稳定的纯合二倍体， 下一代植株性状基本稳定，育种只需3-5年。
（二）花粉培养
1．取材时期的确定 四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期 小孢子 花粉培养 花粉粒 花药培养
2、花粉预处理
低温处理花蕾，或单核后期离心预处理。
3、花粉分离
适合的花蕾-消毒-取出花药-烧杯壁中挤压花 药-尼龙网过滤-花粉液离心-花粉粒沉淀-培养基 稀释-纯净花粉群体。
C途径：在获得的花粉植株群体中，除单倍 体外，常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍 体、非整倍体等非单倍体植株，即小孢子培养 过程中自发加倍现象。此途径中，生殖核与营 养核共同参与了花粉植株的形成。`Fra bibliotek2、B途径
小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个 大小相近的细胞（或游离核）。以后，由这两个细 胞连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多 核花粉。 （二）雄核发育的启动机理（不讲）
（一）花药培养方法 1、材料的选取
大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的是
单核期或单核中晚期。
花粉的发育时期：
四分体 — 小孢子 — 单核花粉 — 双核花粉
最适期
2、材料与处理与灭菌
3-5℃低温处理3-10天-（大花蕾将萼片剥掉） -酒精几秒-0.1%升汞10min-无菌水冲洗。 3、接种培养 镊子剥去花瓣-花药均匀接种于培养基上，常 用培养基MS、N6和马铃薯培养基。 蔗糖5-10%，20-30℃，光照12h。
植物组织培养第五章花药和花粉培养
`
2、B途径
小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个 大小相近的细胞（或游离核）。以后，由这两个细 胞连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多 核花粉。
体细胞组织分泌出胼胝质到四分体表面，花粉 四分体的胼胝质壁溶解并释放出四个小孢子。此时， 小孢子细胞质浓厚，中央有一细胞核。
当液泡发生时，小孢子体积迅速增加，细胞核 被挤向一边。在第一次有丝分裂时，小孢子核产生 大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核，形成 两个精子，它们处在花粉或花粉管中。小孢子从里 到外被绒毡层、中层、药室内壁和表皮包围着。
二、离体小孢子发育途径
（一）雄核发育途径 离体培养时，尽管雄核发育可在四分体时期和 双核花粉期被诱导，但最适宜诱导的时期是第一次 有丝分裂或之前。小孢子在培养过程中呈现不同的 发育模式。 目前，一般根据小孢子第一次有丝分裂情况将 雄核发育分为A途径（不均等分裂）和B途径（均等 分裂），其中A途径又根据第二次分裂及其以后的情 况细分为A-V途径、A-G途径、A-VG途径（E途径）及 C途径。
第二节 花粉小孢子发育途径
离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始 细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一 次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途径称为 “花粉孢子体发育途径”。
目前，习惯把小孢子或花粉沿孢子体途径发育 成花粉植株的过程称为“雄核发育”。
一、活体小孢子发育途径
花粉发育时期对诱导雄核发育是极其重要的。 花粉母细胞经减数分裂形成四分体，有多种模式， 以四面体和等二面体最普遍。
第5章 花药和花粉培养
第5章花药和花粉培养（3学时）目的要求：(1)掌握花药培养和花粉培养的区别(2)了解花药最佳接种时期(3)掌握花药培养的大致过程(4)掌握花粉发育的四种途径(5)掌握花粉培养的大致过程第一节花药和花粉培养技术花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，产后再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。
一、培养方法（一）花粉发育时期1.适宜的花粉发育时期选择合适的花粉发育时期，是提高花粉植株诱导成功率的重要因素。
被子植物的花粉发育由孢子四分体分散成单核小孢子开始。
2.花粉发育时期的检测压片染色法是检测花粉发育时期的简便有效方法，常用染色剂是醋酸洋红。
（二）培养过程1.花药培养过程（1）材料预处理接种前将采集的花蕾或花序以理化方法处理能提高花粉植株诱导频率。
处理方法有低温、离心、低剂量辐射、化学试剂处理等。
（2）表面消毒因为未开放的花蕾中的花药为花被包裹，本身处于无菌状态，可仅用70％酒精棉球将花的表面擦洗即可。
也可按对其他器官消毒处理方法进行，先用70％的酒精浸一下后，在饱和漂白粉溶液中浸10～20min，或用0.1％升汞液消毒7～lOmin，然后用无菌水洗3～5次。
将花蕾剪下放入水中，在冰箱4～5℃下保持3～4d。
（3）接种接种时把花蕾用解剖刀、镊子小心剥开花蕾，取出花药，注意去掉花丝，然后散落接种到培养基上，一个l0ml的试管可接种20个花药。
培养温度在23～28℃左右，每天11～16h 的光照，光照强度2000～4000Lx。
脱分化培养时，可用MS + 2,4-D的培养基，或N6+2,4-D 的培养基，经10～30d，可诱导生成愈伤组织，或少数生成胚状体。
（4）培养一种植物的花药可以在一种培养基上长幼苗，而在另一种培养基上则形成愈伤组织。
如水稻通常在含有生长素的培养基上诱导出愈伤组织，而在不含任何激素的N6培养基上长出胚状体。
修改第五章花药与花粉培养ppt课件
二、花药和花粉培养的意义 作物单倍体只具有单套染色体组，本身没有或很少有育
种价值，但经染色体加倍成为双倍体后，与常规育种有机结合， 就会显示出巨大的优势。而作物单倍体尤其是双单倍体与分子 生物学、基因工程的密切结合，可使作物育种发生革命性的变 化。
(一) 作物育种能迅速获得纯合体 (二)物种进化研究 （三）体细胞融合 (四)遗传分析 (五)分子生物学研究 (六)植物基因克隆筛选
（二）预处理 适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。
常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度 因物种而异： 烟草7～9℃，7～14 天； 水稻7～10℃，10～15 天； 黑麦1～3℃，7～14 天； 大麦3-7℃，7～14天。
但低温预处理对小麦效果不稳定，有时还有负效果。
(三) 材料灭菌 在无菌条件下，先将花蕾用70%酒精浸泡30秒左右，
(二)不对称发育途径 同自然情况一样，小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，
在花粉内形成一个较大的营养核和一个较小的生殖核。根据 两个核进一步发育状况，该途径又分为生殖细胞发育途径、 营养细胞发育途径、营养细胞和生殖细胞并发发育途径3种：
1、生殖细胞发育途径 营养细胞经几次分裂后便停止分裂，由生殖细胞继续分裂，
形成多细胞的(或称多核)花粉，进一步发育形成愈伤组织或胚状体 2、营养细胞发育途径。
生殖细胞经几次分裂后便停止分裂，由营养细胞继续分裂， 形成多细胞的(或称多核)花粉，进一步发育形成愈伤组织或胚状体 3、营养细胞和生殖细胞并发发育途径。
营养细胞和生殖细胞分别进行分裂，形成多细胞的(或称多 核)花粉，进一步发育形成愈伤组织或胚状体。
花药培养一般是先暗培养，待愈伤组织形成后，再转入光 照条件下培养，促进器官分化。光照时间和培养温度因培养材料 而异。
5 第五章植物花药和花粉培养
新鲜培养基
花粉
花粉
花粉愈 伤组织 团
3.移栽驯化
方法同其他试管苗移栽方法。
4.白化苗现象
白化苗现象严重制约着其花粉培养在单倍
体育种中的应用。 1）白化花粉植株的亚微结构特征
细胞中有微核和原质体，但质体发育中途停 止，在质体中缺少核糖核蛋白体和叶绿体，并 出现染色体断片。 生殖生长和雌核均不正常，不能完成有性世代和 产生种子。
7）花药壁的作用
正向作用和负面作用： 花药壁内源生长素梯度在花粉粒胚的 发育过程中起重要作用。 花药损伤释放的有毒物质对花粉培养 有害。
四、单倍体植株鉴定和染色体加倍 （一）单倍体植株鉴定
1.染色体直接计数法：
根尖和茎尖等细胞分裂旺盛处的 细胞染色体直接计数。
2.间接鉴定
（1）流式细胞仪（扫描细胞光度仪） （2）细胞形态学鉴定； （3）植株形态学鉴定； （4）高/低温胁迫法； （5）杂交鉴定法；自交和测交鉴定 （6）标记鉴定法：生化和分子标记两种。
高低温处理
低温预处理、低温后处理以 及热击处理。饥饿状态
低温预处理的作用机理：
①预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变
了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的发育方向，
进而形成愈伤组织或胚状体。 ②提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了 诱导率。 ③引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因 为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐 渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。
化学物质处理
高糖：接种前用高糖预处理花药一定时间， 再转移到适宜的糖浓度下培养 ，可大幅度提 高愈伤组织和胚状体的诱导率。
甘露醇：
秋水仙素
A细胞工程第4节—植物花粉和花药培养2 79页
二、植物花药/花粉培养历史
Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养 Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养）
花粉发育时期的确定
处于不同发育阶段的烟草花芽
对不同发育阶段的花药 进行培养测试
确定最佳小孢子发育时 期的形态特征
注意形态特征会因品种、 发育状态、环境条件的 变化而发生变化
单核期的确定：
根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始 积累淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用 醋酸洋红或碘化钾染色，再压片镜检，以确定 花粉的发育时期。
植物组织培养
第五章 花药和花粉培养
大 家 好 ！
第5章 花药和花粉培养
第五章 花药和花粉培养
本章主要内容：
花粉和花药培养的概念和应用 花粉小孢子发育途径 花粉和花药培养方法 单倍体植株鉴定和染色体加倍
第一节 花粉和花药培养的概念和应用
花粉和花药培养的概念 花药和花粉培养的历史 花粉和花药培养的应用
2）在无菌条件下，将一小块（ 1cm3）活跃生长的愈伤组织接 种到培养基上，再在愈伤组织 块上放一片（1cm²）已灭菌的 滤纸，放置过夜。
3）将分离的花粉接种到已经充分 吸收愈伤组织渗透液的滤纸上。
4）单细胞分裂形成肉眼可见的小 细胞团后，即转移到新鲜培养 基上培养，恒温培养，得到单 细胞无性系。
看护培养图解
胚状体发育途径
a) 球形胚
芸苔属小孢子培养
d) 鱼雷形胚
愈伤组织发育途径
接种在平板上的水稻花药
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较 为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm，颖片 淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。
陈传红 制作
2007 / 5
水稻花药培养操作过程
旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍
左手持穗，右 手用镊子取出 花药，无菌培 养皿中
第五章 植物花药和花粉培养
陈传红 制作
2007 / 5
• 本章内容提要：
一、概念 二、花粉和花药培养技术 三、花粉和花药培养应用
陈传红 制作
2007 / 5
1、概念
•单倍体细胞(haploid cell)：植物的花粉是花粉母细 胞经减数分裂形成的，其染色体数只有体细胞的一半。 •花粉和花药的培养(pollen and anther culture)： 指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精 而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技 术。
4.花药培养与单倍体育种
花药培养的主要目的：
• 培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为 育种材料的来源。
• 利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基 因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出 有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者 直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。 • 构建永久性分离群体－双单倍体系（Doubled haploid)，用于基因定位。
陈传红 制作
2007 / 5
7、 图示花药培养过程
花药材料的选取
关键选取处于合适发育期的花 药，离体培养后才能启动花粉发育。 实践表明，从减数分裂期至双核期 的花药，均有可能诱导离体孤雄发 育。 大多数园艺植物的花药培养，成 功率最高的时期为min， 无菌水洗一次。
70％酒精 手洗两遍
用接种环接种 到培养基上
陈传红 制作
2007 / 5
培养5天后，花药变黑褐色，20天花 药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织， 先形成芽，后长出根，形成幼苗。
选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝 的花蕾发育良好，数量大，发育同步。
单倍体植株的二倍化
花粉植株染色体可自发加倍；人工措施染色
体加倍。 传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋 水仙素溶液处理单倍体植株，时间为24-96 h。
浸泡试管苗方法、处理芽方法、浸根方法
陈传红 制作
2007 / 5
花药培养脱毒
•1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； •花药采取时期 单核期：花蕾4-6mm，花药1mm •花药诱导愈伤组织培养基 MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L •增殖培养基 MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L •生根培养基 1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L
各种植物要求预处理的温度和时间不同。
陈传红 制作
2007 / 5
培养温度是影响花药反应的一个重要因素。
小麦要求先高温培养64天之后，再转入28-30℃ 下培养。一直高温培养效果并不好。
较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织， 但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培养 温度仍是减少白化苗的一个有效措施。
③ 在培养基中加入活性炭能促进花药培养
陈传红 制作
2007 / 5
4） 低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率
以1-5℃预低温处理小麦幼穗，能提高花粉 愈伤组织的产量。在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预 处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温 对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。
3、花药培养发展简史
1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成 胚； 1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；
1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株； 目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导 成植株。
陈传红 制作
2007 / 5
陈传红 制作
2007 / 5
① 培养基中的植物生长物质种类会影响花粉 发育的途径 • 一般在禾本科植物中，常用1-5mg/L 2,4-D或 NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转 移至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物 质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植 株形成。
陈传红 制作
2007 / 5
大大缩短育种周期
陈传红 制作
2007 / 5
5、花药培养技术
确定取材时间
选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期 和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此 利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确 定花粉发育的准确时期。
•单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使 花粉发育成一个完整的植株。
陈传红 制作
2007 / 5
2、花粉和花药培意义
诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育 种周期； 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。 获得无病毒个体。
陈传红 制作
2007 / 5
•我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进， 研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大 幅度提高。N6培养基的特点是铵离子浓度较低。 •随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物 素，研制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦 的花药出愈率。 •马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广 泛地应用于小麦花药培养，效果良好。
陈传红 制作
2007 / 5
2）花药供体植株的生长条件对花药培养反 应的影响是很大的。
水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗 比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提 高。同步化程度高。
陈传红 制作
2007 / 5
3） 培养基是花粉启动和再分化的重要条件
6、影响花药诱导频率的因素
1） 花粉发育时期是影响培养效果的重要因素。
在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径 发育成花粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育 时期不同，对多数植物来说，单核中期或晚期的花 粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。
如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次 有丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大 麦)或单核中期(玉米、小麦)反应最好，番茄在减数 分裂中期时更适宜。
陈传红 制作
2007 / 5
作业：
• 1、试论述花药培养的意义。
• 2、详细论述花药培养方法。
陈传红 制作
2007 / 5
陈传红 制作
2007 / 5
花粉培养过程
低温预处理
消毒
取下花蕾（镜检） 选幼年树花蕾 接种
取花药
预培养数天
分离 花粉 过滤离心 再生
药壁向花粉提供营养物质； 通过药壁吸收、贮存和转化 培养基中的外源物质
陈传红 制作
2007 / 5
陈传红 制作
2007 / 5
② 糖种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响。
• 朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以 0.21 mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖， 小麦花粉胚的诱导频率可增加2-10倍。 • 一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对 花粉的生长无妨碍。 • 烟草的最适蔗糖浓度为3％，水稻为3％-6％，玉米 则为12％-15％。
操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤， 则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二 倍体的愈伤组织。
陈传红 制作
2007 / 5
花药培养的条件： 光照(12~18h，5,000~10,000 lx，28℃)
黑暗(12-16h，22℃)周期交替进行。
陈传红 制作
2007 / 5